專利名稱:新羰基還原酶、其基因及它們的使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有不對稱地還原由下面式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮 以產(chǎn)生由下面式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇 的活性的多肽(羰基還原酶)，其中該多肽分離自具有所述活性的微生物；編碼該多肽的DNA；含有該DNA的載體，及用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
本發(fā)明還涉及使用所述多肽或轉(zhuǎn)化體制備光學(xué)活性醇，特別是由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇是一種作為藥劑等的合成起始原料有用的化合物。
背景技術(shù)：
作為(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的制備方法，已知的一種方法包括用還原劑例如硼氫化鈉等化學(xué)地還原氨基被保護(hù)的(3S)-1-鹵-3-氨基-4-苯基-2-丁酮衍生物(專利文獻(xiàn)1，非專利文獻(xiàn)1)。但是，這種方法需要相對昂貴的還原劑，而且其立體選擇性從實(shí)用上說是不足的。
另外，作為使用微生物的方法，已知的一種方法包括使屬于假絲酵母(Candida)屬的微生物等作用于(3S)-1-鹵-3-氨基-4-苯基-2-丁酮衍生物以產(chǎn)生(2R，3S)-1-鹵-3-氨基-4-苯基-2-丁醇衍生物(專利文獻(xiàn)2)，已知另一種方法包括使屬于紅球菌屬(Rhodococcus)的微生物等與(3S)-1-鹵-2-氧-3-被保護(hù)的氨基-4-取代的丁烷接觸，以產(chǎn)生(2R，3S)-1-鹵-2-羥基-3-被保護(hù)的氨基-4-取代的丁烷(專利文獻(xiàn)3，非專利文獻(xiàn)2)。但是，使用這些方法，反應(yīng)混合物中可積累的產(chǎn)物濃度從實(shí)用上來說是不足的。
專利文獻(xiàn)1JP-A-2-42048專利文獻(xiàn)2JP-A-9-285專利文獻(xiàn)3WO2002/014528非專利文獻(xiàn)1Tetrahedron，50，6333(1994)非專利文獻(xiàn)2TetrahedronAsymmetry，14，3105(2003)。
發(fā)明的公開本發(fā)明要解決的問題考慮到上面所述，本發(fā)明旨在提供用于生產(chǎn)(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的多肽，編碼該多肽的DNA，含有該DNA的載體，和用該載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化體。
另外，本發(fā)明旨在提供使用所述多肽或轉(zhuǎn)化體高效地制備多種光學(xué)活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
解決問題的手段本發(fā)明人從具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的微生物中分離了具有該活性的多肽。而且，他們成功地闡明了編碼該多肽的DNA的堿基序列，并使用該序列生成了大量產(chǎn)生該多肽的轉(zhuǎn)化體。另外，他們還發(fā)現(xiàn)通過使用該多肽或轉(zhuǎn)化體能夠高效地生產(chǎn)光學(xué)活性醇，例如(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，由此完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明涉及具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
此外，本發(fā)明提供編碼該多肽的DNA。另外，本發(fā)明還提供含有該DNA的載體。此外，本發(fā)明還提供含有該載體的轉(zhuǎn)化體。另外，本發(fā)明還提供使用所述或轉(zhuǎn)化體制備光學(xué)活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的方法。
發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可以提供制備有用的光學(xué)活性醇，包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的實(shí)用的方法。
圖1顯示重組載體pNTOM4G1的制備方法和結(jié)構(gòu)。
發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式下面詳細(xì)地說明本發(fā)明。
本說明書中描述的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮可以通過例如JP-A-62-126158或JP-A-2-42048中公開的方法來制備。另外，除非另有說明，本發(fā)明中所述的DNA的分離、質(zhì)粒的制備、基因操作例如轉(zhuǎn)化等，可根據(jù)Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)等書中描述的方法來進(jìn)行。而且，除非另有說明，本說明書的描述中所用的“％”指“％(w/v)”。
本發(fā)明的多肽是具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。這種多肽可以從具有所述活性的微生物中分離。
作為本發(fā)明的多肽的來源的微生物沒有具體限制，例如，可以使用屬于Ogataea屬的酵母。特別優(yōu)選Ogataea minuta var.minuta，NBRC0975菌株。該微生物可以從國立制品評價技術(shù)局生物技術(shù)本部生物遺傳資源部門(NBRC，2-5-8 Kazusakamatari Kisarazu-shi 292-0818，Chiba Japan)獲取。
培養(yǎng)作為本發(fā)明的多肽的來源的微生物的培養(yǎng)基可以使用包含碳源、氮源、無機(jī)鹽、有機(jī)營養(yǎng)物等的一般液體營養(yǎng)培養(yǎng)基，只要該微生物能生長。
本發(fā)明的多肽可以通過合適地組合一般公知的蛋白純化方法從作為該多肽來源的微生物中分離。例如，分離可如下述進(jìn)行。
首先，在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)微生物，再通過離心或過濾從培養(yǎng)基(cultured medium)中收集細(xì)胞。通過物理手段用超聲破碎器(ultrasonicdisintegrator)、玻璃珠等破碎所得的細(xì)胞，然后通過離心去除細(xì)胞碎片而得到無細(xì)胞的提取物。然后，通過單獨(dú)或組合例如鹽析(salt-out)(硫酸銨沉淀，磷酸鈉沉淀等)、溶劑沉淀(通過丙酮、乙醇等分級沉淀蛋白質(zhì))、透析、凝膠過濾色譜、離子交換色譜、反相色譜、超濾等的方法，從無細(xì)胞的提取物中分離本發(fā)明的多肽。
還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的活性的測定，可以通過例如下列步驟在含0.33％(v/v)二甲亞砜的100mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中加入0.2mM底物(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，0.25mM輔酶NADPH，以及粗酶，使該混合物在30℃反應(yīng)1分鐘，由反應(yīng)后340nm波長的吸光度的下降速率來計算所述活性。
