專利名稱:生產(chǎn)l－蘇氨酸的微生物、生產(chǎn)其的方法、及使用其生產(chǎn)l－蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有滅活galR基因的微生物、生成該微生物的方法、以及使用該微生物來生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
背景技術(shù)：
L-蘇氨酸是必需氨基酸，而且廣泛用作飼料和食品添加劑，還作為制藥原材料用于合成某些藥物。它已通過埃希氏菌(Escherichia)屬、棒桿菌屬(Coryneform bacteria)、沙雷氏菌屬(Seratia)、和Providencia屬的人工突變體發(fā)酵生產(chǎn)。例如，日本專利公開號10037/81公開了一種使用屬于埃希氏菌屬的菌株來生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受蘇氨酸生物合成系統(tǒng)的蘇氨酸反饋抑制。日本專利申請公開號224684/83公開了一種使用屬于短桿菌屬(Brevibacterium)的菌株來生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，所述菌株耐受S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和α-氨基-β-羥基戊酸且對L-異亮氨酸和L-賴氨酸具有營養(yǎng)需要。韓國專利申請公開號8022/87公開了一種使用屬于埃希氏菌屬的菌株來生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，所述菌株需要二氨基庚二酸和甲硫氨酸且耐受α-氨基-β-羥基戊酸，并額外耐受至少一種選自由利福平、賴氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、和高絲氨酸組成的組的物質(zhì)，或者具有降低的分解L-蘇氨酸的能力。日本專利申請公開號219582/90公開了一種使用屬于Providencia屬的菌株來生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，所述菌株耐受α-氨基-β-羥基戊酸、L-乙硫氨酸、硫代異亮氨酸、羥基硫胺素、和磺胺胍且需要L-亮氨酸還對L-異亮氨酸具有滲漏需要。
然而，上述已知方法的缺點在于它們不能提供較高的L-蘇氨酸產(chǎn)量或者具有昂貴的需要諸如二氨基庚二酸和異亮氨酸。換言之，需要二氨基庚二酸的菌株在生產(chǎn)L-蘇氨酸中的用途包括二氨基庚二酸的額外發(fā)酵，因而可能增加成本。在使用需要異亮氨酸的菌株來生產(chǎn)L-蘇氨酸時，必需向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加昂貴的異亮氨酸，從而增加了成本。
在試圖克服這些缺點的嘗試中，本發(fā)明人開發(fā)了耐受L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸且對甲硫氨酸具有營養(yǎng)需要、對異亮氨酸具有滲漏需要的大腸桿菌L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株。他們通過菌株的發(fā)酵成功生產(chǎn)了L-蘇氨酸，產(chǎn)量高于先前的菌株。菌株和使用所述菌株來生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法公開于韓國專利公開號92-8365。
已知GalP蛋白質(zhì)是將多種糖類諸如半乳糖和葡萄糖運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的通透酶(參閱如V.Hernandez-Montalvo F.Valle F.Bolivar G.Gosset，Appl Microbiol Biotechnol，57186-191，2001)。GalR蛋白質(zhì)在細(xì)胞中抑制galP的表達(dá)(參閱如Mark Geanacopoulos和Sankar Adhya，Journal of Bacteriology，179(1)，228-234，1997年1月)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人在常規(guī)技術(shù)的基礎(chǔ)上深入研究而選擇了L-蘇氨酸生產(chǎn)能力得到改進(jìn)的菌株，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)了通過滅活galR基因促進(jìn)L-蘇氨酸生物合成。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了生成L-蘇氨酸的能力得到改進(jìn)的微生物。
本發(fā)明還提供了生成該微生物的方法。
本發(fā)明還提供了使用該微生物來高效生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
依照本發(fā)明的一個方面，提供了能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活galR基因的微生物。
依照本發(fā)明的另一個方面，提供了生成L-蘇氨酸生產(chǎn)微生物的方法，該方法包括制備滅活galR基因或其DNA片段；將滅活galR基因或其DNA片段導(dǎo)入能夠生成L-蘇氨酸的微生物以引起與微生物染色體上存在的galR基因的重組；并選擇具有滅活galR基因的微生物。
依照本發(fā)明的另一個方面，提供了生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該方法包括培養(yǎng)上文所述微生物；并由培養(yǎng)物分離L-蘇氨酸。



通過參照附圖而詳細(xì)描述本發(fā)明的例示性實施方案，本發(fā)明的上述和其它特色和優(yōu)勢將變得更明顯圖1描繪了包含galR基因的重組質(zhì)粒pTblue/galR的構(gòu)建；和圖2描繪了由重組質(zhì)粒pT7blegalR∷loxpKAN構(gòu)建DNA片段ΔgalR∷loxpKAN。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活galR基因的微生物。
在本發(fā)明中，微生物能夠生成L-蘇氨酸，而且包括具有滅活galR基因的原核和真核微生物。例如，可以包括屬于埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、Providencia屬、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、和短桿菌屬(Brevibacterium)的菌株。優(yōu)選的是，微生物屬于腸桿菌科，更優(yōu)選的是，微生物屬于埃希氏菌屬。最優(yōu)選的是，微生物選自由大腸桿菌FTR2541(KCCM-10539)、大腸桿菌FTR2537(KCCM-10540)、和大腸桿菌FTR2533(KCCM-10541)組成的組。
同樣，微生物可以包括生產(chǎn)L-蘇氨酸的突變體和天然微生物。突變體的實例包括屬于耐受L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸且對甲硫氨酸具有營養(yǎng)需要、對異亮氨酸具有滲漏需要的L-蘇氨酸生產(chǎn)大腸桿菌的微生物；除了內(nèi)在磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)基因以及蘇氨酸操縱子中所含thrA、thrB、和thrC基因以外，染色體DNA中還插入了至少一個拷貝的ppc基因以及蘇氨酸操縱子所含基因的突變微生物；具有滅活pckA基因的微生物，pckA基因參與草酰乙酸(OAA)轉(zhuǎn)變成磷酸烯醇丙酮酸(PEP)，而OAA是L-蘇氨酸生物合成的中間體；具有滅活pckA基因和aspA基因的突變微生物，aspA基因?qū)⑻於彼?Asp)轉(zhuǎn)變成延胡索酸，而Asp是L-蘇氨酸生物合成的另一種中間體；和具有滅活tyrR基因的微生物，tyrR基因抑制tyrB基因的表達(dá)，而tyrB基因是L-蘇氨酸生物合成所必需的。L-甲硫氨酸類似物可以是至少一種選自由D，L-乙硫氨酸、正亮氨酸、α-甲基甲硫氨酸、和L-甲硫氨酸-D，L-sulfoxymine組成的組的化合物。L-蘇氨酸類似物可以是至少一種選自由α-氨基-β-羥基戊酸和D，L-蘇氨酸氧肟酸(D，L-Threoninehydroxamate)組成的組的化合物。L-賴氨酸類似物可以是至少一種選自由S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸和δ-甲基-L-賴氨酸組成的組的化合物。
在本發(fā)明中，galR蛋白質(zhì)抑制編碼半乳糖通透酶的galP基因的表達(dá)，而后者將半乳糖運輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。對于大腸桿菌而言，galR基因是已知的，而且可以由Blattner等人(Science，277，1453-1462，1997)發(fā)表的基因組序列獲得(編號AAC75876)?；蚪M序列還可以由美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)和日本DNA數(shù)據(jù)庫(DNA Data Bank of Japan，DDBJ)獲得。galR基因還包括通過遺傳密碼衰減或突變而生成的等位基因?！皽缁睢痹谟糜诒疚臅r指不表達(dá)有活性的galR蛋白質(zhì)。由此，galR基因的滅活導(dǎo)致galB基因的表達(dá)提高。
可以通過滅活能夠生成L-蘇氨酸的微生物染色體上存在的galR基因來生成本發(fā)明的微生物。滅活方法可以包括通過光照諸如紫外線或化學(xué)品引起突變，并由突變體分離具有滅活galR基因的菌株。滅活方法還包括DNA重組技術(shù)?？梢酝ㄟ^例如將與galR基因同源的核苷酸序列或包含該核苷酸序列的載體注入微生物以引起同源重組來實現(xiàn)DNA重組。注入的核苷酸序列和載體可以包含顯性選擇標(biāo)記。
本發(fā)明還提供了生成L-蘇氨酸生產(chǎn)微生物的方法，包括制備滅活galR基因或其DNA片段；將滅活galR基因或其DNA片段導(dǎo)入能夠生成L-蘇氨酸的微生物以引起與微生物染色體上存在的galR基因的重組；并選擇具有滅活galR基因的微生物。
“滅活galR基因或其DNA片段”在用于本文時指與宿主中的galR基因具有序列同源性但由于丟失、置換、和倒位而不能表達(dá)活性galR蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。將滅活galR基因或其DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以通過但不限于例如轉(zhuǎn)化、綴合、轉(zhuǎn)導(dǎo)、或電穿孔來實現(xiàn)。
在通過轉(zhuǎn)化將滅活galR基因或其DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，滅活流程可以通過混合多核苷酸序列與菌株的培養(yǎng)物來進(jìn)行。雖然菌株天然勝任待轉(zhuǎn)化DNA的攝取，但是優(yōu)選預(yù)先通過任何合適方法使得菌株勝任DNA攝取(參閱如LeBlanc等人，Plasmid，28，130-145，1992；Pozzi等人，J.Bacteriol.，178，6087-6090，1996)。滅活galR基因或其DNA片段具有導(dǎo)入基因組DNA片段的外源DNA片段，并且用滅活狀態(tài)的拷貝替換序列的野生型染色體拷貝。在本發(fā)明的一個實施方案中，滅活多核苷酸序列所包含的“尾部”包含在其5’和3’端的部分靶位點DNA。尾部應(yīng)當(dāng)是至少50個堿基對，而且為了有效重組和/或基因轉(zhuǎn)換優(yōu)選超過200-500個堿基對。為了方便，滅活多核苷酸序列可以包含選擇標(biāo)記，例如抗生素抗性基因。在用抗生素抗性基因切斷靶DNA后，在含適當(dāng)水平的合適抗生素的瓊脂板上進(jìn)行對轉(zhuǎn)化子的選擇。轉(zhuǎn)化后，導(dǎo)入宿主細(xì)胞的滅活多核苷酸序列與基因組DNA尾部發(fā)生同源重組，導(dǎo)致野生型基因組序列的滅活。滅活重組事件易于通過例如Southern印跡來確認(rèn)，或者通過更加方便的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)確認(rèn)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，生成本發(fā)明的L-蘇氨酸生產(chǎn)微生物的方法包括下列流程。
首先，由能夠生成L-蘇氨酸的菌株分離基因組DNA，并使用它作為模板通過常規(guī)技術(shù)進(jìn)行PCR以擴(kuò)增galR基因。
接著，將得到的galR基因克隆到合適的質(zhì)?；蚱渌d體中。通過轉(zhuǎn)導(dǎo)將重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，諸如大腸桿菌。在培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子并分離細(xì)胞后，提取具有g(shù)alR基因的重組載體。然后將抗生素抗性基因片段插入提取的重組載體的galR基因以形成包含滅活galR基因的重組載體。通過轉(zhuǎn)化將該重組載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，并培養(yǎng)宿主細(xì)胞。然后，由產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子分離繁殖的重組載體，并通過合適的限制酶消化獲得具有滅活galR基因的多核苷酸序列。此后，通過常規(guī)技術(shù)諸如電穿孔將該多核苷酸序列導(dǎo)入能夠生成L-蘇氨酸的宿主。選擇具有抗生素抗性的微生物以分離具有滅活galR基因的微生物。
熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，本發(fā)明的滅活多核苷酸序列可以通過常規(guī)克隆方法來生成。例如，可以使用靶向galR基因的寡核苷酸引物的PCR擴(kuò)增方法。PCR擴(kuò)增方法在本領(lǐng)域是眾所周知的(參閱如PCR ProtocolsAGuide to Method and Application，M.Innis等人編，Academic出版社，1990)。PCR包括基因組DNA、合適的酶、引物、和緩沖液，而且可以在DNA熱循環(huán)儀(Perkin Elmer Cetus，諾沃克，康涅狄格州，美國)中方便的進(jìn)行。通過例如在瓊脂糖凝膠電泳后檢測合適大小的DNA片段來確定陽性PCR結(jié)果。
在本發(fā)明的一個實施方案中，制備了重組質(zhì)粒pT7blue/galR和pT7bluegalR∷loxpKAN，并由它們獲得了滅活多核苷酸序列ΔgalR∷loxpKAN。然后，通過電穿孔用滅活多核苷酸序列ΔgalR∷loxpKAN轉(zhuǎn)化耐受L-甲硫氨酸、L-蘇氨酸、和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸且對甲硫氨酸具有營養(yǎng)需要、對異亮氨酸具有滲漏需要的大腸桿菌菌株即大腸桿菌編號KCCM 10236；具有滅活pckA基因的大腸桿菌FTR2717；具有滅活pckA基因和aspA基因的大腸桿菌FTR8625(編號KCCM 10544)；和具有滅活tyrR基因的大腸桿菌FTR7624(編號KCCM 10538)，tyrR基因抑制L-蘇氨酸生物合成所必需的tyrB基因的表達(dá)。結(jié)果是，野生型galR基因得到滅活而生成能夠比原型菌株生成更高濃度L-蘇氨酸的三類新菌株。將新菌株命名為大腸桿菌FTR2541、大腸桿菌FTR2537、和大腸桿菌FTR2533，而且根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)于2003年12月4日保藏于韓國微生物培養(yǎng)物保藏中心(Korean Culture Center ofMicroorganisms)，編號KCCM-10539、KCCM-10540、和、KCCM-10541。
大腸桿菌FTR2541衍生自大腸桿菌編號KCCM 10236，后者又衍生自大腸桿菌TF4076。大腸桿菌TF4076(KFCC10718)需要甲硫氨酸且耐受蘇氨酸類似物(例如α-氨基-β-羥基戊酸，AHV)、賴氨酸類似物(例如S-(2-氨基乙基-L-半胱氨酸，AEC)、異亮氨酸類似物(例如α-氨基丁酸)、甲硫氨酸類似物(例如乙硫氨酸)、諸如此類。大腸桿菌編號KCCM TF4076描述于韓國專利公開號92-8365其全文結(jié)合于此作為參考。磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)是草酰乙酸的前體，它是L-蘇氨酸生物合成途徑的中間體。通過PCR擴(kuò)增源自大腸桿菌編號KCCM TF4076染色體的ppc基因和蘇氨酸操縱子，并額外整合到大腸桿菌編號KCCM TF4076的染色體中以生成大腸桿菌編號KCCM 10236。由此，大腸桿菌編號KCCM 10236具有兩個ppc基因和兩個蘇氨酸操縱子。因此，大腸桿菌編號KCCM 10236能夠以更高水平表達(dá)催化PEP形成草酰乙酸的ppc基因和由天冬氨酸生物合成蘇氨酸所必需的酶(thrA天冬氨酸激酶I-高絲氨酸脫氫酶，thrB高絲氨酸激酶，thrC蘇氨酸合酶)，從而能夠提高L-蘇氨酸產(chǎn)量。大腸桿菌FTR2537衍生自大腸桿菌TFR8625，后者又衍生自大腸桿菌KCCM 10236。大腸桿菌編號KCCM 10236染色體中的pckA基因和aspA基因得到滅活以提高L-蘇氨酸產(chǎn)量。大腸桿菌FTR2533衍生自大腸桿菌TFR7624，后者又衍生自大腸桿菌編號KCCM 10236。大腸桿菌編號KCCM 10236染色體中的tyrR基因得到滅活以提高L-蘇氨酸產(chǎn)量。
本發(fā)明還提供了生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，包括培養(yǎng)能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活galR基因的微生物；并由培養(yǎng)物分離L-蘇氨酸。
在L-蘇氨酸的生產(chǎn)方法中，可以在本領(lǐng)域知道的合適培養(yǎng)基中在合適培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，而且本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員可以根據(jù)選擇的菌株類型容易的進(jìn)行調(diào)整?？梢酝ㄟ^分批操作、連續(xù)操作、或補(bǔ)料—分批操作進(jìn)行培養(yǎng)(參閱如“Biochemical Engineering”，James M.Lee著，Prentice-Hall International Editions，第138-176頁)。
根據(jù)選擇的菌株，培養(yǎng)基應(yīng)當(dāng)完全達(dá)到要求。文獻(xiàn)中公開了多種培養(yǎng)基(參閱如“Manual of Methods for General Bacteriology”，美國細(xì)菌學(xué)學(xué)會，華盛頓特區(qū)，美國，1981)。培養(yǎng)基包括碳源、氮源、和痕量成分。碳源的實例包括碳水化合物，諸如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖(moltose)、淀粉、纖維素；脂肪，諸如大豆油、葵花油、蓖麻油、椰子油；脂肪酸，諸如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸；醇類，諸如甘油和乙醇；以及有機(jī)酸，諸如醋酸。這些碳源可以單獨或聯(lián)合使用。氮源的實例包括有機(jī)物，諸如蛋白胨、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿(CSL)、和大豆粉(soybean meal)；以及無機(jī)物，諸如尿素、硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨、和硝酸銨。這些氮源可以單獨或聯(lián)合使用。在培養(yǎng)基中可以包括磷酸來源，諸如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、和相應(yīng)的鈉鹽。同樣，培養(yǎng)基可以包括金屬鹽類，諸如硫酸鎂或硫酸亞鐵。另外，可以包括氨基酸、維生素、和合適前體。培養(yǎng)基或前體可以以分批或連續(xù)方式添加到培養(yǎng)物中。
在培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)物中適當(dāng)添加氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸或硫酸、等以調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的pH。同樣，向培養(yǎng)物中添加消泡劑諸如脂肪酸聚乙二醇酯以預(yù)防泡沫形成。通過向培養(yǎng)物中注入氧氣或含氧氣體(如空氣)而在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度處于20-45℃范圍內(nèi)，優(yōu)選25-40℃?？梢岳^續(xù)培養(yǎng)直至獲得期望數(shù)量的L-蘇氨酸，優(yōu)選10-160小時。
可以通過本領(lǐng)域知道的常規(guī)方法由培養(yǎng)物分離L-蘇氨酸。分離方法包括離心、過濾、離子交換層析、和結(jié)晶等。例如，可以將培養(yǎng)物低速離心以除去生物量而得到上清液，并通過離子交換層析進(jìn)一步分離。
下面將通過實施例更加具體的描述本發(fā)明。但是，提供下列實施例只是為了舉例說明，因此本發(fā)明并不限于此或由此而受到限制。
具體實施方式
實施例實施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建和galR基因的敲除在此實施例中，通過同源重組敲除了大腸桿菌染色體中的galR基因。為此，制備了包含部分galR基因的載體，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞中，隨后選擇具有g(shù)alR基因敲除的菌株。
使用QIAGEN Genomic-tip System由L-蘇氨酸生產(chǎn)大腸桿菌菌株編號KCCM 10236提取基因組DNA。使用提取的基因組DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增包含galR基因ORF(開放讀碼框)的DNA片段(大約850bp)。所用引物是一對寡核苷酸(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。PCR進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)依次包括于94℃變性30秒、于60℃退火30秒、并于72℃延伸60秒。
將PCR產(chǎn)物施加到1.0％瓊脂糖凝膠上并進(jìn)行電泳。由856bp galR基因條帶純化DNA。于16℃過夜，將純化的DNA連接到克隆載體pT7Blue(Novagen公司，美國)的EcoR V位點中，以構(gòu)建重組質(zhì)粒pT7Blue/galR(見圖1)。將由此產(chǎn)生的質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌NM522中。將轉(zhuǎn)化菌株涂布在含50mg/L羧芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，并于37℃培養(yǎng)過夜。
用鉑絲接種環(huán)挑取形成的菌落，并接種3ml含羧芐青霉素的液體LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)過夜后，使用QIAGEN Mini Prep Kit由培養(yǎng)物提取質(zhì)粒DNA。用限制酶Mlu I消化質(zhì)粒DNA提取物，并確認(rèn)galR基因的克隆。用限制酶Hinc II切割得到確認(rèn)的質(zhì)粒pT7Blue/galR，并由0.8％瓊脂糖凝膠中大約3.8kb的條帶純化DNA。通過Klenow酶處理將純化的DNA補(bǔ)平末端。將由此產(chǎn)生的DNA片段平端連接包含loxp區(qū)的卡那霉素抗性基因的大約1.5kb片段，它是通過用Hinc II限制酶和EcoR V消化質(zhì)粒pUG6(U.Guldenre等人，Nucleic Acid Research，24(13)，2519-2524，1996)得到的，從而構(gòu)建大約5.3kb的重組質(zhì)粒pT7ΔgalR∷loxpKAN(見圖2)。
用重組質(zhì)粒pT7ΔgalR∷loxpKAN轉(zhuǎn)化大腸桿菌NM522。將由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子在含50mg/L羧芐青霉素和50mg/L卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基平板上劃線，并于32℃培養(yǎng)過夜。用鉑絲接種環(huán)挑取形成的菌落，并接種3ml含羧芐青霉素和卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基。培養(yǎng)過夜后，使用QIAGENMini Prep Kit提取質(zhì)粒DNA。使用提取的質(zhì)粒DNA作為模板，通過PCR擴(kuò)增包含galR基因ORF和loxpKAN位點的DNA片段(大約2.3kb)。所用引物是一對寡核苷酸(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)。PCR進(jìn)行30個循環(huán)，每個循環(huán)依次包括于94℃變性30秒、于60℃退火30秒、并于72℃延伸60秒。
通過電穿孔將由此產(chǎn)生的DNA片段ΔgalR∷loxpKAN轉(zhuǎn)化到生產(chǎn)L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株編號KCCM 10236、大腸桿菌FTR8625、和大腸桿菌FTR7624中，并將由此產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子在含卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基上劃線以選擇具有g(shù)alR基因敲除的菌落。對選擇的菌落測試它們在搖瓶培養(yǎng)物中的L-蘇氨酸產(chǎn)量。
實施例2錐形瓶中使用選擇菌株的L-蘇氨酸產(chǎn)量在含有下文表1所列蘇氨酸滴定培養(yǎng)基的錐形瓶中培養(yǎng)實施例1中選擇的30個菌落，并比較L-蘇氨酸產(chǎn)量。
表1蘇氨酸滴定培養(yǎng)基




將每個菌落在LB固體培養(yǎng)基上在32℃溫箱中培養(yǎng)過夜。然后，將一鉑絲環(huán)培養(yǎng)物接種25ml滴定培養(yǎng)基，并于32℃以250rpm培養(yǎng)42-48小時。
通過高效液相層析(HPLC)分析來自培養(yǎng)物的L-蘇氨酸。下文表2列出了分析結(jié)果。可以由結(jié)果看出，原型菌株編號KCCM 10236在48小時內(nèi)生成23g/L L-蘇氨酸，而本發(fā)明的敲除了galR基因的大腸桿菌FTR2541在44小時內(nèi)生成25g/L L-蘇氨酸。原型菌株大腸桿菌FTR8625和FTR7624在48小時內(nèi)生成26g/L L-蘇氨酸，而本發(fā)明的敲除了galR基因的大腸桿菌FTR2537和FTR2533分別在44小時和42小時內(nèi)生成28g/L L-蘇氨酸。因此，觀察到本發(fā)明的轉(zhuǎn)化微生物將發(fā)酵時間和L-蘇氨酸濃度與原型菌株相比提高了高達(dá)大約7-9％，并將L-蘇氨酸產(chǎn)量提高了高達(dá)大約18-25％。選擇的大腸桿菌FTR2541、大腸桿菌FTR2537、和大腸桿菌FTR2533于2003年12月4日保藏于韓國微生物培養(yǎng)物保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms)，編號KCCM-10539、KCCM-10540、和KCCM-10541。同樣，原型菌株大腸桿菌FTR8625和大腸桿菌FTR7624于2003年12月4日保藏于韓國微生物培養(yǎng)物保藏中心，編號KCCM-10544和KCCM-10538。
表2菌株的搖瓶滴定測試結(jié)果




通過實施例證明，微生物的L-蘇氨酸生物合成能力通過galR基因的敲除得到了改進(jìn)。這可能是因為galP基因的表達(dá)通過galR基因的敲除得到提高，從而提高菌株內(nèi)糖類的供應(yīng)速率，這提高了L-蘇氨酸生產(chǎn)菌株的比生長速率。然而，微生物生產(chǎn)力的改進(jìn)并非只是基于這種機(jī)制。
如上所述，本發(fā)明具有滅活galR基因的微生物通過發(fā)酵高產(chǎn)率生產(chǎn)L-蘇氨酸。
同樣，依照生成微生物的方法，可生成能夠高產(chǎn)率生成L-蘇氨酸的微生物。
同樣，依照本發(fā)明的L-蘇氨酸生產(chǎn)方法，可以生產(chǎn)高產(chǎn)率的L-蘇氨酸。
盡管已經(jīng)參照本發(fā)明的例示性實施方案而具體顯示并描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，在未脫離由后附的權(quán)利要求
定義的本發(fā)明的精神和范圍條件下，其中的形式和細(xì)節(jié)可以進(jìn)行多種變化。
IA050589-序列表<110>CJ株式會社<120>生成L-蘇氨酸的微生物、生產(chǎn)其的方法、及使用其生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法<130>PN052460<160>2<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>1ctcccgacac gctcaaccca gatt 24<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>2tgcccgccag aaaaagtcag c 21
權(quán)利要求
1.一種微生物，其能夠生成L-蘇氨酸且具有滅活的galR基因。
2.權(quán)利要求
1的微生物，其屬于腸桿菌科。
3.權(quán)利要求
2的微生物，其是大腸桿菌。
4.權(quán)利要求
3的微生物，其中大腸桿菌耐受L-甲硫氨酸，L-蘇氨酸和L-賴氨酸類似物以及α-氨基丁酸，且對甲硫氨酸具有營養(yǎng)需要，對異亮氨酸具有滲漏需要。
5.權(quán)利要求
4的微生物，其中L-甲硫氨酸類似物是D，L-乙硫氨酸，正亮氨酸，α-甲基甲硫氨酸或L-甲硫氨酸-D，L-sulfoxymine。
6.權(quán)利要求
4的微生物，其中L-蘇氨酸類似物是α-氨基-β-羥基戊酸或D，L-蘇氨酸氧肟酸。
7.權(quán)利要求
4的微生物，其中L-賴氨酸類似物是S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸或δ-甲基-L-賴氨酸。
8.權(quán)利要求
1的微生物，其中染色體上的pckA基因是失活的。
9.權(quán)利要求
1的微生物，其中染色體上的pckA和aspA基因是失活的。
10.權(quán)利要求
1的微生物，其中除了內(nèi)在ppc基因以及thrA，thrB和thrC基因以外，將至少一個拷貝的磷酸烯醇丙酮酸羧酶(ppc)基因以及thrA，thrB和thrC基因插入染色體DNA中。
11.權(quán)利要求
1的微生物，它選自由大腸桿菌FTR2541(KCCM-10539)，大腸桿菌FTR2537(KCCM-10540)和大腸桿菌FTR2533(KCCM-10541)組成的組。
12.一種生成L-蘇氨酸生產(chǎn)微生物的方法，該方法包括制備失活的galR基因或其DNA片段；將失活的galR基因或其DNA片段導(dǎo)入能夠生成L-蘇氨酸的微生物以引起與所述微生物染色體上存在的galR基因的重組；和選擇具有失活的galR基因的微生物。
13.權(quán)利要求
12的方法，其中失活的galR基因或其DNA片段是通過將含抗生素標(biāo)記(loxpKAN)的盒插入galR基因而制備的。
14.一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其包括培養(yǎng)依照權(quán)利要求
1-11任一項的微生物；和由培養(yǎng)物分離L-蘇氨酸。
專利摘要
本發(fā)明提供了能夠生成L－蘇氨酸且具有滅活galR基因的微生物、生成該微生物的方法、以及使用該微生物來生產(chǎn)L－蘇氨酸的方法。該微生物可用于高產(chǎn)率生產(chǎn)L－蘇氨酸。
文檔編號C12P13/08GKCN1654634SQ200510007927
公開日2005年8月17日 申請日期2005年2月5日
發(fā)明者樸英薰, 李炳春, 趙光命, 金大哲, 申容旭, 李鎮(zhèn)浩 申請人:Cj株式會社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan