專利名稱：發(fā)酵生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物工業(yè)，描述了一種發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。L-蘇氨酸是一種必需氨基酸，它作為各種營養(yǎng)混合物的一個(gè)組分而用于醫(yī)藥目的。另外，它也用作動(dòng)物飼料添加劑，用作制藥和化學(xué)工業(yè)中的一種試劑，并作為生長因子用于由微生物來生產(chǎn)諸如賴氨酸和高絲氨酸等氨基酸。
過去，曾用從天然環(huán)境中分離出的細(xì)菌或該細(xì)菌的人工突變株作為發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的微生物。許多產(chǎn)L-蘇氨酸的人工突變株都是已知的，其中大多數(shù)都對α-氨基-β-羥基戊酸有抗性，屬于埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬、短桿菌屬或棒狀桿菌屬。關(guān)于埃希氏桿菌，JPA55-131397、JPA-59-31691、JPA56-15696和JPW3-501682描述了用已被含蘇氨酸操縱子的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
另外，在迄今已知的產(chǎn)蘇氨酸細(xì)菌中，大腸桿菌BK Ⅱ M(VKPM)B-3996株的蘇氨酸產(chǎn)量和消耗系數(shù)最為優(yōu)越(JPW3-501682)。本發(fā)明中“消耗系數(shù)”是指生產(chǎn)1克蘇氨酸所需的糖的克數(shù)。如果該細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)用發(fā)酵罐中培養(yǎng)，并對pH傳感器的信號(hào)作出響應(yīng)而在培養(yǎng)基中加入糖-氨，則蘇氨酸的最高生物含成量為85克/升，消耗系數(shù)為每1克蘇氨酸2克糖。
天冬氨酸激酶(以下簡寫為AK)是一種將天冬氨酸轉(zhuǎn)化成β-磷酸天冬氨酸的酶，它是天冬氨酸及其衍生氨基酸生物合成途徑的主要調(diào)節(jié)部位。如

圖1所示，大腸桿菌有三種類型的AK(AK Ⅰ、AK Ⅱ、AK Ⅲ)，頭兩種是具有高絲氨酸脫氫酶(以下有時(shí)簡寫為HD)活性的雙功能酶，一種是由thrA基因編碼的AKI-HDI，另一種是由MetL(M)基因編碼的AK Ⅱ-HD Ⅱ。
只有AK Ⅲ是單功能酶，它是稱為lysC的基因的產(chǎn)物，并已知受賴氨酸的阻遏和反饋抑制。另一方面，AK Ⅰ受蘇氨酸和異亮氨酸的協(xié)同阻遏，并受蘇氨酸抑制，而AK Ⅱ則受甲硫氨酸阻遏。其細(xì)胞內(nèi)活性的比例約為AK ⅠAK ⅡAK Ⅲ＝514。
已克隆了大腸桿菌的lysC基因，并測定了其堿基順序(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte.J.C.，J.Biol.Chem.，2611052，1986)。另外Mizukami等人(Mizukami，T.等，Agric.Biol.Chem.，501015，1986)描述了用已增強(qiáng)了AK Ⅲ活性的大腸桿菌株來發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸。然而，尚未充分解除對Mizukami等人所報(bào)道的AK Ⅲ的賴氨酸依賴性反饋抑制作用。
因此，本發(fā)明的主題是獲得充分解除了賴氨酸反饋抑制作用的AK Ⅲ，以及提供一種大大優(yōu)于先有技術(shù)的L-蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的發(fā)明人為克服上述問題而進(jìn)行了勤奮的研究，結(jié)果成功地獲得一種編碼大腸桿菌中的AK Ⅲ并充分解除了賴氨酸反饋抑制作用的基因(突變lysC或lysC＊)，并且發(fā)現(xiàn)，把該基因引入產(chǎn)蘇氨酸細(xì)菌中能使L-蘇氨酸有效積累，這樣便完成了本發(fā)明。
換句話說，本發(fā)明涉及含有一種基因的DNA，該基因編碼存在于埃希氏桿菌中的天冬氨酸激酶Ⅲ，并在編碼區(qū)中有一個(gè)解除賴氨酸對上述天冬氨酸激酶Ⅲ反饋抑制作用的突變。具體地說，本發(fā)明涉及上述DNA，其中解除賴氨酸對天冬氨酸激酶Ⅲ反饋抑制作用的突變位于天冬氨酸激酶Ⅲ的A結(jié)構(gòu)域或B結(jié)構(gòu)域。更具體地說，本發(fā)明涉及上述DNA，其中解除賴氨酸對天冬氨酸激酶Ⅲ反饋抑制作用的突變(參照下面的順序表中的1號(hào)順序)選自例如，323位Gly被Asp置換的突變;323位Gly被Asp置換，408位Gly被Asp置換的突變;34位Arg被Cys置換，323位Gly被Asp置換的突變;325位Leu被Phe置換的突變;318位Met被Ile置換的突變;318位Met被Ile置換，349位Val被Met置換的突變;345位Ser被Leu置換的突變;347位Val被Met置換的突變;352位Thr被Ile置換的突變;352位Thr被Ile置換，369位Ser被Phe置換的突變;164位Glu被Lys置換的突變;417位Met被Ile置換，419位Cys被Tyr置換的突變。
另外，本發(fā)明涉及上述DNA，該DNA是一種與能夠在埃希氏桿菌中自主復(fù)制的載體DNA相連的重組DNA。此外，本發(fā)明涉及一些屬于埃希氏桿菌屬的微生物，這些微生物已由于將上述重組DNA引入細(xì)胞而得以轉(zhuǎn)化。落在本發(fā)明范圍內(nèi)的還有由于在其染色體DNA中引入DNA而被轉(zhuǎn)化的微生物，所引入的DNA編碼上述得自埃希氏桿菌的天冬氨酸激酶Ⅲ，并含有一種在編碼區(qū)中帶有突變的基因，該突變解除賴氨酸對上述天冬氨酸激酶Ⅲ的反饋抑制。
本發(fā)明還涉及一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其特征是在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)任一種上述微生物，在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并積累L-蘇氨酸，從培養(yǎng)物中收集L-蘇氨酸。
下面給出本發(fā)明的詳細(xì)描述。
作為供給含AK Ⅲ編碼基因(lysC)的DNA的供體菌，可以使用屬于埃希氏桿菌屬的任何微生物，具體地說是那些在Neidhardt的文章中提到的微生物(Neidhardt，F(xiàn).C.等人，“大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌”，美國微生物學(xué)會(huì)，Washington，D.C.，1208，表1)，其實(shí)例包括大腸桿菌JM109株和MC1016株。
如果使用野生菌株作為供體菌來供給含AK Ⅲ編碼基因(lysC)的DNA，則可得到含野生型AK Ⅲ基因的DNA。為在該基因內(nèi)引入突變以得到解除了L-賴氨酸反饋抑制作用的AK Ⅲ基因(lysC＊)，可以通過直接用羥胺處理來實(shí)現(xiàn)DNA的體外突變。羥胺是一種化學(xué)誘變劑，它通過將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N4-羥基胞嘧啶而誘導(dǎo)C→T突變。