另外，由上述反應(yīng)生成的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的絕對構(gòu)型的確定和非對映體過量(diastereomeric excess)的測量可以通過高效液相色譜來進(jìn)行(柱子COSMOSIL 5C8-MS(4.6mm×250mm；由NacalaiTesque生產(chǎn))，洗脫液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；檢測210nm)。
本發(fā)明的DNA是編碼上述的本發(fā)明的多肽的DNA，而且只要能在根據(jù)下面敘述的方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中表達(dá)該多肽，其可以是任何DNA，并可以包含任何非翻譯的區(qū)域。一旦能夠獲得多肽，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員即可以通過已知的方法從作為該多肽來源的微生物中獲得這樣的DNA。例如，可以用下面的方法獲得。
首先，用合適的內(nèi)肽酶消化本發(fā)明的分離的多肽，并通過反相HPLC將所得的肽片段分級。然后，例如，使用ABI492蛋白質(zhì)測序儀(由AppliedBiosystems制造)測定所述肽片段的部分或全部氨基酸序列。
根據(jù)這樣獲得的氨基酸序列的信息，合成用于擴(kuò)增編碼所述多肽的DNA的一部分的PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))引物。然后，通過一般的DNA分離方法，例如Visser的方法等(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，415(2000))制備作為所述多肽來源的微生物的染色體DNA。使用該染色體DNA作為模板以及上述的PCR引物進(jìn)行PCR來擴(kuò)增編碼所述多肽的DNA的一部分，并測定其堿基序列。堿基序列可以用例如ABI373 DNA測序儀(由Applied Biosystems制造)等來測定。
一旦清楚了編碼所述多肽的DNA的一部分堿基序列，就可以通過例如i-PCR(Nucl.Acids Res.，16，8186(1988))來測定全長序列。
以這種方式獲得的本發(fā)明的DNA的例子包括含有SEQ ID NO1所示的堿基序列的DNA和含有SEQ ID NO2所示的堿基序列的DNA。此外，本發(fā)明的DNA還涵蓋在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA雜交的DNA，其編碼具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
所述在嚴(yán)緊條件下與由SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA雜交的DNA是指當(dāng)進(jìn)行菌落雜交方法、噬菌斑雜交方法、Southern雜交方法等時，與具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列的DNA特異性地形成雜交體的DNA。
本文所用的嚴(yán)緊條件是指例如在65℃，在75mM檸檬酸三鈉，750mM氯化鈉，0.5％十二烷基硫酸鈉，0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％Ficoll 400(由Amersham Biosciences制造)的組合物的水溶液中進(jìn)行雜交，然后在60℃，用15mM檸檬酸三鈉150mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的組合物的水溶液洗滌的條件。優(yōu)選地，它們指在上述條件下雜交后，在65℃，用15mM檸檬酸三鈉，150mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的組合物的水溶液進(jìn)行洗滌的條件。更優(yōu)選地，它們指在以與上述相同的方式雜交后，在65℃，用1.5mM檸檬酸三鈉，15mM氯化鈉和0.1％十二烷基硫酸鈉的組合物的水溶液進(jìn)行洗滌的條件。
本發(fā)明的多肽的例子包括由SEQ ID NO1所示堿基序列編碼的、具有SEQ ID NO3所示氨基酸序列的多肽，和由SEQ ID NO2所示堿基序列編碼的、具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽。
此外，與這兩種多肽的任一種顯示至少一定水平的同源性，并具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽，在功能上等價于上述兩種多肽，并包括在本發(fā)明中。
如本文中所用的，序列的同源性是通過，例如當(dāng)使用同源性搜索程序FASTA(W.R.Pearson和D.J.Lipman；Pro.Natl.Acad.Sci.USA，85，2444-2448(1988))比較性分析兩個氨基酸序列時，相對于全部序列的同一性(identity)的值來表示的。與SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示的多肽等價的多肽的例子，包括與這兩種多肽的任一種顯示不少于78％(SEQ ID NO3所示的多肽和SEQ ID NO4所示的多肽之間的同源性是78％)，優(yōu)選不少于80％，更優(yōu)選不少于85％，還更優(yōu)選不少于90％的同源性的多肽。
這樣的多肽可以，例如，通過將DNA連接到合適的載體中，并將載體導(dǎo)入合適宿主細(xì)胞中以讓其表達(dá)而得到，其中所述DNA在嚴(yán)緊條件下可以與由上述SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA雜交。另外，這樣的多肽可以通過，例如，根據(jù)Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.，1989)等中所述的已知的方法，在具有SEQ ID NO3或SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽中造成氨基酸的取代、插入、缺失或添加而得到。
通過后一方法得到的多肽的例子包括在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中，用甘氨酸取代第42位的丙氨酸、用丙氨酸取代第43位的谷氨酸、用谷氨酸取代第46位的賴氨酸、和/或用賴氨酸取代第49位的天冬酰胺而得到的多肽。具有所有這4種突變的多肽(突變體多肽1)在SEQ ID NO16中顯示，編碼該多肽(突變體多肽1)的DNA在SEQ ID NO15中顯示。
用于將本發(fā)明的DNA導(dǎo)入到宿主微生物，以使DNA在該宿主微生物中表達(dá)的載體沒有具體的限制，只要該DNA能夠在合適的宿主微生物中表達(dá)編碼基因。這樣的載體的例子包括質(zhì)粒載體，噬菌體載體，黏粒(cosmid)載體等。另外，還可以使用能夠與其他宿主細(xì)胞交換基因的穿梭載體。
這樣的載體一般含有調(diào)控因子(regulator)，例如lacUV5啟動子，trp啟動子，trc啟動子，tac啟動子，lpp啟動子，tufB啟動子，recA啟動子，pL啟動子等，而且還可優(yōu)選地用作含有與本發(fā)明的DNA可操作地連接的表達(dá)單元的表達(dá)載體。例如，可以優(yōu)選地使用pUCNT(WO94/03613)。
本說明書中所用的術(shù)語“調(diào)控因子”指具有功能性啟動子和任何相關(guān)的轉(zhuǎn)錄元件(例如增強(qiáng)子，CCAAT盒，TATA盒，SPI部分等)的堿基序列。
本說明書中所用的術(shù)語“可操作地連接”是指在宿主細(xì)胞中，控制基因表達(dá)的不同的調(diào)控元件例如啟動子、增強(qiáng)子等，與基因以可操作的狀態(tài)連接。對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言所熟知的是，調(diào)控因子的類型和種類可能依據(jù)宿主而變化。
本發(fā)明的表達(dá)載體的例子包括后面所述的pNTOM3，其中SEQ ID NO1所示的DNA已被導(dǎo)入pUCNT；pNTOM4，其中SEQ ID NO2所示的DNA已被導(dǎo)入pUCNT；及pNTOM5，其中SEQ ID NO15所示的DNA已被導(dǎo)入pUCNT，等等。
