專利名稱:受體選擇性淋巴毒素衍生物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬蛋白質工程和制藥領域，具體涉及一種受體選擇性淋巴毒素衍生物及其制法和用途。
背景技術：
淋巴毒素a (LTa)，也被稱為TNFii，是TNF超家族成員之一，是一類重要的細胞因子。與TNF相比，LT α的結構和功能與TNF相似，具有相同的受體TNFRI、TNFRII, LTa的抑制的腫瘤細胞類型略少于TNF，對某些腫瘤細胞的殺傷作用也不盡相同。
LT α由有活性的淋巴細胞產生，是25KD的分泌型糖蛋白，LT前體含有205個氨基酸殘基，其中34個氨基酸殘基編碼信號肽，成熟的LT有171個氨基酸殘基(18kD) (SEQID NO 3)，沒有二硫鍵，第62位為N-連接的糖基化位點(糖基化對其細胞毒活性是非必要的)，LTa與TNFRI、TNFRII的作用位點集中在三聚體底端的兩個套索區(qū)。LTa同三聚體與TNFRI和TNFRII作用，從而引發(fā)信號傳導。
TNFRI和TNFRII在細胞分布、分子量、結合配基的親和力和介導的生物學活性等方面都不相同。TNFRI和TNFRII存在于除紅細胞外的所有類型的細胞中，TNFRI的存在更普遍。TNFRI受體主要表達于上皮細胞，TNFRII受體主要表達于骨髓細胞，大多數(shù)的細胞都表達這兩種受體，但比例有所不同。TNFRI由455個氨基酸組成，TNFRII由461個氨基酸組成，都是I型跨膜糖蛋白，均由信號肽、胞外結構區(qū)、跨膜結構區(qū)和胞漿結構區(qū)組成。TNFRI 胞漿區(qū)326-413位為死亡區(qū)域(death domain，DD)。TNFRI可通過DD結合TNFR相關蛋白， 傳導細胞毒信號，引發(fā)細胞調亡。TNFRII的胞漿結構區(qū)沒有DD，TNFRII所傳遞的信號主要局限于免疫系統(tǒng)細胞中，與病毒感染的免疫反應高度相關。TNFRI和TNFRII的胞內部分的同源性極低，也說明它們有著不同的信號轉導路徑，有著不同的生物功能。
兩種受體介導的TNF的生物活性有很大的差異。鼠的TNFa與鼠的TNFRI和TNFRII 的結合力相似，然而人的TNi^a只結合鼠的TNFRI，不結合鼠的TNFRII。在致死實驗中，人的 TNFa比鼠的TNFa顯示了較低的致死率，這提示TNFRII對全身毒性有很大的影響。
研究證明TNFRII信號對胰島素信號傳導有抑制作用，用抗TNFRII抗體阻斷 TNFRII信號會緩解該信號對胰島素信號傳導的抑制作用。
TNFRII信號還在調節(jié)血管通透性方面有重要作用?？筎NFRII抗體可以抑制成神經細胞瘤細胞的增殖，同時對TNF的細胞殺傷活力無影響。在鼠實驗中發(fā)現(xiàn)，TNFRII參予順鉬介導的腎損傷。
通過改造TNF與受體的結合區(qū)域，獲得對TNFRI具有選擇性的TNF突變體，從而即保持其對腫瘤細胞的細胞殺傷活性，同時減輕了 TNFRII引起的毒副作用，得到了很好的效果。LT與TNF體內、體外的抗腫瘤活性不相上下，且毒性更小，半衰期更長，此外LT還有明顯的化療增敏和放療增敏作用。因此，LT治療腫瘤的臨床應用前景可能會比TNF更好。缺失LT α的N端序列1-27的淋巴毒素衍生物LT α 28_171，目前處于II期臨床階段，顯示出明確的抗腫瘤作用。然而LT仍然具有一定的毒副作用，治療指數(shù)不高，而且對某些腫瘤細胞的殺傷活力不高，這些都限制了淋巴毒素在醫(yī)藥領域的應用。
研究證明LT的毒副作用與TNFRII信號相關，TNFRII信號可以激活NFK B，而 NF κ B是重要的炎癥因子，直接引起炎癥反應，同時還能夠激活多重耐藥基因，影響藥物對腫瘤細胞的療效。TNFRII也能夠與TNFRI競爭配體，導致LT對TNFRII高表達的腫瘤細胞不敏感，抑制了 LTa的細胞毒活性。
目前，臨床上迫切需要具有TNFRI選擇性的淋巴毒素，即保持了淋巴毒素的腫瘤細胞殺傷活性，同時降低了 LT的毒副作用；使得LT對TNFRII高表達的腫瘤細胞敏感度提高，能夠應用于更多種類的腫瘤治療；在LT與化療藥物聯(lián)合治療中，會有更好的治療效果， 更低的毒副作用。
然而，目前尚無令人滿意的對TNFRI具有高選擇性的淋巴毒素。因此，本領域迫切需要開發(fā)新的對TNFRI具有高選擇性且對TNFRII的選擇性極低的淋巴毒素突變體。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的就是提供一種TNFRI具有高選擇性且對TNFRII的選擇性極低的淋巴毒素突變體。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種受體選擇性淋巴毒素突變體，所述突變體在對應于淋巴毒素天然序列中106-113位的106-113套索結構中，第106、107、109、110、111、 112、或113位氨基酸殘基至少一個氨基酸被替換，和/或在106-113套索結構中插入至少
一個氨基酸，
附加條件是108位Y殘基不變；
并且所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人 TNFRII的結合能力之比大于10。
在另一優(yōu)選例中，該淋巴毒素突變體與TNFRI的結合能力與野生型LT與人TNFRI 的結合能力之比大于0.1。
在另一優(yōu)選例中，該淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力與野生型LT與人 TNFRII的結合能力之比小于0. 01。
在另一優(yōu)選例中，所述的氨基酸替換是106、107、109、110、111、112或113位氨基
酸被其它氨基酸所替換。在另一優(yōu)選例中，在106-113位插入1-3個氨基酸(優(yōu)選酸性或堿性氨基酸)。
在另一優(yōu)選例中，所述的突變體具有選自下組的突變
Q107E ；Q107D ；S106E ；S106D ；Q107R ；Q107N ；Q107E/S106E ；Q107E/S106D ；Q107D/ S106E ；或 Q107D/S106D。
在另一優(yōu)選例中，所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力之比大于100，更佳地大于200。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，它包含安全有效量的人淋巴毒素突變體和藥學上可接受的載體。
在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物還含有選自下組的化療劑⑶DP、5_FU、ADM、 VCR或其組合。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明人淋巴毒素突變體的用途，用于制備治療以下疾病的藥物(a)腫瘤；(b)體內寄生蟲病。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備TNFRI受體選擇性人淋巴毒素突變體的方法，在天然淋巴毒素序列108位殘基不變，替換106-113位中至少一個氨基酸；或者在 106-113位插入1-3個氨基酸。
在本發(fā)明的第五方面，提供了一種分離的DNA序列，它編碼本發(fā)明的淋巴毒素突變體。還提供了一種含有所述的DNA序列的表達載體。還提供了所述表達載體或所述的 DNA序列所轉化的宿主細胞。
在本發(fā)明第六方面，還提供了一種生產本發(fā)明的淋巴毒素突變體的方法，該方法包括步驟
(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述的宿主細胞，從而表達出所述的淋巴毒素突變體；
(b)分離純化出所述的淋巴毒素突變體。
在本發(fā)明的第七方面，提供了一種治療腫瘤或體內寄生蟲病的方法，包括步驟給需要治療的對象施用安全有效量的本發(fā)明的淋巴毒素突變體。


圖1顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷Jurkat (白血病)細胞。
圖2顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷Lovo (結腸癌)細胞。
圖3顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷MCF_7 (乳腺癌)細胞。
圖4顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷A549 (肺癌)細胞。
圖5顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷A375 (黑色素瘤)細胞。
圖6顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷Hela(宮頸癌)細胞。
圖7顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷U937 (組織細胞淋巴瘤)細胞。
圖8顯示了 rhLT突變體LT008體外殺傷HL-60 (白血病)細胞
圖9顯示了 rhLT突變體對化療藥物⑶DP的增敏作用。
圖10顯示了 rhLT突變體對化療藥物5_FU的增敏作用。圖11顯示了 rhLT突變體對化療藥物ADM的增敏作用。
圖12顯示了 rhLT突變體對化療藥物VCR的增敏作用。
具體實施方式
本發(fā)明人借助分子模擬技術研究LT與TNFRI、TNFRII的作用。經過廣泛而深入的研究發(fā)現(xiàn)，LT序列106-113位套索結構是LT與其受體TNFRI、TNFRII作用緊密但有差異的結構區(qū)域，通過在該套索結構區(qū)引入突變，可獲得具有TNFRI選擇性的LT突變體，受體阻斷實驗證實這些LT突變體與TNFRI的結合能力保持，而結合TNFRII的能力下降至少10倍， 通常至少20倍，較佳地至少100，更佳地至少1000倍，更佳地至少10000倍以上(如40000 倍)。細胞學試驗證實，這種TNFRI選擇性LT對多種腫瘤細胞殺傷活力優(yōu)于野生型rhLT， 對TNFRII高表達的腫瘤細胞敏感性增強，還能夠提高腫瘤細胞對化療藥物如CDDP等的敏感性。
如本文所用，術語“淋巴毒素”、“LT”、“LTa ”、“TNFi3 ”可互換使用，意指淋巴毒素LTa，包括來源于人、鼠、豬、馬或牛的淋巴毒素。較佳地，是人淋巴毒索。此外，淋巴毒素可以是具有天然野生型序列的LT，也可以是具有突變序列(相對野生型序列而言)的衍生型或重組的LT。天然的野生型人淋巴毒素TNF α的氨基酸序列示于SEQ ID Ν0:3中。
如本文所用，淋巴毒素的氨基酸編號基于野生型的人淋巴毒素(SEQ ID NO 3)。例如，106-113位的套索結構就是淋巴毒素天然序列即SEQ ID NO 3中106-113位的 SQYPFHVP，或相當于天然序列106-113的氨基酸的區(qū)域。
如本文所用，術語“TNFRI選擇性LT”或“本發(fā)明的LT突變體”指這樣的LT突變體，它與TNFRI的結合能力保持，而結合TNFRII的能力下降至少10倍，通常至少20倍，較佳地至少100倍，更佳地至少1000倍，更佳地至少10000倍以上(如40000倍)。本發(fā)明的 LT突變體可含有或不含有起始的甲硫氨酸。
如本文所用，Q107E表示107位Gln — Glu突變；Q107D表示107位Gln — Asp ； S106E 表示 106 位 Ser — Glu ；S106D 表示 106 位 Ser — Asp,依此類推。Q107E/S106E 表示 107位Gln — Glu突變且106位Ser — Glu,依此類推。
本發(fā)明的所述人淋巴毒素突變體包括編碼人淋巴毒素突變體的DNA、RNA或人淋巴毒素突變體蛋白。
在一優(yōu)選例中，通過氨基酸替換，對106-113區(qū)域結構進行微調。例如，用酸性氨基酸谷氨酸或天冬氨酸替換原有的氨基酸。
在另一優(yōu)選例中，通過在106-113區(qū)域，保持108位殘基不變，插入1_3個氨基酸。 例如，在106-113區(qū)域插入酸性或堿性氨基酸，尤其是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、天冬酰氨中的一個氨基酸。
在另一優(yōu)選例中，可用化學修飾方法，在106-113區(qū)域引入帶有負電荷的基團。
本發(fā)明的LT突變蛋白可以這樣進行制備根據(jù)已公開的人淋巴毒素的序列來合成引物，通過PCR法擴增出人淋巴毒素的編碼序列。也可以人工合成人TNFa的編碼序列。此外，可以對編碼序列進行堿基替換，以利于高表達(例如為了在大腸桿菌中表達，可以用編碼相同氨基酸的大腸桿菌優(yōu)選密碼子替換天然密碼子)。然后，以人淋巴毒素的DNA 序列，按本發(fā)明中指出的突變形式進行遺傳修飾，進行遺傳修飾的技術是本領域中已知的， 例如可參見“Mutagenesis :a Practical Approach，，，Μ. J. McPherson, Ed. , (IRL Press, Oxford, UK. (1991)，其中例如包括定點誘變、盒式誘變和聚合酶鏈反應(PCR)誘變。
在獲得了定點突變后的編碼本發(fā)明新突變蛋白的DNA序列之后，將其連入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養(yǎng)轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發(fā)明的新的突變蛋白。
在本發(fā)明中，可選用本領域已知的各種載體如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明新突變蛋白的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成蛋白表達載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動子控制序列的轉錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結合位點被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。較佳地，該宿主細胞是原核細胞，更佳地是大腸桿菌。
在本發(fā)明的一個實例中，制備本發(fā)明LT突變體的方法包括如下步驟
i.修飾LT的編碼序列，使其在保持天然淋巴毒素序列108位殘基不變的情況下， 用其它氨基酸替換106-113位中至少一個氨基酸；或者在106-113位插入1_3個氨基酸(如酸性或堿性氨基酸，優(yōu)選的是谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸、或天冬酰氨)；
ii.將上述改造的淋巴毒素基因克隆到表達質粒；
iii.用上述攜帶淋巴毒素基因的表達質粒轉化宿主細胞；
iv.培養(yǎng)被轉化的宿主細胞；
v.收集宿主細胞及培養(yǎng)液，分離純化淋巴毒素突變體。
本發(fā)明的LT突變體適用于治療腫瘤和體內寄生蟲病。代表性的腫瘤包括(但并不限于)白血病、組織細胞淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、肺癌、結腸癌、宮頸癌、黑色素瘤、膀胱癌。 代表性的體內寄生蟲病包括(但并不限于)弓漿蟲病。
本發(fā)明的淋巴毒素突變體可以單獨使用，也可與化療藥物等其他藥物聯(lián)合使用， 以便增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。
本發(fā)明還提供了藥物組合物，它包括有效量的一種或幾種本發(fā)明的LT突變蛋白， 以及至少一種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物時，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當賦形劑起稀釋劑作用時，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質。因此，組合物可以是片劑、丸劑、粉劑、、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、 水、等。制劑還可包括濕潤劑、乳化劑、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的藥物組合物中還含有額外的化療藥物，如⑶DP、5_FU、 ADM、VCR或其組合。
組合物可制成單元或多元劑型。各劑型包含為了產生所期望的治療效應而計算出預定量的活性物質，以及合適的藥劑學賦形劑。
本發(fā)明的LT突變體和藥物組合物的給藥方式沒有特別限制，可以通過口服、局部、非腸道給藥，例如肌肉、靜脈、或皮下注射，或吸入噴霧等方式給藥。優(yōu)選方式是靜脈注射給藥。
當本發(fā)明中的LT突變體以片劑或膠囊形式口服時，劑量對于平均體重60-70公斤的成人而言在約Iug到IOOOug范圍內，或以注射劑方式非腸道給藥，劑量約為Iug到 500ug，可以每天一次或分幾次給藥。藥物組合物的單元劑量通常包括范圍為lug-500ug的活性成分，典型地是 lug、5ug、10ug、25ug、50ug、100ug、200ug、300ug、400ug、500ug。
用本發(fā)明組合物治療具體病癥時所用的治療活性成分的數(shù)量和給藥方案，取決于多種因素，包括體重、年齡、性別、必然的醫(yī)學癥狀、疾病輕重、給藥途徑及頻率。這可以由醫(yī)務人員確定。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
通用方法
(a)突變體的評價
1.酶聯(lián)免疫吸附測定
TNFRI:Fc/TNFRII:Fc包被在酶標板上，將待測LT突變體稀釋至相同濃度上樣與之結合后，加兔抗LT的酶聯(lián)抗體，顯色讀數(shù)。
比較計算，與野生型LT進行比較，求百分率，推測LT突變體與受體的結合能力變化，初步篩選與TNFRI:Fc結合力強的突變體進行進一步評價。
2. rhLT突變體在體外對細胞系的細胞毒活性測定
L929細胞作為靶細胞，野生型LT做對照，測定rhLT突變體的體外殺傷腫瘤細胞活性。每單位活力指淋巴毒素誘導了 50%接種細胞調亡時用的淋巴毒素或淋巴毒素突變體的用里。
3.受體結合能力測定
L929細胞作為靶細胞，加入淋巴毒素或淋巴毒素衍生物進行殺傷，分別用TNFRI 和TNFRII中和淋巴毒素的殺傷作用，以TNFRI :Fc阻斷待測淋巴毒素突變體對細胞殺傷的IC50與阻斷野生型淋巴毒素對細胞殺傷的IC50之比定義為LT與TNFRI受體結合能力；以TNFRII :Fc阻斷待測淋巴毒素突變體對細胞殺傷的IC50與阻斷野生型淋巴毒素對細胞殺傷的IC50之比定義為LT與TNFRII受體結合能力。
(b)淋巴毒素突變體的腫瘤殺傷活性
在體外檢測各種淋巴毒素突變體對腫瘤細胞的殺傷活性，所使用的腫瘤細胞系包括Jurkat (白血病)、U937 (組織細胞淋巴瘤)、MKN_45/MGC_863 (胃癌)、MCF_7 (乳腺癌)、 A549 (肺癌)、A375 (黑色素瘤)、T-24 (膀胱癌)細胞等。
實施例1野生型LT、LT24_m、LT28_m的制備
表達載體構建
根據(jù)GENBANK中人LT序列(BAA00064)，委托上海生工生物技術服務公司分別全基因合成編碼LT成熟蛋白第1位至171位、第M位至171位、第觀位至171位的野生型LT、 LT24_171、LT28_171氨基酸序列，并克隆于pET3 (+)載體(購自 Novagen)的 NdeI 和 HindIII 位點上，獲得重組表達質粒 LT/pET32a(+)、LT24_171/pET32a (+)、LT28_171/pET32a (+)。
在大腸桿菌中的表達
重組表達質粒LT/pET32a (+)、LT24_171/pET32a (+)、LT28_171/pET32a (+)分別轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉化液涂布LB (含氨芐青霉素IOOng/ μ 1)平板。從轉化平板上挑取單克隆接種于ImL LB培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)池后，加入IPTG至終濃度0. 5mM，繼續(xù)培養(yǎng)池。取IOOul表達后的菌液離心收集菌體沉淀，加入50ul SDS樣品制備液，在12. 5%的 PAGE膠中進行電泳檢測。
蛋白純化
分另Ij取 LT/pET32a (+) /BL21 (DE3)、LT24_171/pET32a (+) /BL21 (DE3)、LT28^171/ pET32a(+)/BL21(DE3)重組工程菌Iml接種IOOOmlLB (含氨芐青霉素IOOng/μ 1)培養(yǎng)基中，37°C、250rpm培養(yǎng)證后，加入IPTG至終濃度0. 5mM，繼續(xù)培養(yǎng)4h。收集濕重為5g的菌體沉淀用PBS洗滌后超聲破碎，離心收集包涵體。用尿素增溶包涵體，用Tris緩沖液復性。 相繼用Q-S印harose FF離子交換柱層析、Phenyl-S印harose FF疏水層析和CM-kpharose FF離子交換柱層析進行純化。將洗脫液稀釋至蛋白濃度為lmg/ml。分別獲得野生型 LT、LT24^171, LTi171 蛋白 1. 0、3. 5、4. 2 毫克。 實施例2突變體rhLT008的制備
rhLT008突變體表達載體的構建
(I)PCR擴增突變體基因
以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107E-R為一對引物進行擴增，獲得LT008-AB片段，同時以LT-P32D和Q107E-F —對引物進行擴增，獲得LT008-⑶片段。再取LT008-AB和LT008-⑶混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得含Q107E突變的LT008片段。
LT-P32U :5，ACACATATGATG CAC TCT ACC CTG AAA CCG 3，(SEQ ID NO 4)
LT-P32D :5，TGCAAGCTTCTA CAG AGC GAA GGC TCC AAA 3，(SEQ ID NO :5)
Q107E-F 5' CTCTTCTCCTCCGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO :6)
Q107E-R 5' GAAGGGGTATTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO :7)
PCR產物純化后與PMD-18T載體連接，轉化大腸桿菌Dffia，提取LT008/pMD-18T質粒，正反向進行序列測定。
(2)構建rhLT突變體的原核表達載體
測序正確的克隆，其質粒用限制酶NdeI和HindIII雙酶消化，亞克隆至pET3h(+) 表達載體的相同位點上，獲得LT008/pET3^i(+)重組表達質粒。
rhLT突變體在大腸桿菌中的表達
重組表達質粒LT008/pET3a (+)轉化大腸桿菌BL21 (DE3)，轉化液涂布LB (含氨芐青霉素lOOng/μ 1)平板。從轉化平板上挑取單克隆接種于ImL LB培養(yǎng)基中，37°C、250rpm 培養(yǎng)池后，加入IPTG至終濃度0. ImM，繼續(xù)培養(yǎng)池。取IOOul表達后的菌液離心收集菌體沉淀，加入50ul SDS樣品制備液，在12. 5%的PAGE膠中進行電泳檢測。
按實施例1同樣方法純化LT008，獲得LT008蛋白3. 6毫克。
實施例3 LT006的制備
以LT24_171/pET32a(+)質粒為模板，以 LT-P32U 和 S106E-Q107E-R 為一對引物進行擴增，獲得LT006-AB片段，同時以LT-P32D和S106E-Q107E-F —對引物進行擴增，獲得 LT006-CD片段。再取LT006-AB和LT006-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得全長的含S106E-Q107E突變的LT006片段。
PCR引物序列為
S106E-Q107E-F :5，CTCTTCTCCGAAGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 8)
S106E-Q107E-R :5，GAAGGGGTATTCTTCGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 9)
按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT006，獲得LT006蛋白3. 1毫克。
實施例4LT009的制備
以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107D-R為一對引物進行擴增，獲得LT009-AB片段，同時以LT-P32D和Q107D-F —對引物進行擴增，獲得LT009-⑶片段。再取LT009-AB和LT009-⑶混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得全長的含Q107D突變的LT009片段。
PCR引物序列為
Q107D-F 5' CTCTTCTCCTCCGACTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 10)
Q107D-R 5' GAAGGGGTAGTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 11)
按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT009，獲得LT009蛋白4. 2毫克。
實施例5突變體rhLT057的制備
以LT28_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT28_P32U和Q107E-R為一對引物進行擴增， 獲得LT057-AB片段，同時以LT-P32D和Q107E-F —對引物進行擴增，獲得LT057-⑶片段。 再取LT057-AB和LT057-CD混合后為模板，以LT28_P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增， 獲得含Q107E突變的LT057片段。
LT28-P32U 5' ACACATATG AAA CCG GCT GCT CAC 3，(SEQ ID NO :12)
LT-P32D :5，TGCAAGCTTCTA CAG AGC GAA GGC TCC AAA 3，(SEQ ID NO :5)
Q107E-F 5' CTCTTCTCCTCCGAATACCCCTTC 3，(SEQ ID NO :6)
Q107E-R 5' GAAGGGGTATTCGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO :7)
按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT057，獲得LT057蛋白3. 1毫克。
實施例6LT090的制備
以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107R-R為一對引物進行擴增，獲得LT090-AB片段，同時以LT-P32D和Q107R-F —對引物進行擴增，獲得LT090-⑶片段。再取LT090-AB和LT090-⑶混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得全長的含Q107R突變的LT090片段。
PCR引物序列為
Q107R-F 5' CTCTTCTCCTCCCGTTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 13)
Q107R-R 5' GAAGGGGTAACGGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 14)
按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT090，獲得LT090蛋白3. 3毫克。
實施例7LT092的制備
以LT24_m/pET32a(+)質粒為模板，以LT-P32U和Q107N-R為一對引物進行擴增，獲得LT092-AB片段，同時以LT-P32D和Q107N-F —對引物進行擴增，獲得LT092-CD片段。再取LT092-AB和LT092-CD混合后為模板，以LT-P32U和LT-P32D為一對引物進行擴增，獲得全長的含Q107N突變的LT092片段。
PCR引物序列為
Q107N-F 5' CTCTTCTCCTCCAACTACCCCTTC 3，(SEQ ID NO 15)
Q107N-R 5' GAAGGGGTAGTTGGAGGAGAAGAG 3，(SEQ ID NO 16)
按實施例2同樣方法克隆、表達、純化LT092，獲得LT092蛋白4. 5毫克。
實施例8.酶聯(lián)免疫吸附測定受體結合狀況
TNFRI:Fc/TNFRII:Fc包被在酶標板上，將待測LT突變體稀釋至相同濃度上樣與之結合后，加兔抗LT的酶聯(lián)抗體，顯色讀數(shù)。
比較計算，與野生型LT進行比較，求百分率，推測LT與受體的結合能力
表1 與受體的結合能力評價[0140]
權利要求
1.一種受體選擇性淋巴毒素突變體，其特征在于，所述突變體在對應于淋巴毒素天然序列中，107位氨基酸殘基被替換為E、D、N、或R，其中淋巴毒素天然序列如SEQ ID N0:3所示；附加條件是108位Y殘基不變；并且所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人TNFRII 的結合能力之比大于10;并且所述的突變體的突變選自下組Q107E ；Q107D ；Q107R ；Q107N ；Q107E/S106E ； Q107E/S106D ；Q107D/S106E ；或 Q107D/S106D。
2.如權利要求
1所述的淋巴毒素突變體，其特征在于，該淋巴毒素突變體與TNFRI的結合能力與野生型LT與人TNFRI的結合能力之比大于0. 1 ；該淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力與野生型LT與人TNFRII的結合能力之比小于0.01。
3.如權利要求
2所述的淋巴毒素突變體，其特征在于，所述突變體在對應于淋巴毒素天然序列中第107位殘基Q突變?yōu)镋。
4.如權利要求
1所述的淋巴毒素突變體，其特征在于，所述的突變體的突變選自下組Q107E/S106E ；或 Q107D/S106D。
5.如權利要求
1所述的淋巴毒素突變體，其特征在于，所述淋巴毒素突變體與人TNFRI 的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力之比大于100。
6.一種藥物組合物，其特征在于，它包含安全有效量的權利要求
1所述的淋巴毒素突變體和藥學上可接受的載體。
7.如權利要求
6所述的藥物組合物，其特征在于，它還含有選自下組的化療劑⑶DP、 5-FU、ADM、VCR 或其組合。
8.如權利要求
1所述的人淋巴毒素突變體的用途，其特征在于，用于制備治療腫瘤的藥物。
9.一種制備權利要求
1所述的TNFRI受體選擇性人淋巴毒素突變體的方法，其特征在于，在天然淋巴毒素序列108位殘基不變，將107位氨基酸替換為E、D、N、或R，其中淋巴毒素天然序列如SEQ ID NO 3所示。
10.一種分離的DNA序列，其特征在于，它編碼權利要求
1所述的淋巴毒素突變體。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種受體選擇性淋巴毒素突變體，所述淋巴毒素突變體與人TNFRI的結合能力與所述淋巴毒素突變體與人TNFRII的結合能力之比大于10。本發(fā)明還公開了所述淋巴毒素衍生物的制法和用途。本發(fā)明的LT突變體對TNFRI有選擇性結合，與TNFRII結合則大幅降低，因而可減低TNFRII可能引起的毒副作用。
文檔編號A61P33/00GKCN101084238 B發(fā)布類型授權 專利申請?zhí)朇N 200480044634
公開日2011年9月21日 申請日期2004年12月24日
發(fā)明者劉彥君, 吳勁松, 吳芳, 曹峰, 楊彤, 沈毅珺, 王征, 王海波, 許燕, 譚靖偉 申請人:上海復旦張江生物醫(yī)藥股份有限公司, 泰州復旦張江藥業(yè)有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan非專利引用 (2),