此外，使用解除了L-賴氨酸對AK Ⅲ活性反饋抑制作用的突變株作為DNA供體株，可以得到其中所含的AK Ⅲ基因解除了L-賴氨酸反饋抑制作用的DNA。這種突變株可以如下獲得對細(xì)胞用常規(guī)方法進(jìn)行誘變處理、紫外線照射或用誘變劑(如N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍)處理。
現(xiàn)在對含AK Ⅲ編碼基因(lysC)的DNA的制備進(jìn)行敘述。先培養(yǎng)帶有野生型lysC的大腸桿菌，例如MC1061株，得到培養(yǎng)細(xì)胞。上述微生物的培養(yǎng)可以用常規(guī)固體培養(yǎng)方法進(jìn)行，但是從細(xì)胞收集的觀點(diǎn)看優(yōu)選用液體培養(yǎng)方法進(jìn)行培養(yǎng)。另外，培養(yǎng)基可以是用下列方法制備的培養(yǎng)基例如，在一種或更多種氮源中加入一種或更多種無機(jī)鹽，必要時(shí)再加入碳水化合物、維生素等。無機(jī)鹽的例子有磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鉀(K2HPO4)、硫酸鎂、氯化鈉、氯化鎂、氯化鐵、硫酸鐵、或硫酸錳。氮源的例子有酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、玉米浸液、或大豆或小麥的滲出液。培養(yǎng)基的初始pH大致調(diào)到7-8。培養(yǎng)用深層通氣攪拌培養(yǎng)法、振蕩培養(yǎng)法、靜止培養(yǎng)法等，在30-42℃下(優(yōu)選約37℃)進(jìn)行4-24小時(shí)。對以這種方式獲得的培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行離心分離，例如以3，000rpm離心5分鐘，得到大腸桿菌MC1061株的細(xì)胞。
可以由這些細(xì)胞制得染色體DNA，例如用Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta.72619，1963)、K.S.Kirby的方法(Biochem.J.64405，1956)等。
為分離lysC基因，用適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈钣蒙鲜龇椒ㄖ频玫娜旧wDNA。如果通過控制切割反應(yīng)時(shí)間等條件來控制切割程度，則可使用多種限制酶。接著，可使該基因與能夠在埃希氏桿菌中復(fù)制的載體DNA相連，所得的重組DNA可用于轉(zhuǎn)化埃希氏桿菌的突變株，例如缺乏天冬氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的GT3(以建立基因文庫)，并可以從所得的轉(zhuǎn)化株中分離出已能夠在不含賴氨酸的基本培養(yǎng)基上生長的菌株，從而分離出含lysC基因的重組DNA。
具體地說，在30℃或更高的溫度下(優(yōu)選37℃)，在1-10單位/ml的酶濃度下，用限制酶(如Sau3AⅠ)消化染色體DNA不同的時(shí)間(1分鐘至2小時(shí))，以達(dá)到完全消化或部分消化，得到含有各種染色體DNA片段的混合物。在30℃或更高的溫度下，在1-100單位/ml的酶濃度下，用限制酶(如BamHI)消化能夠在埃希氏桿菌中復(fù)制的載體DNA1小時(shí)或更長的時(shí)間，優(yōu)選1-3小時(shí)，以使其達(dá)到完全消化，得到經(jīng)過切割的DNA。該限制酶所產(chǎn)生的末端堿基順序與切割染色體DNA時(shí)所用的限制酶Sau3A所產(chǎn)生的順序相同。接著，使含有得自大腸桿菌MC1061并包含以上述方式制備的lysC基因的DNA片段的混合物，與經(jīng)過切割的載體DNA混合，并在4-16℃的溫度下，在1-100單位/ml的酶濃度下，使DNA連接酶(優(yōu)選T4DNA連接酶)作用于上述混合物1小時(shí)或更長的時(shí)間，優(yōu)選6-24小時(shí)，得到重組DNA。
按本發(fā)明使用的載體DNA優(yōu)選為質(zhì)粒載體DNA，例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等。此外還可以使用噬菌體DNA載體。可在微生物中發(fā)揮作用的啟動(dòng)子，例如lac、trp、PL等，可用于高效表達(dá)用于所需目的的基因。本文所用的術(shù)語“重組DNA”，包括由上述基因摻入染色體而得到的DNA，摻入的方法利用了轉(zhuǎn)座子(Berg，D.E.和Berg，C.M.，Bio/Technol.，1417，1983)、μ噬菌體(日本特開平2-109985)或同源重組(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.，1972)。
用該重組DNA轉(zhuǎn)化(例如)大腸桿菌K-12株，優(yōu)選GT3株等，然后由具有較高水平AK活性的菌株，或者由已補(bǔ)足了營養(yǎng)需要的菌株，得到帶有含lysC基因的重組DNA的菌株。這一轉(zhuǎn)化可以按D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology，68326，1979)或用氯化鈣處理細(xì)胞以提高DNA穿透程度的方法(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53159，1970)進(jìn)行。然后，可以按照(例如)P.Guerry等人的方法(J.Bacteriol.，1161064，1973)或D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.，110667，1972)，從上述菌株中分離出重組DNA，這種重組DNA是通過把含有l(wèi)ysC基因的DNA插入到載體DNA中而制得的。
可以確認(rèn)候選菌株確實(shí)具有含lysC的重組DNA，確認(rèn)方法是制備細(xì)胞提取液，然后由該提取液制備粗制酶溶液供確認(rèn)天冬氨酸激酶活性。測定天冬氨酸激酶活性的方法可以是Stadtman等人的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，LeBras，G.和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，2362033，1961)。
另外，lysC基因也可用下列方法制得由Saito和Miura的方法制得染色體DNA，利用PCR法(聚合酶鏈反應(yīng)，參見White，T.J.等，Trends Genet.5185，1989)由該染色體DNA擴(kuò)增lysC基因。用于擴(kuò)增的DNA引物與含有整個(gè)lysC基因區(qū)或其片段的雙鏈DNA的3′端互補(bǔ)。如果只需擴(kuò)增一部分lysC基因，則必須用DNA片段作引物篩選基因文庫中含整個(gè)基因區(qū)的DNA片段。如果要擴(kuò)增整個(gè)基因區(qū)，則可對該DNA片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切下所要的條帶回收含lysC基因的DNA片段。
DNA引物可以適當(dāng)?shù)馗鶕?jù)(例如)大腸桿菌的已知順序來制備(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，2611052，1986)，優(yōu)選的是兩類引物5′-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3′(2號(hào)順序)和5′-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3′(3號(hào)順序)，這兩個(gè)引物能夠擴(kuò)增1347個(gè)堿基的lysC基因編碼區(qū)。DNA的合成可以利用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的380B型DNA合成儀和亞磷酰胺法(見Tetrahedron Letters，221859，1981)，以常規(guī)方式進(jìn)行。PCR反應(yīng)可以利用Takara Shuzo公司生產(chǎn)的PJ2000型DNA熱循環(huán)儀和Takara Shuzo公司生產(chǎn)的Taq DNA聚合酶，按照供貨商指明的方法進(jìn)行。
使已用PCR法擴(kuò)增的lysC基因與能夠在埃希氏桿菌中復(fù)制的載體DNA相連，并將其引入埃希氏桿菌細(xì)胞中。應(yīng)采用的用載體DNA轉(zhuǎn)化宿主的方法及確認(rèn)lysC存在的方法，與前已述及的方法相同。
在所得的lysC中誘導(dǎo)突變的方法，例如氨基酸的置換、插入或缺失，可以用重組PCR法(Higuchi，R.，61，in PCR Technology，Erlich，H.A.，Eds.，Stockton Press，1989)、定位誘變法(Kramer，W.和Frits，H.J.，Meth.in Enzymol.，154350，1987;Kunkel，T.A.等，Meth.in Enzymol.，154367，1987)等方法進(jìn)行。利用這些方法可以在所需的位點(diǎn)誘導(dǎo)出所需的突變。另外，對隨機(jī)突變的引入來說，可以采用用羥胺直接處理染色體DNA或質(zhì)粒上的目標(biāo)基因的方法(Hashimoto，T.和Sekiguchi，M.，J.Bacteriol.，1591039，1984);用紫外線照射或用化學(xué)試劑(如N-甲基-N′-亞硝基胍、亞硝酸等)處理含目標(biāo)DNA的細(xì)胞的方法;或者化學(xué)合成目標(biāo)基因的方法。
選擇解除抑制作用的突變基因lysC＊的方法包括先用突變的重組DNA轉(zhuǎn)化AK缺陷型菌株，如大腸桿菌GT3株。接著，在含有大量賴氨酸的基本培養(yǎng)基(如M9)中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。帶有含野生型lysC的質(zhì)粒的菌株中，唯一的AK即AK Ⅲ受到賴氨酸的抑制，因此再也不可能合成蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，因此其生長受到抑制。相比之下，所帶的質(zhì)粒含有解除賴氨酸抑制作用的lysC＊的菌株，應(yīng)能在含有大量賴氨酸的基本培養(yǎng)基上生長。利用這一現(xiàn)象，可以選擇出所需的菌株，也就是說，所帶的質(zhì)粒含有解除抑制作用的lysC＊的菌株，即對賴氨酸或S-2-氨基乙基半胱氨酸(AEC，賴氨酸的類似物)有抗性的菌株。
以這種方式得到的上述突變基因，可以用作重組DNA引入適當(dāng)?shù)奈⑸?宿主)，并可在其中表達(dá)而得到其AK已解除了反饋抑制作用的微生物。
上述野生埃希氏桿菌株可以用作宿主，可以向其中引入所得到的lysC基因或突變lysC基因(lysC＊)，然后在其中擴(kuò)增，以生產(chǎn)蘇氨酸，但除此之外也可用任何其他細(xì)菌作宿主，條件是此處構(gòu)建的重組載體DNA的復(fù)制起點(diǎn)和lysC基因或突變lysC基因(lysC＊)都能在其中發(fā)揮作用;重組載體DNA能夠在其中復(fù)制;lysC基因或突變lysC基因(lysC＊)可以在其中得到增強(qiáng)。最優(yōu)選的宿主是大腸桿菌B-3996株。
培養(yǎng)以上述方式得到的轉(zhuǎn)化株，在培養(yǎng)液中生產(chǎn)和積累目標(biāo)L-蘇氨酸，然后收集L-蘇氨酸。所述轉(zhuǎn)化株所帶的重組載體DNA含有編碼解除了賴氨酸反饋抑制作用的天冬氨酸激酶Ⅲ的基因。
需用于生產(chǎn)L-蘇氨酸的培養(yǎng)基是常規(guī)培養(yǎng)基，其中含有碳源、氮源、無機(jī)離子，必要時(shí)還含有其他有機(jī)成分。
需使用的碳源可以是糖(如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖)、水解淀粉、醇類(如甘油或山梨醇)、或有機(jī)酸(如富馬酸、檸檬酸、琥珀酸等)。
需使用的氮源可以是無機(jī)銨鹽(如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等)、有機(jī)氮(如大豆水解產(chǎn)物)、或氨氣、氨水等。
優(yōu)選加入適量的所需物質(zhì)作為有機(jī)微量營養(yǎng)源，例如維生素B1、L-高絲氨酸等，或酵母提取物。除此之外，必要時(shí)加入少量磷酸鉀、硫酸鎂、鐵離子、錳離子等。
培養(yǎng)優(yōu)選在通氣條件下進(jìn)行16-72小時(shí)，其間培養(yǎng)溫度控制在25℃-45℃，培養(yǎng)物pH控制在5-8。為控制pH，可以使用無機(jī)酸或有機(jī)酸、堿性物質(zhì)、或氨氣等。發(fā)酵液中L-蘇氨酸的收集是把常規(guī)離子交換樹脂法、沉淀法和任何其他公知方法組合起來進(jìn)行的。
圖1是蘇氨酸生物合成途徑的示意圖。
圖2是pLYSC1和pLYSC2的限制酶圖譜(見實(shí)施例1)。
圖3是顯示引入羥胺誘導(dǎo)的突變對lysC影響的曲線圖(見實(shí)施例2(2-4))。
圖4顯示由各種不同lysC＊基因編碼的天冬氨酸激酶的賴氨酸依賴性抑制的程度(見實(shí)施例3(3-4))。橫軸的賴氨酸濃度以對數(shù)表示?？v軸的比活以比例表示，其中加入0mM賴氨酸時(shí)野生型AK Ⅲ的活性定義為100%。
圖5顯示構(gòu)建pLLC＊的示意圖(見實(shí)施例4(4-1))。
圖6顯示構(gòu)建pVICLC＊A和pVICLC＊B的示意圖(見實(shí)施例4(4-3))。
圖7顯示每個(gè)lysC＊的突變點(diǎn)(見實(shí)施例5(5-3))。
以下參照實(shí)施例更具體地?cái)⑹霰景l(fā)明。
實(shí)施例1野生lysC基因的克隆大腸桿菌lysC基因的堿基順序已有報(bào)道(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，2611052，1986)，已知其開放讀碼(ORF)有1，347個(gè)堿基，編碼449個(gè)氨基酸。因?yàn)榇嬖谝粋€(gè)與賴氨酸阻遏作用有關(guān)的操縱基因，所以將該操縱基因區(qū)除去，克隆時(shí)用PCR法只擴(kuò)增含SD順序和ORF的區(qū)域。
制備兩種不同的引物5′-CTTCCCTTGTGCCAAGGCTG-3′(2號(hào)順序)和5′-GAATTCCTTTGCGAGCAG-3′(3號(hào)順序)，用Saito和Miura的方法(Biochem.Biophys.Acta.，72619，1963)回收大腸桿菌K-12MC1061株的整個(gè)基因組DNA。用這兩個(gè)引物和整個(gè)基因組DNA按Erlich等人的方法(PCR Technology，Stockton Press，1989)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增目標(biāo)DNA。所得DNA用BamHI和AseI消化，然后制成平末端，再將該DNA插入多拷貝載體pUC18的SmaI位點(diǎn)。這樣便得到兩種質(zhì)粒，就lacZ啟動(dòng)子而言，一種為反義質(zhì)粒(pLYSC1)，一種是有意義質(zhì)粒(pLYSC2)(見圖2)。
用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化完全缺乏AKⅠ、AKⅡ、AKⅢ的大腸桿菌GT3株(thrA1016b、metLM1005、lysC1004)，由于GT3的高絲氨酸+二氨基庚二酸需要已補(bǔ)足，證實(shí)了該基因是編碼活性AK Ⅲ的lysC。
實(shí)施例2解除抑制的突變基因lysC＊的制取(2-1)為有效地制取解除了抑制作用的lysC基因(lysC＊)，對實(shí)施例1中制備的重組質(zhì)粒DNA上的基因進(jìn)行誘變處理。
作為一種制取解除了抑制作用的突變基因lysC＊的方法，先摻入野生lysC重組質(zhì)粒，以便轉(zhuǎn)化到完全缺乏AK的大腸桿菌GT3中。在具有下表1所列組成的M9基本培養(yǎng)基中加入大量的賴氨酸，并在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化株。所帶的質(zhì)粒含有野生型lysC的菌株，其唯一的AK即AK Ⅲ受到賴氨酸的抑制，所以再也不可能合成蘇氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸和二氨基庚二酸(DAP)，因此生長受到抑制。
表1M9基本培養(yǎng)基A:20×M9 (g/l)Na2HPO4·12H2O 303KH2PO460NaCl 10NH4Cl 20B:1 M MgSO4C:50% 葡萄糖D:1 g/l 硫胺素將A、B、C、D和水分別滅菌，并以ABCD水＝50.110.195的比例混合。
相比之下，所帶的質(zhì)粒含有解除賴氨酸抑制作用的lysC＊的菌株，預(yù)計(jì)能夠在含有大量賴氨酸的基本培養(yǎng)基中生長。利用這一現(xiàn)象，選擇其生長對賴氨酸或S-2-氨基乙基半胱氨酸(AEC，賴氨酸的類似物)有抗性的菌株，即那些所帶的質(zhì)粒含有解除抑制作用的lysC＊的菌株。
(2-2)反饋抑制抗性lysC突變株(lysC＊)選擇條件的研究先將pLYSC1和pLYSC2分別摻入大腸桿菌GT3中使其轉(zhuǎn)化，得到兩種不同的轉(zhuǎn)化株，在含有賴氨酸或AEC的M9瓊脂平板基本培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。另外，測定賴氨酸或AEC的生長抑制濃度，并研究選擇lysC＊的條件。
如表2所示，很清楚，就pLYSC2而言，表達(dá)量被lacZ啟動(dòng)子擴(kuò)增，因此甚至野生型lysC也對相當(dāng)高濃度的賴氨酸或AEC有抗性，但是由于pLYSC1的lysC基因就lacZ啟動(dòng)子而言是反義的，而且缺乏該lysC基因本身的啟動(dòng)子，所以表達(dá)量不高，在較低濃度的賴氨酸或AEC下生長受到抑制(加入約0.2mM的賴氨酸或AEC使生長完全受到抑制。表中的“+”表示轉(zhuǎn)化株生長，“-”表示不生長)。發(fā)現(xiàn)同時(shí)加入高絲氨酸和DAP使這種生長抑制作用得到恢復(fù)。
表2帶有l(wèi)ysC質(zhì)粒的完全缺乏AK的GT3株的生長與添加的賴氨酸或賴氨酸類似物AEC之間的關(guān)系 M9瓊脂培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)2天+生長;±部分生長;-不生長于是，用pLYSC1進(jìn)行突變引入實(shí)驗(yàn)，在M9基本培養(yǎng)基中加入10mM賴氨酸或0.2mM AEC制得用于選擇lysC＊的選擇培養(yǎng)基。
(2-3)誘變處理羥胺是一種化學(xué)誘變劑，它通過將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為N4-羥基胞嘧啶而誘導(dǎo)C→T突變。為在質(zhì)粒中引入突變，采用兩種方法，一種是直接用羥胺處理質(zhì)粒的體外誘變處理法，另一種是提供多種突變(即C→T以外的突變)的體內(nèi)誘變處理法，后一種方法是用亞硝基胍(NTG)處理帶有質(zhì)粒的細(xì)胞，再提取質(zhì)粒。
(2-4)用羥胺進(jìn)行體外誘變處理取一份2μg的DNA，在下表3所示的反應(yīng)液即0.4M羥胺中，于75℃下處理1-4小時(shí)。處理過的DNA用玻璃粉純化，然后用于轉(zhuǎn)化到完全缺乏AK的GT3株中，將該菌株涂布到完全培養(yǎng)基(L-液體培養(yǎng)基;1%細(xì)菌胰胨、0.5%酵母提取物、0.5% NaCl、1.5%瓊脂)上以形成菌落。將所形成的菌落復(fù)制到(2-1)得到的選擇培養(yǎng)基上。轉(zhuǎn)化株出現(xiàn)的比例和突變比例各不相同，如圖3所示。處理4小時(shí)時(shí)，突變株的產(chǎn)率為0.5-0.8%，這是一個(gè)相當(dāng)高的數(shù)值。
表3反應(yīng)液組成0.1M KH2PO4-1mM EDTA(pH6.0) 100μl1M羥胺-1mM EDTA(pH6.0) 80μlDNA 2μg水 余量總量 200μl(2-5)用亞硝基胍(NTG)進(jìn)行體內(nèi)誘變處理用pLYSC1轉(zhuǎn)化大腸桿菌MC1061，將細(xì)胞直接用NTG進(jìn)行處理。將處理過的細(xì)胞培養(yǎng)過夜以使突變固定，然后從細(xì)胞中提取質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化到GT3中，以與(2-4)中相同的方式進(jìn)行篩選，得到賴氨酸抗性(lysR)或AEC抗性(AECR)突變株。該處理概述于下面的表4。
表4處理概述(1)在2×TY培養(yǎng)基(1.6%細(xì)菌胰胨、1%酵母提取物、0.5%NaCl)中培養(yǎng)含目標(biāo)質(zhì)粒的細(xì)胞，然后在660nm處的O.D.約為0.3時(shí)收集細(xì)胞。
(2)用TM緩沖液洗滌。
(3)懸浮于NTG溶液(TM緩沖液中的0.2mg/ml溶液)中，然后在37℃下處理0-90分鐘。
(4)用TM緩沖液和2×TY培養(yǎng)基洗滌，然后在2×TY培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜并固定突變。
(5)從細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化GT3菌株，篩選重組菌株。
TM緩沖液的組成如下Tris 50mM馬來酸 50mM(NH4)2SO41g/lMgSO4·7H2O 0.1g/lCa(NO3)25mg/lFeSO4·7H2O 0.25mg/l用NaOH調(diào)至pH6.0。
實(shí)施例3lysC＊基因的分離(3-1)將實(shí)施例2中得到的總共180個(gè)候選菌株(其中經(jīng)羥胺處理的48個(gè)菌株，經(jīng)NTG處理的132個(gè)菌株)再次點(diǎn)樣到選擇培養(yǎng)基上，并確認(rèn)AEC或賴氨酸抗性的存在，得到153個(gè)菌株。根據(jù)培養(yǎng)基中氨基酸積累方式的不同，將這153個(gè)菌株分成14組，每組選擇出一個(gè)代表菌株進(jìn)行AK活性測定。由于用羥胺處理的突變株和用NTG處理的突變株之間沒有大的差別，所以后續(xù)的實(shí)驗(yàn)在這兩者之間不加區(qū)別。
(3-2)天冬氨酸激酶活性的測定用完全缺乏AK的GT3菌株作為宿主，分別用上述的14個(gè)突變pLYSC1(稱為pLYSC1＊系列)和野生pLYSC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化該宿主，然后從轉(zhuǎn)化株中制備無細(xì)胞提取液，測定AK Ⅲ的酶活性。測定酶活性的方法如下。
(3-3)AK Ⅲ活性的測定方法(3-3-1)制備粗制酶溶液的方法(1)在2×TY培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，然后在660nm處O.D.約為0.8時(shí)收集細(xì)胞。
(2)在0℃下用0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ-巰基乙醇洗滌。
(3)超聲破碎細(xì)胞(0℃，100瓦，30秒×4次)。
(4)在0℃下以33krpm離心1小時(shí)，然后在上清液中加入硫酸銨至80%飽和。
(5)離心，然后把沉淀溶于(2)的緩沖液中，并于-20℃下保存。
(3-3-2)測定酶活性的方法測定酶活性的方法為Stadtman等人的方法(Stadtman，E.R.，Cohen，G.N.，Lebras，G.和Robichon-Szulmajster，H.，J.Biol.Chem.，2362033，1961)。
反應(yīng)液的組成如下表5所示。
表5反應(yīng)液組成反應(yīng)混合物-10.3ml羥胺溶液-20.2ml0.1M天冬氨酸鉀(pH7.0) 0.1ml酶溶液水 余量總量 1.0ml＊19ml 1M Tris-HCl(pH8.1)+0.5ml 0.3M MgSO4+5ml 0.2M ATP(pH7.0)＊2臨用前用KOH中和過的8M羥胺不含天冬氨酸鉀的反應(yīng)液定義為空白。
測定方法概述于下表6。
表6測定方法概述(1)將反應(yīng)液于27℃下保溫45分鐘。
(2)加入FeCl3溶液(0.4ml 2.8N HCl+0.4ml 12% TCA+0.7ml 5% FeCl3·6H2O/0.1N HCl)以生色。
(3)離心，然后測定上清液在540nm處的光吸收值(A540)。
活性以1分鐘內(nèi)生成的異羥肟酸的量表示。
1單位＝1微摩爾/分。摩爾吸光系數(shù)＝600。
結(jié)果示于圖4。
(3-4)賴氨酸依賴性抑制作用解除的程度為測定AK酶活性，在酶反應(yīng)液中以各種不同濃度加入賴氨酸，并測定賴氨酸依賴性抑制的水平。賴氨酸對野生型AK Ⅲ的抑制很強(qiáng)，例如，約0.45mM賴氨酸產(chǎn)生50%抑制，5mM賴氨酸產(chǎn)生約100%抑制(圖4)。
對比之下，這里得到的突變型AK Ⅲ表現(xiàn)出不同程度的解除，但所有14個(gè)突變型的賴氨酸依賴性抑制作用都有一定程度的解除(圖4和表7)。具體地說，在第24、80、117、169和172號(hào)的情況下，甚至100mM賴氨酸也幾乎未觀察到抑制作用，50%抑制濃度為200倍或更高。
另外，即使把細(xì)胞生長條件和樣品制備的影響考慮進(jìn)去，比活(即單位蛋白的酶活性)也等于或高于野生型的比活，并且沒有觀察到由于引入突變而使活性下降的問題(表7)。由此假定，AK Ⅲ的活性位點(diǎn)和負(fù)責(zé)受賴氨酸調(diào)節(jié)的位點(diǎn)是彼此獨(dú)立的。
表7中，抑制解除程度以100mM賴氨酸存在下的活性相對于無賴氨酸反應(yīng)液活性的百分比表示，熱穩(wěn)定性以在55℃下處理1.5小時(shí)后剩余活性相對于未加熱時(shí)活性的百分比表示。
表7賴氨酸抑制作用解除程度和熱穩(wěn)定性 (3-5)熱穩(wěn)定性在提高某些酶的活性水平以對其進(jìn)行改進(jìn)時(shí)，重要的是要使這些酶穩(wěn)定保持在細(xì)胞內(nèi)。由于蛋白酶在細(xì)胞內(nèi)外活性的差異及保存用緩沖液的影響，這些酶的測定優(yōu)選在體內(nèi)進(jìn)行，但在這里為方便起見，在體外測試熱穩(wěn)定性作為每種突變型AK Ⅲ的參數(shù)。
作為對AK Ⅲ失活溫度進(jìn)行各種測試的結(jié)果，將溫度設(shè)定在56℃，并測定處理90分鐘后的活性剩余率。如上表7所示，有半數(shù)的突變型優(yōu)于野生型。一般來說，突變蛋白往往不如其野生型穩(wěn)定，但這里得到的某些突變型AK Ⅲ的穩(wěn)定性卻高于野生型，其中有許多都被認(rèn)為是很有用的，可作為實(shí)際生產(chǎn)L-蘇氨酸的酶。
實(shí)施例4用引入了lysC＊的菌株發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸(4-1)在迄今已知的產(chǎn)蘇氨酸大腸桿菌中，B-3996株的蘇氨酸生產(chǎn)能力最高。這里決定使用B-3996株作為宿主來評(píng)定lysC＊。B-3996株已保藏在工業(yè)微生物遺傳和選擇研究所，保藏號(hào)為BKⅡM(VKPM)B-3996。另外，作為欲評(píng)定的lysC＊，取抑制解除程度和比活不同的6種類型(表7中第24、43、60、80、149和167號(hào))用于下列實(shí)驗(yàn)。
首先，為提高lysC＊的表達(dá)程度，將pLYSC1＊上的上述6種lysC＊分別轉(zhuǎn)移到載體pHSG399(Takara Shuzo公司的產(chǎn)品)的lacZ啟動(dòng)子的下游，以造成每個(gè)lysC＊的倒位插入。以這種方式得到的新質(zhì)粒統(tǒng)稱為pLLC＊系列(圖5)。已插入了含上述80號(hào)和167號(hào)lysC＊的質(zhì)粒的大腸桿菌HB101株，分別稱為AJ12750和AJ12751，這兩個(gè)菌株最早于1992年9月1日保藏在國立生物科學(xué)和人類工程研究所(日本)。AJ12750的保藏號(hào)為FERM P13136(于1993年11月4日變更為國際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-4462)，AJ12751的保存藏號(hào)為FERM13137(于同一天變更為國際保藏，保藏號(hào)為FERM BP-4463)。其余菌株未保藏，但由于已發(fā)現(xiàn)了每種lysC＊的所有突變點(diǎn)(如下所述)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易按Maniatis等人的方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，121，1989)由上述保藏的細(xì)菌回收質(zhì)粒，進(jìn)而按定位誘變法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，Maniatis，T.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1583，1989)獲得目標(biāo)靜止lysC＊基因。用常規(guī)方法將這些質(zhì)粒插入到B-3996菌株中以進(jìn)行評(píng)定。
用下表8所示的下列培養(yǎng)基(組分A、B和C已分別滅菌)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為38小時(shí)，溫度為37℃，并伴以114-116rpm的攪拌。
表8蘇氨酸生產(chǎn)培養(yǎng)基(g/l)A: (NH4)2SO416KH2PO41MgSO4·7H2O 1FeSO4·7H2O 0.01MnSO4·5H2O 0.01酵母提取物(Difco) 2L-Met 0.5用KOH調(diào)至pH7.0，于115℃高壓滅菌10分鐘(16/20體積)。
B20%葡萄糖，于115℃高壓滅菌10分鐘(4/20體積)。
C藥典級(jí)CaCO3，于180℃高壓滅菌2天(30g/l)。
D抗生素(100μg/ml鏈霉素、5μg/ml卡那霉素)。
(4-2)lysC＊的評(píng)定用6個(gè)pLLC＊系列質(zhì)粒中的每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B-3996株，每個(gè)轉(zhuǎn)化株都分別在加1g/l賴氨酸和不加賴氨酸兩種條件下培養(yǎng)。作為對照，制備帶有和不帶有含野生型lysC的質(zhì)粒(pLLC1)的宿主B-3996株。
結(jié)果示于下表9。在該表中，括號(hào)中的數(shù)值為每消耗1克糖的賴氨酸產(chǎn)量(克)與在不加賴氨酸條件下培養(yǎng)B-3996時(shí)(對照)得到的每消耗1克糖的賴氨酸產(chǎn)量(克)之間的比例。這意味著后一產(chǎn)量指定為1.00。賴氨酸敏感度定義為(加賴氨酸時(shí)單位耗糖量的賴氨酸產(chǎn)量)/(不加賴氨酸時(shí)單位耗糖量的賴氨酸產(chǎn)量)。就B-3996株而言，在加賴氨酸培養(yǎng)物中觀察到的單位耗糖量的產(chǎn)量下降，按不加賴氨酸的培養(yǎng)物中觀察到的數(shù)值計(jì)算，約為0.74。但是，在已引入lysC＊的菌株(例如B-3996/pLLC＊149)的情形，在加賴氨酸培養(yǎng)物中觀察到的單位耗糖量產(chǎn)量的下降，按不加賴氨酸培養(yǎng)物中觀察到的數(shù)值計(jì)算約為0.96。由此推斷，由lysC編碼的AK Ⅲ對蘇氨酸的生物合成有貢獻(xiàn)，加入賴氨酸對AK Ⅲ活性的抑制作用又與對蘇氨酸生物合成的抑制作用相關(guān)。使用本發(fā)明的lysC＊時(shí)，這一現(xiàn)象消失。
表9 另外，關(guān)于無賴氨酸培養(yǎng)物的蘇氨酸產(chǎn)量，很清楚，帶野生lysC質(zhì)粒的菌株所達(dá)到的生產(chǎn)率，此不帶該質(zhì)粒的B-3996株有改進(jìn)，而帶突變lysC＊菌株的生產(chǎn)率進(jìn)一步提高(在80號(hào)的情形約為宿主生產(chǎn)率的1.3倍)。這些結(jié)果表明，AK Ⅲ是B-3996株蘇氨酸生產(chǎn)過程中的限速因子之一。使用已引入突變lysC＊的細(xì)胞時(shí)，無賴氨酸培養(yǎng)達(dá)到的產(chǎn)量比用已引入野生lysC的細(xì)胞達(dá)到的產(chǎn)量有改進(jìn)。據(jù)認(rèn)為，這是由于后者細(xì)胞本身生物含成的賴氨酸抑制了野生型AK Ⅲ。
(4-3)突變lysC＊質(zhì)粒的穩(wěn)定化從B-3996株中提取質(zhì)粒pVIC40，在其BamHI位點(diǎn)以兩個(gè)方向摻入lysC＊，制得如圖6所示的一些質(zhì)粒。從B-3996株中收集pVIC40的方法前已述及。選擇具有高水平蘇氨酸產(chǎn)量的80號(hào)作為lysC＊，選擇43號(hào)供與其作比較，得到4個(gè)不同的質(zhì)粒，即，pVICLC＊80A、pVICLC＊80B、pVICLC＊43A和pVICLC＊43B。
通過清除B-3996株而新制備B-399株(除去了pVIC40的B-3996株)用作宿主。清除方法是用無鏈霉素的L-液體培養(yǎng)基相對于B-3996株培養(yǎng)液重復(fù)100倍稀釋三次。這里的培養(yǎng)溫度為40℃。在以這種方式得到的B-399株中，分別引入4個(gè)摻有l(wèi)ysC＊的質(zhì)粒中的pVICLC＊80A和pVICLC＊43A，并進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果示于表10。引入了pVICLC＊80A或pVICLC＊43A的菌株所達(dá)到的產(chǎn)量，比用作對照的pVIC40轉(zhuǎn)化株(B-3996)有所提高(pVICLC＊80A為1.10倍，pVICLC＊43A為1.07倍)。
表10 據(jù)認(rèn)為，產(chǎn)量提高的程度比(4-2)的結(jié)果有所有下降的原因是由于換用pVIC40作載體而造成拷貝數(shù)較低，但生長情況與B-3996株相同，質(zhì)粒也穩(wěn)定保持。
(4-4)突變lysC＊基因摻入染色體利用同源重組現(xiàn)象，通過在產(chǎn)蘇氨酸B-3996的染色體上定靶野生lysC基因而在該B-3996中引入突變型lysC＊。這里所用的方法是經(jīng)過修改的Russel等人的方法(Russel，M.和Model，P.，J.Bacteriol.，1591034，1984)。
如果宿主是大腸桿菌突變株，即MM382株(polAts，可從美國大腸桿菌遺傳原種中心得到)，則質(zhì)粒pHSG399可以在37℃(許可溫度)下復(fù)制，但不能在高溫如42℃(非許可溫度)下復(fù)制。利用這一事實(shí)來進(jìn)行同源重組。
首先，在可以復(fù)制的溫度37℃下，將pLLC43＊和pLLC80＊分別引入作為宿主的突變株MM383中，分別得到轉(zhuǎn)化株MM383/pLLC＊43和MM383/pLLC＊80。在42℃下培養(yǎng)這些轉(zhuǎn)化株，并選擇出那些缺乏質(zhì)粒但仍對氯霉素有抗性的轉(zhuǎn)化株。質(zhì)粒已摻入這些菌株的染色體中。所得到的菌株分別命名為MM383-C43和MM383-C80。用P1噬菌體感染這些菌株，并制備噬菌體溶液用于感染B-3996株。利用氯霉素抗性作標(biāo)記，選擇出那些染色體上已轉(zhuǎn)導(dǎo)有l(wèi)ysC＊的菌株，這些菌株分別命名為B-3996-C43和B-3996-C80。
在與(4-1)相同的條件下進(jìn)行B-3996-C-43和B-3996-C-80的培養(yǎng)，得到下表11所示的結(jié)果。觀察到蘇氨酸產(chǎn)量提高約4%。
表11
實(shí)施例5野生lysC和突變lysC＊堿基順序的測定(5-1)使用“ABI 373A型”DNA測序儀(得自ABI公司)，用常規(guī)方法測定野生lysC基因的堿基順序。結(jié)果列在所附順序表中的1號(hào)順序中。據(jù)發(fā)現(xiàn)，該順序有6個(gè)堿基與大腸桿菌K-12JC411的已公開的lysC堿基順序(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patta，J.C.，J.Biol.Chem.，2611052，1986)不同(導(dǎo)致兩個(gè)氨基酸殘基的改變)。這6個(gè)不同據(jù)認(rèn)為是由于所用的菌株不同而造成的。
(5-2)反饋抑制抗性突變lysC＊的堿基順序按與(5-1)相同的方式測定實(shí)施例3中所研究的14種lysC＊的堿基順序，清楚地找到了突變點(diǎn)。結(jié)果示于表12。在這14種lysC＊中，有兩對完全相同，因此實(shí)際上有12種突變體。第149、150、156、158、167、169和172號(hào)突變體是用羥胺處理得到的，第24、43、48、60、80、117和126號(hào)突變體是用NTG處理得到的。但是突變形式均為C→T或G→A，其中G→A突變是由于互補(bǔ)鏈上的C→T突變造成的。
表12lysC＊突變點(diǎn)的鑒定
(a)H羥胺處理;NNTG處理(5-3)與解除反饋抑制有關(guān)的結(jié)構(gòu)域的鑒定C末端有大量的突變，這些突變在圖7的A結(jié)構(gòu)域(從318位Met殘基到325位Leu殘基)和B結(jié)構(gòu)域(從345位Ser殘基到352位Thr殘基)特別集中(見表12的“突變點(diǎn)”一欄)。大腸桿菌除lysC(AK Ⅲ)外還有兩種AK，即thrA(AKI-HDI)和metL(M)(AKⅡ-HDⅡ)。突變lysC＊有兩個(gè)與這兩種AK有高度同源性的位置，這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是AK的活性中心(Cassan，M.，Parsot，C.，Cohen，G.N.和Patte，J.C.，J.Biol.Chem.，2611052，1986)。C末端的A和B結(jié)構(gòu)域在這些共有結(jié)構(gòu)域之外，因此A和B結(jié)構(gòu)域很可能是AK Ⅲ特有的受賴氨酸控制的結(jié)構(gòu)域。具體地說，具有高度抑制解除作用的第24/80、172、169和117號(hào)在B結(jié)構(gòu)域有一些突變，據(jù)認(rèn)為這一事實(shí)很重要。在這12種中，有10種或者在A結(jié)構(gòu)域有突變，或者在B結(jié)構(gòu)域有突變。60號(hào)和158號(hào)是例外，其抑制解除作用和熱穩(wěn)定性水平都很低(上表7)，據(jù)認(rèn)為這是由于突變造成酶整體結(jié)構(gòu)改變而使抑制部分解除的結(jié)果。另外，在有多個(gè)突變點(diǎn)的突變型的情形，存在著哪個(gè)突變點(diǎn)有效的問題，根據(jù)與在同一位點(diǎn)只有一個(gè)突變的突變型所作的比較，可以作出下列解釋。
(1)126號(hào)(1個(gè)點(diǎn))、43號(hào)(2個(gè)點(diǎn))和149號(hào)(2個(gè)點(diǎn))126號(hào)在A結(jié)構(gòu)域中的突變點(diǎn)是這三個(gè)突變型所共有的，而149號(hào)和126號(hào)的抑制解除程度相同，43號(hào)中更多的突變點(diǎn)造成頗為相反的效應(yīng)。這便引出了如下的假定126號(hào)在A結(jié)構(gòu)域中的突變點(diǎn)是造成抑制解除作用的突變點(diǎn)。
(2)24/80號(hào)(1個(gè)點(diǎn))和169號(hào)(2個(gè)點(diǎn))在169號(hào)的兩個(gè)突變點(diǎn)中，B結(jié)構(gòu)域中的突變點(diǎn)與24/80號(hào)中的突變點(diǎn)相同。二者的抑制解除程度都達(dá)到100%，因此，24/80號(hào)中的突變點(diǎn)就足夠了。
(3)150號(hào)(1個(gè)點(diǎn))和172號(hào)(2個(gè)點(diǎn))150號(hào)在A結(jié)構(gòu)域中有一個(gè)突變點(diǎn)，而172號(hào)有兩個(gè)突變點(diǎn)，在A結(jié)構(gòu)域(與150號(hào)相同)和B結(jié)構(gòu)域中各有一個(gè)。172號(hào)的抑制解除程度更強(qiáng)，由此可見，A結(jié)構(gòu)域和B結(jié)構(gòu)域都對抑制解除作用有貢獻(xiàn)。
以上述方式，本發(fā)明人在A結(jié)構(gòu)域(如以氨基酸殘基表示則為從318位Met殘基到325位Leu殘基)和B結(jié)構(gòu)域(從345位Ser殘基到352位Thr殘基)中鑒定出了與賴氨酸依賴性天冬氨酸激酶活性抑制作用的解除有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。然而，本發(fā)明人尚未得出以下結(jié)論，即，賴氨酸依賴性天冬氨酸激酶活性抑制作用的解除只發(fā)生于某些特定氨基酸殘基突變?yōu)槟承┢渌被釟埢那闆r。例如，表12表明，當(dāng)323位甘氨酸殘基變?yōu)樘於彼釟埢鶗r(shí)便發(fā)生反饋抑制的解除，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很清楚，即使用谷氨酸殘基代替天冬氨酸殘基來置換323位甘氨酸殘基，也會(huì)發(fā)生同樣的解除作用。這是因?yàn)?，許多具有相似結(jié)構(gòu)的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸，稱為同源氨基酸，據(jù)認(rèn)為，某個(gè)氨基酸與其同源氨基酸交換不會(huì)使蛋白功能發(fā)生任何大的變化(同源氨基酸表見Protein Engineering第31頁，CMCCo.，1985)。
常常觀察到某個(gè)氨基酸與非同源氨基酸交換具有與同源氨基酸交換相同的效應(yīng)。相反，某個(gè)氨基酸與其同源氨基酸交換有時(shí)也使蛋白功能發(fā)生劇烈變化(Estell，D.A.，Graycar，T.P.和Wells，J.A.，J.Biol.Chem.，2606518，1988;Schultz，S.C.和Richards，J.H.，Procedure.Natl.Acad.Sci.USA，831588，1986;Yutani，K.等，J.Biol.Chem.，26213429，1987;Yutani，K.等，Procedure.Natl.Acad.Sci.USA，844441，1987;Nishiyama，M.等，J.Biol.Chem.，26614294，1991).
另外，根據(jù)本發(fā)明，A和B結(jié)構(gòu)域中的某些氨基酸殘基沒有改變，但由于蛋白功能是在結(jié)構(gòu)域單元的基礎(chǔ)上確定的，所以可以合理地推斷，在這些結(jié)構(gòu)域中引入目前尚未引入的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基突變，將觀察到反饋抑制的解除。事實(shí)上，這樣的例子已有許多報(bào)道(Furuya，H.等，Biochemistry，286848，1989;Furuya，H.等，Biochem.Biophys.Research.Commun.，160669，1989;Cunningham，B.C.和Wells，J.A.，Science，2441081，1989).
簡言之，本發(fā)明在特征上是建立在本發(fā)明人對與反饋抑制有關(guān)的結(jié)構(gòu)域所作出的發(fā)現(xiàn)基礎(chǔ)上的。實(shí)施例中只公開了結(jié)構(gòu)域中的幾種突變形式，但如上所述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚，其他形式的突變可能會(huì)產(chǎn)生同樣的效果。所以，這些突變也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如上所述，現(xiàn)已獲得了充分解除了賴氨酸反饋抑制作用的埃希氏桿菌來源的AK Ⅲ基因。把這些基因引入蘇氨酸生產(chǎn)菌中，便有可能得到蘇氨酸產(chǎn)量大大優(yōu)于先有技術(shù)的其他蘇氨酸生產(chǎn)菌。這些蘇氨酸生產(chǎn)菌的成功應(yīng)用，提供了一種大大優(yōu)于常規(guī)方法的L-蘇氨酸發(fā)酵生產(chǎn)方法。
順序表1號(hào)順序順序長度2147順序類型核酸鏈數(shù)雙鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型基因組DNA原始來源生物體大腸桿菌菌株MC1061特征特征關(guān)鍵詞-35 signal位置242..249特征測定方法S特征特征關(guān)鍵詞-10 signal位置265..273
特征測定方法S特征特征關(guān)鍵詞primer bind位置536..555特征測定方法E特征特征關(guān)鍵詞primer bind位置2128..2147特征測定方法E特征特征關(guān)鍵詞RBS位置575..578特征測定方法S特征特征關(guān)鍵詞mat peptide位置584..1930特征測定方法S特征特征關(guān)鍵詞terminator位置1941..1968特征測定方法S順序描述


2號(hào)順序順序長度20順序類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，即合成DNA順序描述CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG3號(hào)順序順序長度18順序類型核酸鏈數(shù)單鏈拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性分子類型其他核酸，即合成DNA順序描述GAATTCCTTT GCGAGCAG
權(quán)利要求
1.一種含有一種基因的DNA，所述基因編碼來源于埃希氏桿菌(Escherichia)的天冬氨酸激酶Ⅲ，并在編碼區(qū)中有一個(gè)解除賴氨酸對所述天冬氨酸激酶Ⅲ反饋抑制作用的突變。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中解除賴氨酸對天冬氨酸激酶Ⅲ反饋抑制作用的突變位于天冬氨酸激酶Ⅲ的A結(jié)構(gòu)域或B結(jié)構(gòu)域上。
3.權(quán)利要求1的DNA，其中解除賴氨酸對天冬氨酸激酶Ⅲ反饋抑制作用的突變選自順序表1號(hào)順序中323位Gly被Asp置換的突變;323位Gly被Asp置換，408位Gly被Asp置換的突變;34位Arg被Cys置換，323位Gly被Asp置換的突變;325位Leu被Phe置換的突變;318位Met被Ile置換的突變;318位Met被Ile置換，349位Val被Met置換的突變;345位Ser被Leu置換的突變;347位Val被Met置換的突變;352位Thr被Ile置換的突變;352位Thr被Ile置換，369位Ser被Phe置換的突變;164位Glu被Lys置換的突變;417位Met被Ile置換，419位Cys被Tyr置換的突變。
4.一種重組DNA，其中權(quán)利要求1、2和3中任一項(xiàng)的DNA與能夠在埃希氏桿菌中自主復(fù)制的載體DNA相連。
5.一種屬于埃希氏桿菌屬的微生物，該微生物已通過在其細(xì)胞中引入權(quán)利要求4的重組DNA而被轉(zhuǎn)化。
6.權(quán)利要求5的微生物，該微生物已通過在其染色體DNA中摻入權(quán)利要求1、2和3中任一項(xiàng)的DNA而被轉(zhuǎn)化。
7.一種生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，該方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求5的微生物，從而在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并積累L-蘇氨酸，并從所述培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。
全文摘要
含有一種基因的DNA，該基因編碼來源于埃希氏桿菌的天冬氨酸激酶III，并在編碼區(qū)中有一個(gè)解除賴氨酸對天冬氨酸激酶III反饋抑制作用的突變；重組DNA，其中上述DNA與能在埃希氏桿菌中自主復(fù)制的載體DNA相連，屬于埃希氏桿菌屬的微生物，該微生物已通過在其細(xì)胞中引入上述重組DNA而被轉(zhuǎn)化；利用上述微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
文檔編號(hào)C12N9/12GK1107179SQ9410200
公開日1995年8月23日 申請日期1994年2月15日 優(yōu)先權(quán)日1992年11月10日
發(fā)明者佐野孝之輔, 兒島宏之, 尾川由理 申請人:味之素株式會(huì)社