作為其中導(dǎo)入了含有本發(fā)明的DNA的載體的宿主細(xì)胞，可以使用細(xì)菌、酵母、絲狀菌(filamentous bacterium)、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞等等。由于導(dǎo)入和/或培養(yǎng)容易，細(xì)菌是優(yōu)選的，且特別優(yōu)選大腸桿菌(Escherichia coli)。含有本發(fā)明的DNA的載體可以通過已知的方法導(dǎo)入宿主細(xì)胞。當(dāng)使用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞時，例如商業(yè)上可獲得的大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARA BIO生產(chǎn))可以用于將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體的例子包括后面所述的大腸桿菌HB101(pNTMO3)FERM BP-10368，其中上述pNTMO3已被導(dǎo)入大腸桿菌HB101；大腸桿菌HB101(pNTMO4)FERM BP-10369，其中上述pNTMO4已被導(dǎo)入大腸桿菌HB101；及大腸桿菌HB101(pNTMO5)FERM BP-10370，其中上述pNTMO5已被導(dǎo)入大腸桿菌HB101，等等。這些轉(zhuǎn)化體已經(jīng)分別以上述的登錄號被保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(IPODCentral 6，1-1-1，Higashi，Tsukuba，Ibaraki，305-8566日本)(在日本的原保藏日為2004年6月3日，國家保藏菌株已根據(jù)布達(dá)佩斯條約于2005年7月6日轉(zhuǎn)為國際保藏)。
當(dāng)使用本發(fā)明的多肽不對稱地還原具有羰基的化合物以產(chǎn)生光學(xué)活性醇時，需要輔酶例如NADH、NADPH等。但是，通過在同時存在可將氧化的輔酶轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原形式(以下稱其為輔酶再生能力)的多肽、作為多肽底物的化合物和本發(fā)明的多肽的條件下進(jìn)行反應(yīng)，可以顯著地減少所使用的昂貴的輔酶的量。
作為具有輔酶再生能力的多肽，可使用例如氫化酶、甲酸脫氫酶、醇脫氫酶、醛脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶等。優(yōu)選使用葡萄糖脫氫酶。
如下可以使用本發(fā)明的多肽制備光學(xué)活性醇。首先，將作為底物的具有羰基的化合物、輔酶例如NADPH等，以及所述多肽加入合適的溶劑，并在調(diào)節(jié)的pH下攪拌該混合物以進(jìn)行反應(yīng)。當(dāng)組合使用本發(fā)明的多肽和具有輔酶再生能力的多肽進(jìn)行反應(yīng)時，將具有輔酶再生能力的多肽(例如葡萄糖脫氫酶)和作為其底物的化合物(例如葡萄糖)進(jìn)一步添加到上述反應(yīng)組合物中。
可以使用水性溶劑進(jìn)行反應(yīng)，或者可以使用水性溶劑和有機(jī)溶劑的混合物進(jìn)行反應(yīng)。有機(jī)溶劑的例子包括甲苯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、己烷、異丙醇、二異丙基醚、甲醇、丙酮、二甲亞砜等。反應(yīng)在10℃到70℃的溫度下進(jìn)行，且反應(yīng)混合物的pH保持在4-10?？梢酝ㄟ^分批的過程或連續(xù)的過程來進(jìn)行反應(yīng)。對于分批過程，反應(yīng)底物以0.1％到70％(w/v)的進(jìn)料濃度加入。作為底物的具有羰基的化合物的例子包括(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮。但是只要該化合物能夠在上述反應(yīng)條件下被還原并轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈱W(xué)活性醇，對其沒有具體限制。
即使當(dāng)使用含有編碼所述多肽的DNA的轉(zhuǎn)化體或者其處理過的產(chǎn)物來代替本發(fā)明的多肽時，也可以類似地進(jìn)行反應(yīng)。而且，即使當(dāng)使用既含有編碼本發(fā)明的多肽的DNA，又含有編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化體或者其處理過的產(chǎn)物時，也可以類似地進(jìn)行反應(yīng)?！稗D(zhuǎn)化體的處理過的產(chǎn)物”是指，例如，用表面活性劑或有機(jī)溶劑處理過的細(xì)胞，干燥的細(xì)胞，破碎的細(xì)胞，細(xì)胞的粗提取物等，以及用已知的手段固定的那些。
具體地，當(dāng)使用同時含有編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化體，或者其處理過的產(chǎn)物時，不需要單獨(dú)制備和添加用于再生輔酶的酶，且可以高效率地生產(chǎn)光學(xué)活性醇。
同時含有編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化體可通過下述來獲得將編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA摻入到單個載體中，并將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，或者將這兩種DNA分別摻入到屬于不同的不相容的組的兩種載體中，并將這兩種載體導(dǎo)入單個宿主細(xì)胞中。
同時摻入編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的載體的例子包括pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1，其中來自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脫氫酶基因已被導(dǎo)入上述各個表達(dá)載體pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5等。同時含有編碼本發(fā)明的多肽的DNA和編碼具有輔酶再生能力的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化體的例子包括大腸桿菌HB101(pNTMO3G1)、大腸桿菌HB101(pNTMO4G1)和大腸桿菌HB101(pNTMO5G1)，其中大腸桿菌HB101已經(jīng)用這些載體所轉(zhuǎn)化，等等。
轉(zhuǎn)化體中具有輔酶再生能力的多肽的活性可以用常規(guī)方法來測定。例如，當(dāng)在1M Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)中加入100mM葡萄糖，2mM輔酶NADP或NAD，及所述酶，并將混合物在25℃下反應(yīng)1min時，可由340nm波長處吸光度的增加速率計算葡萄糖脫氫酶的活性。
含有編碼本發(fā)明的多肽的DNA的轉(zhuǎn)化體可以在含有碳源、氮源、無機(jī)鹽、有機(jī)營養(yǎng)物等的常規(guī)液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，只要其能生長。
反應(yīng)所得的光學(xué)活性醇可以用常規(guī)方法純化。例如，當(dāng)反應(yīng)所得的光學(xué)活性醇是(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇時，用有機(jī)溶劑例如乙酸乙酯、甲苯等提取反應(yīng)混合物，然后減壓蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑。另外，它可以通過如結(jié)晶析出(crystal precipitation)、色譜等處理來純化。
(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮和(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的定量，以及(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的非對映體過量的測量可使用高效液相色譜(柱子COSMOSIL5C8-MS(4.6mm×250mm；由Nacalai Tesque生產(chǎn))，洗脫液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；檢測210nm)。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明，可以高效率地制備本發(fā)明的多肽，而且，使用該多肽，可以提供多種有用的光學(xué)活性醇包括(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的優(yōu)異的制備方法。
實(shí)施例本發(fā)明在下面的實(shí)施例中得到詳細(xì)的說明，這些實(shí)施例不應(yīng)被理解為限制性的。下面的實(shí)施例中所用的與重組DNA技術(shù)相關(guān)的具體操作方法等描述于下面的書籍中Molecular Cloning第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)，Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates andWiley-Interscience)實(shí)施例1 多肽的純化根據(jù)下面所述的方法，從Ogataea minuta var.minuta NBRC0975菌株中分離并純化了具有不對稱地還原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。除非另有說明，純化是在4℃下進(jìn)行的。
通過下述測定對于(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的還原活性在含有0.33％(v/v)二甲亞砜的100mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中溶解底物[(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮]至終濃度0.2mM及輔酶NADPH至終濃度0.25mM，再加入粗酶溶液，在30℃進(jìn)行反應(yīng)1min，并由反應(yīng)混合物在340nm波長處的吸光度的減少速率來計算所述還原活性。在所述反應(yīng)條件下經(jīng)過1分鐘將1μmol NADPH氧化為NADP的活性定義為1個單位。
(微生物的培養(yǎng))將含葡萄糖5％，聚胨0.5％，酵母提取物0.1％，磷酸氫二鉀0.1％，磷酸二氫鉀0.2％和七水合硫酸鎂0.02％的液體培養(yǎng)基(18L)(pH 6.5)制備于30L釜式發(fā)酵罐(jar-fermentor)(由B.E.Marubishi Co.，Ltd制造)中，并在120℃用蒸汽滅菌20min。
向該培養(yǎng)基中接入180ml預(yù)先在相同的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)的Ogataeaminuta var minuta NBRC0975菌株的培養(yǎng)基，然后在250rpm攪拌、5.0NL/min通氣量和28℃的條件下將混合物培養(yǎng)48小時。
(無細(xì)胞提取物的制備)通過離心從上述培養(yǎng)基中收集細(xì)胞，并用2000ml的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)洗滌，以得到907g該菌株的細(xì)胞。在1800ml的含0.1mM二硫蘇糖醇(DTT)的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中重懸這些細(xì)胞，并用UH-600超聲分散器(由SMT制造)破碎細(xì)胞。通過離心從破碎物中去除細(xì)胞碎片以得到無細(xì)胞提取物。
(硫酸銨分級)用氨水將上述得到的無細(xì)胞提取物的pH調(diào)節(jié)到7.5，加入硫酸銨并溶解到40％飽和度同時保持pH，然后通過離心除去得到的沉淀。以和上述相同的方式向上清中再加入硫酸銨并溶解到60％飽和度，同時保持在pH 7.5，并通過離心收集得到的沉淀。將沉淀溶解在含0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中，并對相同的緩沖液透析過夜以得到活性級分。
(DEAE-Sephacel柱色譜)將通過硫酸銨分級得到的活性級分上樣到預(yù)先用含0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡的DEAE-Sephacel(由Amersham Biosciences制造)柱(29×290mm)上，以使活性級分吸附。用相同的緩沖液洗滌柱子后，用氯化鈉線性梯度(0M到1M)洗脫活性級分。收集活性級分并對相同緩沖液透析過夜。
(MonoQ HR柱色譜)將由DEAE-Sephacel柱色譜得到的活性級分上樣到預(yù)先用含0.1mMDTT的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡的Mono Q HR 10/10柱(由Amersham Biosciences制造)上，以使活性級分吸附。用相同的緩沖液洗滌柱子后，用氯化鈉線性梯度(0M到1M)洗脫活性級分。收集活性級分并對相同緩沖液透析過夜。
(Phenyl-Superose柱色譜)將氯化鈉溶于通過MonoQ HR柱色譜所得的活性級分中至終濃度4M，再將該溶液上樣到預(yù)先用含4M氯化鈉和0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡的Phenyl-Superose HR 10/10柱(由Amersham Biosciences制造)上，以使活性級分吸附。用相同的緩沖液洗滌柱子后，用氯化鈉線性梯度(4M到0M)洗脫活性級分。收集活性級分并對含0.1mM DTT的10mMTris-HCl緩沖液(pH 7.5)透析過夜。
(MonoQ HR柱色譜)將通過Phenyl-Superose柱色譜得到的活性級分上樣到預(yù)先用含0.1mMDTT的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡的Mono Q HR 5/5柱(由Amersham Biosciences制造)上，以使活性級分吸附。用相同的緩沖液洗滌柱子后，用氯化鈉線性梯度(0M到1M)洗脫活性級分。收集活性級分并用Centricon YM-10(由Millipore生產(chǎn))濃縮。
(凝膠過濾色譜)將通過上述MonoQ HR柱色譜得到的活性級分上樣到預(yù)先用含0.2M氯化鈉和0.1mM DTT的10mM Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)平衡的Superdex 200HR 10/30柱(由Amersham Biosciences制造)上，并用相同的緩沖液以0.5ml/min的流速洗脫活性級分。收集活性級分并用Centricon YM-10(由Millipore生產(chǎn))濃縮。再將其上樣到預(yù)先用相同緩沖液平衡的Superdex 200 HR 10/30柱(由Amersham Biosciences制造)上，并用相同的緩沖液以0.5ml/min的流速洗脫活性級分。收集活性級分并用作所述多肽的純化標(biāo)準(zhǔn)樣品。
(實(shí)施例2)基因克降(PCR引物的制備)
使實(shí)施例1中所得的純化多肽在8M脲存在下變性，然后用源自無色桿菌屬(Achromobacter)的賴氨酰內(nèi)肽酶(由Wako Pure Chemical Industries，Ltd制備)消化。然后，通過ABI492蛋白質(zhì)測序儀(由Perkin Elmer制造)測定所得的肽片段的氨基酸序列。根據(jù)從該氨基酸序列推測的DNA序列，合成了引物15’-acngtntayttyathgcngg-3’(SEQ ID NO5)和引物25’-atnggdatrtcraaytgrtc-3’(SEQ ID NO6)，用來通過PCR擴(kuò)增編碼該多肽的基因的一部分。
(通過PCR擴(kuò)增基因)從以與實(shí)施例1相同的方式培養(yǎng)的Ogataea minuta var.minutaNBRC0975菌株的細(xì)胞中，根據(jù)Visser的方法(Appl.Microbiol.Biotechnol.，53，415(2000))等提取染色體DNA。用上面制備的DNA引物1和2并使用所得的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果，擴(kuò)增了被認(rèn)為是目標(biāo)基因的一部分的約700bp的DNA片段。用TaKaRa Ex Taq(由TAKARA BIO制造)作為DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其中反應(yīng)條件遵照其指導(dǎo)手冊。將該DNA片段克隆到質(zhì)粒pT7Blue T-載體(由Novagen制造)，并用ABI PRISM染料終止物循環(huán)測序即用反應(yīng)試劑盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit)(由Perkin Elmer制造)和ABI 373A DNA測序儀(由Perkin Elmer制造)分析其堿基序列。PCR的結(jié)果顯示，擴(kuò)增了具有不同堿基序列的兩種DNA片段。其堿基序列在SEQ ID NO7和SEQ ID NO8中顯示。
(通過i-PCR鑒定目標(biāo)基因的全長序列)用限制酶XbaI完全消化上面制備的Ogataea minuta var.minutaNBRC0975菌株的染色體DNA，用T4連接酶使所得的DNA片段的混合物分子內(nèi)環(huán)化。使用其為模板，通過i-PCR(Nucl.Acids Res.，16，8186(1988))確定了含有上述SEQ ID NO7所示的堿基序列的基因的全長堿基序列。結(jié)果在SEQ ID NO1中顯示。使用TaKaRa LA Taq(由TAKARA BIO制造)作為DNA聚合酶進(jìn)行i-PCR，其中反應(yīng)條件根據(jù)其指導(dǎo)手冊。通過類似的操作還確定了含有上述SEQ ID NO8所示的堿基序列的基因的全長堿基序列，其結(jié)果在SEQ ID NO2中顯示。另外，由SEQ ID NO1所示的堿基序列編碼的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO3中，由SEQ ID NO2所示的堿基序列編碼的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO4中。
(實(shí)施例3)表達(dá)載體的構(gòu)建使用引物35’-gtgcatatgaccaagactgtttatttca-3’(SEQ ID NO9)和引物45’-gtcgaattcttattaaaatggaatgtcgaa-3’(SEQ ID NO10)，并以實(shí)施例2中得到的Ogataea minuta var.minuta NBRC0975菌株的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR。結(jié)果得到了這樣的雙鏈DNA其中在具有如SEQ ID NO2所示的堿基序列的基因的起始密碼子處添加了NdeI識別位點(diǎn)，而在緊接著該基因的終止密碼子之后添加了EcoRI識別位點(diǎn)。使用TaKaRa LA Taq(由TAKARABIO制造)作為DNA聚合酶進(jìn)行PCR，其中反應(yīng)條件根據(jù)其指導(dǎo)手冊。用NdeI和EcoRI消化該DNA，并將其插入質(zhì)粒pUCNT(WO 94/03613)的lac啟動子的下游的NdeI識別位點(diǎn)和EcoRI識別位點(diǎn)之間，以構(gòu)建重組載體pNTOM4。
類似地，使用引物55’-gtgcatatggctaagactgtctatttca-3’(SEQ ID NO11)和引物65’-gtcgaattcttactagaatggaatgtcaaa-3’(SEQ ID NO12)得到了這樣的雙鏈DNA其中在具有如SEQ ID NO1所示的堿基序列的基因的起始密碼子處添加了NdeI識別位點(diǎn)，而在緊鄰該基因的終止密碼子之后添加了EcoRI識別位點(diǎn)。以與上面相同的方式將該DNA插入質(zhì)粒pUCNT以構(gòu)建重組載體pNTOM3。
(實(shí)施例4)突變體基因的構(gòu)建使用Mutan-SuperExpress Km(由TAKARA BIO制造)并遵照其指導(dǎo)手冊中描述的操作方法，制備了這樣的突變體基因其中在具有如SEQ ID NO2所示的堿基序列的基因中，第125位的C被G取代，第128位的A被C取代，第136位的A被G取代，且第147位的C被G取代。該突變體基因編碼這樣的多肽，其中在SEQ ID NO4所示的氨基酸序列中，第42位的丙氨酸被甘氨酸取代，第43位的谷氨酸被丙氨酸取代，第46位的賴氨酸被谷氨酸取代，第49位的天冬酰胺被賴氨酸取代。該突變體基因的堿基序列在SEQ IDNO15中顯示，且由該基因編碼的突變體多肽的氨基酸序列在SEQ ID NO16中顯示。以和實(shí)施例3相同的方式將該突變體基因插入載體pUCNT中以構(gòu)建重組載體pNTOM5。
(實(shí)施例5)進(jìn)一步包含葡萄糖脫氫酶基因的表達(dá)載體的構(gòu)建使用引物75’-gccgaattctaaggaggttaacaatgtataaa-3’(SEQ ID NO13)和引物83’-gcggtcgacttatccgcgtcctgcttgg-5’(SEQ ID NO14)，并以質(zhì)粒pGDK1(Eur.J.Biochem.，186，389(1989))作為模板進(jìn)行PCR，得到了這樣的雙鏈DNA其中，在源自巨大芽孢桿菌IAM1030菌株的葡萄糖脫氫酶(以下稱為GDH)基因中，起始密碼子上游5個堿基處添加了大腸桿菌核糖體結(jié)合序列，該核糖體結(jié)合序列的緊鄰前方添加了EcoRI切割位點(diǎn)，且終止密碼子緊鄰后方添加了SalI切割位點(diǎn)。
所得的DNA片段用EcoRI和SalI消化，并插入實(shí)施例3和4中構(gòu)建的pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5的EcoRI和SalI位點(diǎn)，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1。作為示例，pNTOM4G1的產(chǎn)生方法和結(jié)構(gòu)顯示在圖1中。
(實(shí)施例6)轉(zhuǎn)化體的制備使用實(shí)施例3和4中構(gòu)建的重組載體pNTOM3、pNTOM4和pNTOM5轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARA BIO制造)得到大腸桿菌HB101(pNTOM3)、大腸桿菌HB101(pNTOM4)和大腸桿菌HB101(pNTOM5)。這些轉(zhuǎn)化體已經(jīng)分別以登錄號FERM BP-10368、FERMBP-10369和FERM BP-10370被保藏在獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(IPOD)。
類似地，使用實(shí)施例5中構(gòu)建的重組載體pNTOM3G1、pNTOM4G1和pNTOM5G1轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARA BIO制造)得到大腸桿菌HB101(pNTOM3G1)、大腸桿菌HB101(pNTOM4G1)和大腸桿菌HB101(pNTOM5G1)。
(實(shí)施例7)轉(zhuǎn)化體中的基因表達(dá)將實(shí)施例6中獲得的6種轉(zhuǎn)化體和含有載體質(zhì)粒pUNCT的轉(zhuǎn)化體大腸桿菌HB101(pUNCT)接種到50ml的含有200μg/ml氨芐青霉素的2×YT培養(yǎng)基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％，pH7.0)，37℃下振蕩培養(yǎng)24小時。通過離心收集細(xì)胞，并重懸于50ml的100mM磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中。用UH-50超聲均質(zhì)器(由SMT制造)破碎細(xì)胞，通過離心去除細(xì)胞碎片以得到無細(xì)胞提取物。測量了無細(xì)胞提取物的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮還原活性和GDH活性，并作為比活性表示在表1中。在所有6種實(shí)施例6中獲得的轉(zhuǎn)化體中都觀察到了(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮還原活性的表達(dá)。在含有GDH基因的大腸桿菌HB101(pNTOM3G1)、大腸桿菌HB101(pNTOM4G1)和大腸桿菌HB101(pNTOM5G1)中也觀察到了GDH活性的表達(dá)。(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮還原活性是通過實(shí)施例1中描述的方法測定的。當(dāng)在1MTris-HCl緩沖液(pH 8.0)中加入0.1M葡萄糖，2mM輔酶NADP，以及粗酶溶液，并使該混合物在25℃反應(yīng)1min時，由340nm波長處的吸光度的增加速率計算GDH活性。在所述反應(yīng)條件下經(jīng)過1分鐘將1μmol的NADP還原成NADPH的酶活性定義為1個單位。另外，用蛋白質(zhì)測定試劑盒(由BIO-RAD制造)測定無細(xì)胞提取物中的蛋白質(zhì)濃度。
表1
CBPB*(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮
(實(shí)施例8)使用轉(zhuǎn)化體反應(yīng)將葡萄糖脫氫酶(由Amano Enzyme制造)2000U，葡萄糖2g，NADP 6mg和(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g加入50ml實(shí)施例7中制備的大腸桿菌HB101(pNTOM3)的無細(xì)胞提取物中，30℃下攪拌所述混合物22小時并通過滴加5M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.5。反應(yīng)完成后，用甲苯提取反應(yīng)混合物，去溶劑，并分析該提取物。結(jié)果得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產(chǎn)率86.3％、非對映體過量96.4％d.e.)。
(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮和(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的定量，以及(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的非對映體過量的測定使用高效液相色譜來進(jìn)行(柱子COSMOSIL5C8-MS(4.6mm×250mm；由Nacalai Tesque生產(chǎn))，洗脫液10mM磷酸水溶液/乙腈＝1/1(v/v)；流速1ml/min；檢測210nm)。
(實(shí)施例9)使用轉(zhuǎn)化體反應(yīng)向22.5ml實(shí)施例7中制備的大腸桿菌HB101(pNTOM4)的無細(xì)胞提取物中加入葡萄糖脫氫酶(由Amano Enzyme制造)1250U、葡萄糖3g、NADP4mg、(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮0.25g，在30℃下攪拌，同時通過滴加5M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.5。反應(yīng)開始后2小時、4小時和6小時添加0.25g、及反應(yīng)開始后8小時添加1.25g的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，反應(yīng)31小時。反應(yīng)完成后，用甲苯抽提反應(yīng)混合物，脫溶劑后，和實(shí)施例8一樣分析提取物。結(jié)果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產(chǎn)率99.0％、非對映體過量99.8％d.e.)。
(實(shí)施例10)使用轉(zhuǎn)化體反應(yīng)向25ml實(shí)施例7中制備的大腸桿菌HB101(pNTOM4G1)的無細(xì)胞提取物中加入葡萄糖3g、NADP 3mg、甲苯0.25ml及(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g，在30℃下攪拌，同時通過滴加5M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.5。反應(yīng)完成后，用甲苯提取反應(yīng)混合物，脫溶劑，以與實(shí)施例8相同的方式分析提取物。結(jié)果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產(chǎn)率99.1％、非對映體過量99.8％d.e.)。
(實(shí)施例11)使用轉(zhuǎn)化體反應(yīng)向以與實(shí)施例7中相同的方式制備的大腸桿菌HB101(pNTOM5G1)的培養(yǎng)基中加入葡萄糖6g、NADP 1.4mg、甲苯0.25mI及(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮2.5g，將混合物在30℃攪拌，同時通過滴加5M氫氧化鈉將pH調(diào)節(jié)到6.5。反應(yīng)開始后1小時添加2.5g的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，使混合物反應(yīng)20hr。反應(yīng)完成后，用甲苯提取反應(yīng)混合物，脫溶劑，并以與實(shí)施例8相同的方式分析提取物。結(jié)果，得到了(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(產(chǎn)率99.0％、非對映體過量99.8％d.e.)。
(實(shí)施例12)多肽的底物特異性在含有0.33％(v/v)二甲亞砜的100mM磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)中，分別溶解作為底物的羰基化合物到1mM的終濃度，及輔酶NADPH到0.25mM的終濃度。向其中加入實(shí)施例7中制備的大腸桿菌HB101(pNTOM4)或大腸桿菌HB101(pNTOM3)無細(xì)胞提取物，并使該混合物在30℃反應(yīng)1小時。由反應(yīng)混合物在340nm波長處的吸光度的減少速率來計算對每種羰基化合物的還原活性，并在表2中顯示為相對于對(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮的活性(其作為100％)的值。由所述轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的、由SEQ IDNO3和SEQ ID NO4所示氨基酸序列組成的多肽，對于多種羰基化合物都顯示了還原活性。
表2轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生的多肽的底物特異性
CBPB*(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮.
序列表<110>株式會社鐘化(Kaneka Corporation)<120>新羰基還原酶、其基因及它們的使用方法<130>B040342WO01<150>JP2004-231226<151>2004-08-06<160>16<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>756<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>1atggctaaga ctgtctattt cattgccgga gcatcgagag ggattggcct cgagattgca 60acccaattga gtgcaaaccc agagaaccat gtgattgcct cgtacagatc tgaaaagact 120gctggtgcac tcctggaact tgccaagaag gacaacgtgg acactgttgt gttggatatt 180gcaatccagg agtcgattga gggtttgtcc caacagattg tgaagctgac ggacggaatt 240gatattgctc tgatcaatgc cggagttgga tactcaatgt actctctact cgaatgttcc 300agagaagcat tcattgacca ctggactaca aattctctgg gtccaatcct ggtgtataag 360gaaatccacc aattcatgct gaagagagaa actcgaaaag tgttcttcat gtctagcgga 420gcagggtcta ttcagggcca cttgcctgtt tccgtgagtg catacggtat gtcgaaggca 480gcactgaact acgcggcccg gaaactttct gacgaatgct acaaagacgg ctttactatt 540gtggcgcttc acccaggtat ggttctgaca gacatgggta tggagagtat tgagattatg 600gcaaacggag acgagcagct tgccgcgtcc atcaacagta ttgcaattag tacagacact 660agtgccgcac aatgcattgg tgcaatgcag agtcttacaa agcagagcaa cggtagattc 720attaatgttg cagaccagtt tgacattcca ttctag 756<210>2<211>756<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>2atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120gcagctgagc tgctcaaact ggccaacaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480
gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 756<210>3<211>251<212>PRT<213>Ogataea minuta var.minuta<400>3Met Ala Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Ile Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Glu Asn His Val Ile20 25 30Ala Ser Tyr Arg Ser Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys Asp Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Ala Ile Gln Glu50 55 60Ser Ile Glu Gly Leu Ser Gln Gln Ile Val Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Ala Leu Ile Asn Ala Gly Val Gly Tyr Ser Met Tyr Ser Leu85 90 95Leu Glu Cys Ser Arg Glu Ala Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Leu Val Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Ala Gly Ser Ile130 135 140Gln Gly His Leu Pro Val Ser Val Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Ala Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Gly Phe Thr Ile Val Ala Leu His Pro Gly Met Val Leu Thr Asp Met180 185 190Gly Met Glu Ser Ile Glu Ile Met Ala Asn Gly Asp Glu Gln Leu Ala195 200 205Ala Ser Ile Asn Ser Ile Ala Ile Ser Thr Asp Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Cys Ile Gly Ala Met Gln Ser Leu Thr Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Asn Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250<210>4<211>251<212>PRT
<213>Ogataea minuta var.minuta<400>4Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Ala Glu Leu Leu Lys Leu Ala35 40 45Asn Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly50 55 60Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile85 90 95Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Ash Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phc Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met180 185 190Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile195 200 205Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250<210>5<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物1<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>n代表a，t，g或c<220>
<221>misc_feature
<222>(6)..(6)<223>n代表a，t，g或c<220>
<221>misc_feature<222>(18)..(18)<223>n代表a，t，g或c<400>5acngtntayt tyathgcngg 20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物2<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>n代表a，t，g或c<400>6atnggdatrt craaytgrtc 20<210>7<211>703<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>7agcatcgaga gggattggcc tcgagattgc aacccaattg agtgcaaacc cagagaacca 60tgtgattgcc tcgtacagat ctgaaaagac tgctggtgca ctcctggaac ttgccaagaa 120ggacaacgtg gacactgttg tgttggatat tgcaatccag gagtcgattg agggtttgtc 180ccaacagatt gtgaagctga cggacggaat tgatattgct ctgatcaatg ccggagttgg 240atactcaatg tactctctac tcgaatgttc cagagaagca ttcattgacc actggactac 300aaattctctg ggtccaatcc tggtgtataa ggaaatccac caattcatgc tgaagagaga 360aactcgaaaa gtgttcttca tgtctagcgg agcagggtct attcagggcc acttgcctgt 420ttccgtgagt gcatacggta tgtcgaaggc agcactgaac tacgcggccc ggaaactttc 480tgacgaatgc tacaaagacg gctttactat tgtggcgctt cacccaggta tggttctgac 540agacatgggt atggagagta ttgagattat ggcaaacgga gacgagcagc ttgccgcgtc 600catcaacagt attgcaatta gtacagacac tagtgccgca caatgcattg gtgcaatgca 660gagtcttaca aagcagagca acggtagatt cattaatgtt gca 703<210>8<211>703<212>DNA<213>Ogataea minuta var.minuta<400>8agcttctaga ggtattggcc ttgaggttgc cactcagctg agtgccaacc cagataatta 60
tgttattggt tcttacagaa cggagaaaac tgcagctgag ctgctcaaac tggccaacaa 120agaaaatgtc gacactgttg tcctagacat tggtagccaa ggttctattg aagcgcttcc 180agcacaaatc tcaaagctga cggacggaat cgatattact ctgatcaatg ccggaattgc 240gtactcaatg tactctattt tcgagtgttc cagagagaca tttattgatc actggaccac 300aaattccttg ggtccaatca tgctctacaa ggagattcat cagttcatgc tgaagagaga 360aactcgtaag gtgtttttca tgtctagtgg aggaggctct atccagtctc tattgcctat 420ttcaaccagt gcttacggta tgtcgaaggc tgcactgaac tatgcggtcc ggaagctttc 480tgatgaatgc tacaaggaca acttcaccat tgtgatgttg cacccaggag tggtggccac 540ggatatgggc cgggaaacta ccaagatcat ggccaatgga aatgctcaga ttatctctta 600tattgaatcc atatctttgc cgcccgctac aagcgctgca cagactattg gtgcaatgca 660agctcttgac aagcagagca atggtaggtt catcggagtc gca 703<210>9<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物3<400>9gtgcatatga ccaagactgt ttatttca 28<210>10<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物4<400>10gtcgaattct tattaaaatg gaatgtcgaa 30<210>11<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物5<400>11gtgcatatgg ctaagactgt ctatttca 28<210>12<211>30<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物6<400>12
gtcgaattct tactagaatg gaatgtcaaa 30<210>13<211>32<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物7<400>13gccgaattct aaggaggtta acaatgtata aa 32<210>14<211>28<212>DNA<213>人工的<220>
<223>引物8<400>14gcggtcgact tatccgcgtc ctgcttgg 28<210>15<211>756<212>DNA<213>人工的<220>
<223>突變DNA 1<400>15atgaccaaga ctgtttattt cattgccgga gcttctagag gtattggcct tgaggttgcc 60actcagctga gtgccaaccc agataattat gttattggtt cttacagaac ggagaaaact 120gcaggtgcgc tgctcgaact ggccaagaaa gaaaatgtcg acactgttgt cctagacatt 180ggtagccaag gttctattga agcgcttcca gcacaaatct caaagctgac ggacggaatc 240gatattactc tgatcaatgc cggaattgcg tactcaatgt actctatttt cgagtgttcc 300agagagacat ttattgatca ctggaccaca aattccttgg gtccaatcat gctctacaag 360gagattcatc agttcatgct gaagagagaa actcgtaagg tgtttttcat gtctagtgga 420ggaggctcta tccagtctct attgcctatt tcaaccagtg cttacggtat gtcgaaggct 480gcactgaact atgcggtccg gaagctttct gatgaatgct acaaggacaa cttcaccatt 540gtgatgttgc acccaggagt ggtggccacg gatatgggcc gggaaactac caagatcatg 600gccaatggaa atgctcagat tatctcttat attgaatcca tatctttgcc gcccgctaca 660agcgctgcac agactattgg tgcaatgcaa gctcttgaca agcagagcaa tggtaggttc 720atcggagtcg cagaccagtt cgacattcca ttttaa 756<210>16<211>251<212>PRT<213>人工的<220>
<223>突變多肽1<400>16Met Thr Lys Thr Val Tyr Phe Ile Ala Gly Ala Ser Arg Gly Ile Gly1 5 10 15Leu Glu Val Ala Thr Gln Leu Ser Ala Asn Pro Asp Asn Tyr Val Ile20 25 30Gly Ser Tyr Arg Thr Glu Lys Thr Ala Gly Ala Leu Leu Glu Leu Ala35 40 45Lys Lys Glu Asn Val Asp Thr Val Val Leu Asp Ile Gly Ser Gln Gly50 55 60Ser Ile Glu Ala Leu Pro Ala Gln Ile Ser Lys Leu Thr Asp Gly Ile65 70 75 80Asp Ile Thr Leu Ile Asn Ala Gly Ile Ala Tyr Ser Met Tyr Ser Ile85 90 95Phe Glu Cys Ser Arg Glu Thr Phe Ile Asp His Trp Thr Thr Asn Ser100 105 110Leu Gly Pro Ile Met Leu Tyr Lys Glu Ile His Gln Phe Met Leu Lys115 120 125Arg Glu Thr Arg Lys Val Phe Phe Met Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ile130 135 140Gln Ser Leu Leu Pro Ile Ser Thr Ser Ala Tyr Gly Met Ser Lys Ala145 150 155 160Ala Leu Asn Tyr Ala Val Arg Lys Leu Ser Asp Glu Cys Tyr Lys Asp165 170 175Asn Phe Thr Ile Val Met Leu His Pro Gly Val Val Ala Thr Asp Met180 185 190Gly Arg Glu Thr Thr Lys Ile Met Ala Asn Gly Asn Ala Gln Ile Ile195 200 205Ser Tyr Ile Glu Ser Ile Ser Leu Pro Pro Ala Thr Ser Ala Ala Gln210 215 220Thr Ile Gly Ala Met Gln Ala Leu Asp Lys Gln Ser Asn Gly Arg Phe225 230 235 240Ile Gly Val Ala Asp Gln Phe Asp Ile Pro Phe245 250
權(quán)利要求
1.下列(a)或(b)的DNA(a)包含SEQ ID NO1中所示堿基序列的DNA，(b)與由SEQ ID NO1所示堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，并編碼多肽的DNA，所述多肽具有不對稱地還原由下面式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮 以產(chǎn)生由下面式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性
2.下列(a)或(b)的DNA(a)包含SEQ ID NO2中所示的堿基序列的DNA，(b)與由SEQ ID NO2所示的堿基序列的互補(bǔ)堿基序列組成的DNA在嚴(yán)緊條件下雜交，并編碼多肽的DNA，所述多肽具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性。
3.一種多肽，其由權(quán)利要求
1或2的DNA所編碼，并具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性。
4.下列(a)或(b)的多肽(a)包含SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列的多肽，(b)包含與SEQ ID NO3中所示的氨基酸序列顯示不少于78％的同源性的氨基酸序列，并具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
5.下列(a)或(b)的多肽(a)包含SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列的多肽，(b)包含與SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列顯示不少于78％的同源性的氨基酸序列，并具有不對稱地還原由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以產(chǎn)生由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇的活性的多肽。
6.一種在SEQ ID NO4中所示的氨基酸序列中、具有下列1)到4)中的至少一種突變的多肽1)第42位的丙氨酸被甘氨酸取代，2)第43位的谷氨酸被丙氨酸取代，3)第46位的賴氨酸被谷氨酸取代，4)第49位的天冬酰胺被賴氨酸取代。
7.權(quán)利要求
6所述的多肽，其包含前述1)到4)的所有突變。
8.編碼權(quán)利要求
4-7中任一項(xiàng)所述的多肽的DNA。
9.包含權(quán)利要求
1、2或8的DNA的載體。
10.權(quán)利要求
9所述的載體，其是質(zhì)粒pNTOM3。
11.權(quán)利要求
9所述的載體，其是質(zhì)粒pNTOM4。
12.權(quán)利要求
9所述的載體，其是質(zhì)粒pNTOM5。
13.權(quán)利要求
9所述的載體，還包含編碼具有葡萄糖脫氫酶活性的多肽的DNA。
14.權(quán)利要求
13所述的載體，其中所述具有葡萄糖脫氫酶活性的多肽是源自巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的葡萄糖脫氫酶。
15.用權(quán)利要求
9-14中任一項(xiàng)所述的載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞而獲得的轉(zhuǎn)化體。
16.權(quán)利要求
15所述的轉(zhuǎn)化體，其中所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌。
17.權(quán)利要求
16所述的轉(zhuǎn)化體，其是大腸桿菌HB101(pNTOM3)FERMBP-10368。
18.權(quán)利要求
16所述的轉(zhuǎn)化體，其是大腸桿菌HB101(pNTOM4)FERMBP-10389。
19.權(quán)利要求
16所述的轉(zhuǎn)化體，其是大腸桿菌HB101(pNTOM5)FERMBP-10370。
20.一種光學(xué)活性醇的制造方法，其包括使權(quán)利要求
3-7中任一項(xiàng)所述的多肽或權(quán)利要求
15-19中任一項(xiàng)所述的轉(zhuǎn)化體，或其處理過的產(chǎn)物，與具有羰基的化合物反應(yīng)。
21.權(quán)利要求
20所述的方法，其中所述具有羰基的化合物是由上述式(1)所示的(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮，所述光學(xué)活性醇是由上述式(2)所示的(2R，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。
專利摘要
分離自屬于Ogataea屬的微生物，并具有不對稱地還原(3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁酮以產(chǎn)生(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇的活性的多肽；編碼該多肽的DNA；產(chǎn)生該多肽的轉(zhuǎn)化體；和使用上述多肽或轉(zhuǎn)化體生產(chǎn)(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇的方法。通過使用上述多肽或轉(zhuǎn)化體，可以高效地生產(chǎn)光學(xué)活性醇，例如(2R，3S)－1－氯－3－叔－丁氧羰基氨基－4－苯基－2－丁醇。
文檔編號C12N5/10GK1993464SQ200580026643
公開日2007年7月4日 申請日期2005年8月1日
發(fā)明者木崎憲之, 矢野美穗, 船木正大, 武居輝明, 八十原良彥, 守川壯一, 中井孝尚, 片岡道彥, 清水昌 申請人:株式會社鐘化導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan