專利名稱：用于細(xì)胞歸巢和脂肪形成的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及脂肪組織的產(chǎn)生和再生。
背景技術(shù)：
對(duì)于軟組織損傷、乳腺癌缺陷、面部缺陷、脂肪萎縮的重建以及對(duì)于軟組織增大，脂肪組織是關(guān)鍵的需求。臨床上，一般實(shí)踐是自體脂肪轉(zhuǎn)移。從患者身體的一部分收集自體組織移植物，用于另一部分的重建。該技術(shù)的關(guān)鍵缺點(diǎn)包括供體部位受損以及隨著時(shí)間的體積損失。自體脂肪轉(zhuǎn)移后的體積減小可以高達(dá)70%。實(shí)驗(yàn)上，已將脂肪和骨髓干細(xì)胞或前脂肪細(xì)胞移植入天然或合成材料用于脂肪組織再生(參見例如，Gomillion和Burg2006Biomaterials6052-6063)。但是，通常需要大量干/祖細(xì)胞，但其在患者中是缺乏的。發(fā)明概述本文所公開的內(nèi)容的教導(dǎo)包括形成脂肪組織的方法。一方面提供形成脂肪組織的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括提供支架。在一些實(shí)施方案中，所述支架與祖細(xì)胞(progenitor cell)液體聯(lián)通。在一些實(shí)施方案中，誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)祖細(xì)胞在支架內(nèi)或支架上時(shí)，誘導(dǎo)其形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述支架包括有效量的細(xì)胞歸巢組合物(cell homingcomposition)。在一些實(shí)施方案中,所述支架包括脂肪形成組合物。在一些實(shí)施方案中，所述支架不包括移植的細(xì)胞。另一個(gè)方面提供治療患有軟組織缺陷的對(duì)象的方法。在一些實(shí)施方案中，治療患有軟組織缺陷的對(duì)象的方法包括將支架植入有需要的對(duì)象。在一些實(shí)施方案中，所述支架包括有效量的細(xì)胞歸巢組合物。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物的有效量是誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上的量。在一些實(shí)施方案中，所述支架包括脂肪形成組合物。在一些實(shí)施方案中，脂肪形成組合物誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述支架不包括在植入對(duì)象前移植的細(xì)胞。另一個(gè)方面提供一種軟組織構(gòu)建體。在一些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括具有有效量細(xì)胞歸巢組合物的支架。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物的有效量是誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上的量。在一些實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包括具有有效量脂肪形成組合物的支架。在一些實(shí)施方案中，有效量的脂肪形成組合物誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述支架不包括在植入對(duì)象前移植的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述支架與祖細(xì)胞液體聯(lián)通。在一些配置中，當(dāng)支架與祖細(xì)胞液體聯(lián)通時(shí)，有效量的細(xì)胞歸巢組合物可以誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物可以包括胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGFl)。在一些配置中，IGFl可以是約0.1/250至約250/250(μ g IGFl每mg支架)的比例。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物可以包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。在一些配置中，bFGF可以是約0.1/250至約250/250(yg bFGF每mg支架)的比例。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物可以包括IGFl和bFGF兩者。在一些配置中，IGFl可以是約0.1/250至約250/250 ( μ g IGFl 每 mg 支架)，bFGF 可以是約 0.1/250 至約 250/250 ( μ g bFGF 每 mg 支架)的比例。在一些實(shí)施方案中，包括Y分泌酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，支架包括Y分泌酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物包括Y分泌酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，脂肪形成組合物包括Y分泌酶抑制劑。在一些配置中，按照有效減輕、實(shí)質(zhì)上減輕、或消除脂肪形成的抑制(由祖細(xì)胞包含的EGF受體所引起)的量提供Y分泌酶抑制劑。在一些配置中，Y分泌酶抑制劑可以具有約1.0μ M至約ΙΟΟμ M的濃度。在一些配置中，Y分泌酶抑制劑可以具有約0.1/250至約250/250 (μ gy分泌酶抑制劑每mg支架)的比例。在一些實(shí)施方案中，包括Notch Y分泌酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，支架包括Notch Y分泌酶抑制劑。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物包括Notch Y分泌酶抑制齊U。在一些實(shí)施方案中，脂肪形成組合物包括Notch Y分泌酶抑制劑。在一些配置中，按照有效減輕、實(shí)質(zhì)上減輕、或消除脂肪形成的抑制(由祖細(xì)胞包含的EGF受體所引起)的量提供Notch Y分泌酶抑制劑。在一些配置中，Notch Y分泌酶抑制劑可以具有約Ι.ΟμΜ至約100 μ M的濃度。在一些配置中，NotchY分泌酶抑制劑可以具有約0.1/250至約250/250 ( μ g抑制劑每mg支架)的比例。在一些實(shí)施方案中，包括MAPk抑制劑。在一些實(shí)施方案中，支架包括MAPk抑制齊U。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞歸巢組合物包括MAPk抑制劑。在一些實(shí)施方案中，脂肪形成組合物包括MAPk抑制劑。在一些配置中，按照有效減輕、實(shí)質(zhì)上減輕、或消除脂肪形成的抑制(由祖細(xì)胞包含的EGF受體引起)的量提供MAPk抑制劑。在一些配置中，MAPk抑制劑可以具有約1.ΟμΜ至約100 μ M的濃度。在一些配置中，MAPk抑制劑可以具有約0.1/250至約250/250 ( μ g抑制劑每mg支架)的比例。在一些實(shí)施方案中，脂肪形成組合物包括吲哚美辛、胰島素、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、或Pyrintegrin中的一種或多種。在一些配置中，吲哚美辛以約0.1/250至約250/250 (mg吲哚美辛每mg支架)的比例存在。在一些配置中，胰島素以約0.1/250至約250/250 (mg胰島素每mg支架)的比例存在。在一些配置中，IBMX以約0.1/250至約250/250(mg IBMX每mg支架)的比例存在。在一些配置中，地塞米松以約0.1/250至約250/250 (mg地塞米松每mg支架)的比例存在。在一些配置中，Pyrintegrin以約0.1/250至約250/250(mg Pyrintegrin每mg支架)的比例存在。在一些實(shí)施方案 中，祖細(xì)胞是脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、MSC-來(lái)源的細(xì)胞、或脂肪細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞包括脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、MSC-來(lái)源的細(xì)胞、或脂肪細(xì)胞中的一種或多種。在一些實(shí)施方案中，支架包括生物相容性(biocompatible)基質(zhì)材料。在一些配置中，支架包括聚(乳酸-共-輕基乙酸)(poly(lactic-co_glycolic acid), PLGA) 在一些配置中，支架包括至少一個(gè)物理通道。在一些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞以約0.0001百萬(wàn)細(xì)胞(Μ)πιΓ1至約1000M πιΓ1的密度存在于支架中。在一些實(shí)施方案中，脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞以約0.0001百萬(wàn)細(xì)胞(M)mr1至約1000Μ πιΓ1的密度存在于支架中。下文中將部分顯現(xiàn)以及部分指出其它的目的和特征。


本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如下所述的附圖只是為了說(shuō)明目的。任何情況下所述附圖都不是用于限制本教導(dǎo)的范圍。圖1是一系列圖像和柱狀圖，顯示利用微球包裹的脂肪形成混合物培養(yǎng)10天的C3H10T1/2細(xì)胞的脂肪形成，所述脂肪形成混合物包括吲哚美辛、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和地塞米松。圖1A顯示陰性對(duì)照(Al)、5mg (AU)、IOmg (AIII)、15mg (AIV)、20mg(AV)微球和陽(yáng)性對(duì)照(AVI)的H&E和油紅-O染色。圖1B顯示分化為脂肪細(xì)胞的細(xì)胞百分比。圖1C顯示利用油紅-O檢測(cè)到的脂質(zhì)積聚。*ρ〈0.05**ρ〈0.01***ρ〈0.005。關(guān)于方法學(xué)的更多細(xì)節(jié)在實(shí)施例1中提供。圖2是一系列圖像，顯示來(lái)自具有C3H10T1/2細(xì)胞和微球的不同組合的支架的組織切片，所述支架被置于肥胖C57BL/6NHsd小鼠的下腹部皮下脂肪墊中兩周。圖2A顯示空支架。圖2B顯示具有500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。圖2C顯示具有5mg脂肪形成微球的支架。圖2D顯示具有5mg脂 肪形成微球和500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。圖2E顯示具有
2.5mg IGFl微球的支架。圖2F顯示具有2.5mg IGF-1微球和500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。X20放大率。關(guān)于方法學(xué)的更多細(xì)節(jié)在實(shí)施例1中提供。圖3是一系列圖像，顯示具有C3H10T1/2細(xì)胞和微球的不同組合的支架，所述支架被置于肥胖C57BL/6NHsd小鼠的下腹部皮下脂肪墊中兩周。圖3A顯示空支架。圖3B顯示具有500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。圖3C顯示具有5mg脂肪形成微球的支架。圖3D顯示具有5mg脂肪形成微球和500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。圖3E顯示具有2.5mg IGFl微球的支架。圖3F顯示具有2.5mg IGFl微球和500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。X40放大率。關(guān)于方法學(xué)的更多細(xì)節(jié)在實(shí)施例1中提供。圖4是線圖和散布圖，顯示用下述物質(zhì)處理的hADSCs的PPARy表達(dá)在28天期間的變化:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ;ADM 加 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2);和 ADM 加 10 μ M Inhl 和Inh2(ADM+Inhl、2)。圖5是線圖和散布圖，顯示用下述物質(zhì)處理的hADSCs的C/EBP α表達(dá)在28天期間的變化:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ;ADM 加 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2);和 ADM 加 10 μ M Inhl 和Inh2 (ADM+Inhl、2)。
圖6是一系列用下述物質(zhì)處理hDSCs后四周產(chǎn)生的亮視野圖像:(圖6A) ADM;(圖6B)ADM+Inhl;(圖 6C)ADM+Inh2;和(圖 6D)ADM+Inhl、2。圖7是柱狀圖，顯示在處理后兩和四周，用下述物質(zhì)處理的hADSCs中測(cè)量的脂聯(lián)素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ; ADM 加 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2)，以及 ADM 加 10 μ M Inhl和 Inh2(ADM+Inhl、2)。圖8是柱狀圖，顯示在處理后兩和四周，用下述物質(zhì)處理的hADSCs中測(cè)量的瘦素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ; ADM 加 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2)，以及 ADM 加 10 μ M Inhl和 Inh2(ADM+Inhl、2)。圖9是用下述物質(zhì)處理的hADSCs中28天期間測(cè)量的PPAR Y表達(dá)的線圖和散布圖:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);和ADM加2 μ MPyrintegrin (ADM+Pyrintegrin)。圖10是用下述物質(zhì)處理的hADSCs中28天期間測(cè)量的C/ΕΒΡ α表達(dá)的線圖和散布圖:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);和ADM加2 μ MPyrintegrin (ADM+Pyrintegrin)。圖11是一對(duì)圖像，顯示用下述物質(zhì)處理hDSCs四周后進(jìn)行的脂質(zhì)染色:(圖11A)ADM ;和(圖 11B)ADM 加 Pyrintegrin(ADM+Pyrintegrin)。圖12是柱狀圖，顯示在處理后兩周和四周，用下述物質(zhì)處理的hADSCs中測(cè)量的脂聯(lián)素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);以及ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)。圖13是柱狀 圖，顯示在處理后兩周和四周，用下述物質(zhì)處理的hADSCs中測(cè)量的脂聯(lián)素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);以及ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)。圖14是柱狀圖，顯示在處理后兩周和四周，用下述物質(zhì)處理的hADSCs中測(cè)量的瘦素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);以及ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)。圖15是柱狀圖，顯示在處理后兩周和四周，用下述物質(zhì)處理的hADSCs中測(cè)量的甘油含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);以及ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)。圖16是一系列圖像，顯示在用下述物質(zhì)處理I小時(shí)后hADSCs中進(jìn)行的Western印跡分析:對(duì)照培養(yǎng)基(對(duì)照)；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)；和單獨(dú)的Pyrintegrin (藥物)。圖17是一系列圖像，顯示在用下述物質(zhì)處理I小時(shí)后hADSCs中進(jìn)行的Western印跡分析:對(duì)照培養(yǎng)基(對(duì)照)；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)；和單獨(dú)的Pyrintegrin (藥物)。發(fā)明詳述本文內(nèi)容至少部分基于以下觀察，宿主內(nèi)源細(xì)胞的歸巢可以用作體內(nèi)脂肪組織再生的細(xì)胞來(lái)源。如本文所示，體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示充滿各種脂肪形成因子混合物的PLGA支架可以促進(jìn)脂肪形成。此外，具有生長(zhǎng)/歸巢因子的支架能夠?qū)⒓?xì)胞歸巢入支架。因此，月旨肪形成混合物和各種歸巢或血管生成因子的組合可在相同支架內(nèi)提供脂肪形成和細(xì)胞歸巢。本文描述的結(jié)果支持通過(guò)細(xì)胞歸巢引起的脂肪再生效果，這是一種與細(xì)胞移植相比至少同樣有效，并且在許多方面更有益的方法。通過(guò)細(xì)胞歸巢引起的脂肪組織再生可以用作軟組織重建或增大的替代或輔助方法。與自體組織移植相比，基于細(xì)胞歸巢的療法的關(guān)鍵優(yōu)點(diǎn)之一是將供體部位發(fā)病率降到最低。對(duì)于軟組織重建和/或增大來(lái)說(shuō)，細(xì)胞歸巢相對(duì)細(xì)胞移植提供大量?jī)?yōu)勢(shì)(一般參見 Mao et al.2010 Tissue Engineering Part B:Reviews 16 (2)，257-262)。宿主內(nèi)源細(xì)胞的誘導(dǎo)歸巢可以克服與細(xì)胞移植相關(guān)的關(guān)鍵科學(xué)、技術(shù)、商業(yè)化和行政問(wèn)題，諸如潛在的污染、成本超支、免疫排斥、病原體傳播、以及當(dāng)前臨床醫(yī)生缺乏對(duì)處理細(xì)胞的訓(xùn)練。用于細(xì)胞歸巢的生物活性物質(zhì)(cues)，諸如細(xì)胞因子或趨化因子，可以容易地被包裝和輸送用于單次步驟，這與細(xì)胞移植相關(guān)的頻繁多次步驟相反。對(duì)于用于細(xì)胞因子和趨化因子輸送此前 存在管理許可。細(xì)胞歸巢方法受益于包裝和保存的分子輸送產(chǎn)品的更方便的臨床輸送。細(xì)胞歸巢方法將機(jī)體自身的再生能力最大化。細(xì)胞歸巢涉及將內(nèi)源細(xì)胞(包括干/祖細(xì)胞)主動(dòng)募集入解剖小室(anatomiccompartment)?？梢允褂蒙锊牧现Ъ?采用感興趣組織的形狀，并包含各種化學(xué)引誘劑以將特定細(xì)胞募集入生物材料形成組織)來(lái)進(jìn)行通過(guò)細(xì)胞歸巢的組織再生。提供一種將細(xì)胞歸巢入支架并結(jié)合脂肪形成促進(jìn)的方法。在各種實(shí)施方案中，將控釋的脂肪形成組合物和控釋的細(xì)胞歸巢組合物導(dǎo)入支架或基質(zhì)材料?？梢栽隗w外、離體(ex vivo)、或體內(nèi)將支架溫育。細(xì)胞歸巢組合物可以增加細(xì)胞(包括祖細(xì)胞)遷移入支架或基質(zhì)材料。脂肪形成組合物可以促進(jìn)細(xì)胞諸如祖細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞或組織或者脂肪樣細(xì)胞或組織。細(xì)胞歸巢組合物本文描述的各種實(shí)施方案使用促進(jìn)細(xì)胞遷移的細(xì)胞歸巢組合物。例如，可以在支架中包括控釋細(xì)胞歸巢組合物，以便促進(jìn)細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上。作為另一個(gè)實(shí)例，可以在支架中包括控釋細(xì)胞歸巢組合物，以便促進(jìn)細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上，然后通過(guò)脂肪形成組合物誘導(dǎo)所述支架分化脂肪或脂肪樣細(xì)胞。細(xì)胞歸巢組合物可以包括一種或更多種胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFl)或堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)。例如，細(xì)胞歸巢組合物可以包括IGF1。作為另一個(gè)實(shí)例，細(xì)胞歸巢組合物可以包括bFGF。作為另一個(gè)實(shí)例，脂肪形成組合物可以包括IGFl和bFGF。細(xì)胞歸巢組合物中可以包括IGF1。在一些實(shí)施方案中，IGFl可以包裹在微球中。例如，IGFl可以按照約0.1/250至約250/250(μ g IGFl每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，IGFl 可以按照約 0.1/250;約 0.5/250;約 1/250;約 2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約13/250;約 14/250;約 15/250;約 16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約 35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約 150/250;約 200/250;或約 250/250 ( μ g IGFl 每 mg微球材料)的比例包裹在微球中。作為另一個(gè)實(shí)例，IGFl可以按照約10 μ g/250mg微球材料的比例包裹在微球中(參見實(shí)施例1)。細(xì)胞歸巢組合物中可以包括bFGF。在一些實(shí)施方案中，bFGF可以包裹在微球中。例如，bFGF可以按照約0.1/250至約250/250(μ g bFGF每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，bFGF 可以按照約 0.1/250;約 0.5/250;約 1/250;約 2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約13/250;約 14/250;約 15/250;約 16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約 35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約 150/250;約 200/250;或約 250/250 ( μ g bFGF 每 mg微球材料)的比例包裹在微球中。作為另一個(gè)實(shí)例，bFGF可以按照約10 μ g/250mg微球材料的比例包裹在微球中(參見實(shí)施例1)。如下文進(jìn)一步所述，細(xì)胞歸巢組合物中可以包括Y分泌酶抑制劑。祖細(xì)胞本文描述的各種組合物和方法提供祖細(xì)胞的募集，祖細(xì)胞的誘導(dǎo)遷移，或祖細(xì)胞的誘導(dǎo)分化。一些實(shí)施方案促進(jìn)祖細(xì)胞遷移入一種支架或基質(zhì)材料，誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或 者兩者。祖細(xì)胞是未分化或部分未分化的細(xì)胞，可以分裂和增殖以產(chǎn)生未分化或部分未分化的細(xì)胞，或可以分化以產(chǎn)生至少一種分化或?qū)；募?xì)胞。祖細(xì)胞可以是多潛能(pluripotent)細(xì)胞,這表示所述細(xì)胞在分化時(shí)能夠自更新和反分化為多種組織類型。多潛能祖細(xì)胞包括干細(xì)胞，諸如胚胎干細(xì)胞和成人干細(xì)胞。祖細(xì)胞可以是多能(multipotent)細(xì)胞。祖細(xì)胞可以自更新。例如，祖細(xì)胞可以是干細(xì)胞。作為另一個(gè)實(shí)例，祖細(xì)胞可以是成人干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞可以分化為，或另外形成，脂肪細(xì)胞或脂肪細(xì)胞樣細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞可以分化為、或另外形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞。例如，祖細(xì)胞可以是脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、MSC-來(lái)源的細(xì)胞、或脂肪細(xì)胞。祖細(xì)胞可以通過(guò)各種方法分離，純化，或培養(yǎng)。用于分離和培養(yǎng)祖細(xì)胞的方法描述于，例如，Vunjak-Novakovic 和 Freshney (2006)Culture of Cells for Tissue Engineering, ffiley-Liss, ISBN-100471629359。祖細(xì)胞可以包含于，或來(lái)源于，動(dòng)物，包括但不限于，哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物，和鳥類，更優(yōu)選馬、牛、狗、貓、綿羊、豬、和雞，最優(yōu)選人。在一些實(shí)施方案中，祖細(xì)胞以約0.0001百萬(wàn)細(xì)胞(Μ)πιΓ1到約IOOOMmr1的密度遷移入支架或基質(zhì)材料中。例如，祖細(xì)胞可以按照以下密度遷移入支架或基質(zhì)材料中:1Mml \5M ml \ IOM ml \ 15M ml \20M ml \25M ml \30M ml \35M ml \40M ml \45M ml \50M πιΓ\55Μ πιΓ\60Μ πιΓ\65Μ πιΓ\70Μ πιΓ\75Μ πιΓ\80Μ πιΓ\85Μ πιΓ\90Μ πιΓ\95Μml、或 IOOM ml、脂肪形成組合物本文描述的各種實(shí)施方案使用促進(jìn)脂肪形成的脂肪形成組合物。例如，支架可以包括控釋脂肪形成組合物，以便促進(jìn)支架內(nèi)或支架上的細(xì)胞分化為脂肪或脂肪樣細(xì)胞。作為另一個(gè)實(shí)例，支架可以包括控釋脂肪形成組合物，以便促進(jìn)細(xì)胞(針對(duì)支架中還包括的細(xì)胞歸巢組合物的響應(yīng)，所述細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上)的脂肪形成分化。各種脂肪形成組合物是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Gomillion and Burg2006Biomaterials6052-6063;Poulous et al.2010Exp Biol Med235, 1185-1193)。脂肪形成組合物包括吲哚美辛、胰島素、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、或地塞米松中的一種或多種。例如，脂肪形成組合物可以包括吲哚美辛。作為另一個(gè)實(shí)例，脂肪形成組合物可以包括胰島素。作為另一個(gè)實(shí)例，脂肪形成組合物可以包括IBMX。作為另一個(gè)實(shí)例，脂肪形成組合物可以包括地塞米松。作為另一個(gè)實(shí)例，脂肪形成組合物可以包括吲哚美辛、胰島素、IBMX、和地塞米松。脂肪形成組合物中可以包括吲哚美辛。在一些實(shí)施方案中，吲哚美辛可以包裹在微球中。例如，吲哚美辛可以按照約0.1/250至約250/250 (mg吲哚美辛每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，吲哚美辛可以按照以下比例包裹在微球中:約0.1/250;約 0.5/250;約 1/250;約 2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約 13/250;約 14/250;約 15/250;約16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約 35/250;約40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約150/250;約200/250;或約250/250 (mg吲哚美辛每mg微球材料)。作為另一個(gè)實(shí)例，吲哚美辛可以按照約5.15mg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(參見實(shí)施例1)。脂肪形成組合物中可以包括胰島素。在一些實(shí)施方案中，胰島素可以包裹在微球中。例如,胰島素可以按照約0.1/250至約250/250 (mg胰島素每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，吲哚美辛可以按照以下比例包裹在微球中:約0.1/250;0.2/250;0.3/250;0.4/250;0.5/250;0.6/250;0.7/250;0.8/250;0.9/250;約 1/250;約 2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 15/250;約20/250;約 25/250;約 30/250;約 35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約 150/250;約 200/250;或約 250/250 (mg胰島素每mg微球材料)?！ぷ鳛榱硪粋€(gè)實(shí)例，胰島素可以按照約lmg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(參見實(shí)施例1)。脂肪形成組合物中可以包括IBMX。在一些實(shí)施方案中，IBMX可以包裹在微球中。例如，IBMX可以按照約0.1/250至約250/250 (mg IBMX每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，IBMX可以按照以下比例包裹在微球中:約0.1/250;約0.5/250;約1/250;約2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約 13/250;約 14/250;約 15/250;約 16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約 35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約 150/250;約 200/250;或約250/250 (mg IBMX每mg微球材料)。作為另一個(gè)實(shí)例，IBMX可以按照約11.lmg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(參見實(shí)施例1)。脂肪形成組合物中可以包括地塞米松。在一些實(shí)施方案中，地塞米松可以包裹在微球中。例如，地塞米松可以按照約0.1/250至約250/250 (mg地塞米松每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，地塞米松可以按照以下比例包裹在微球中:約0.1/250;約0.5/250;約 1/250;約 5/250;約 10/250;約 15/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約31/250;約 32/250;約 33/250;約 34/250;約 35/250;約 36/250;約 37/250;約 38/250;約 39/250;約 40/250;約 41/250;約 42/250;約 43/250;約 44/250;約 45/250;約 46/250;約 47/250;約 48/250;約 49/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250 ;約100/250;約150/250;約200/250;或約250/250 (mg地塞米松每mg微球材料)。作為另一個(gè)實(shí)例，地塞米松可以按照約39.2mg/250mg微球材料的比例包裹在微球中(參見實(shí)施例1)。脂肪形成組合物可以包含促進(jìn)祖細(xì)胞存活的物質(zhì)。例如，脂肪形成組合物可以包括Pyrintegrin (N-(環(huán)丙基甲基)-4- (4- (6-羥基-3，4-二氫喹啉_1_ (2H)-基)嘧啶-2-基氨基)苯磺酰氨)。通過(guò)保護(hù)細(xì)胞表面蛋白e-1丐粘蛋白免遭破壞，Pyrintegrin可以促進(jìn)干細(xì)胞(例如，hESC)存活。在一些實(shí)施方案中，Pyrintegrin可以包裹在微球中。例如，Pyrintegrin 可以按照約 0.1/250 至約 250/250 (mg Pyrintegrin 每 mg 微球材料)的比例包裹在微球中。例如，Pyrintegrin可以按照以下比例包裹在微球中:約0.1/250;約
0.5/250;約 1/250;約 5/250;約 10/250;約 15/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約31/250;約 32/250;約 33/250;約 34/250;約 35/250;約 36/250;約 37/250;約 38/250;約39/250;約 40/250;約 41/250;約 42/250;約 43/250;約 44/250;約 45/250;約 46/250;約47/250;約 48/250;約 49/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約 150/250;約 200/250;或約 250/250 (mg Pyrintegrin 每 mg 微球材料)。如本文所示，Pyrintegrin可以有效誘導(dǎo)hADSCs的PPAR Y表達(dá)(參見例如,實(shí)施例8);誘導(dǎo)hADSCs的C/EBP α表達(dá)(參見例如，實(shí)施例9);誘導(dǎo)脂質(zhì)積聚(參見例如，實(shí)施例10);誘導(dǎo)脂肪形成分化(參見例如，實(shí)施例11);增強(qiáng)hADSCs的脂聯(lián)素細(xì)胞因子分泌(參見例如，實(shí)施例12);增強(qiáng)瘦素細(xì)胞因子的分泌；(參見例如，實(shí)施例13);增強(qiáng)甘油的分泌(參見例如，實(shí)施例14);抑制BMP途徑(參見，實(shí)施例15);和/或不抑制TGF β /活化素?？梢园凑詹煌M合將吲哚美辛、胰島素、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、和Pyrintegrin中的一種或多種組合在脂肪形成組合物中，例如，根據(jù)上文所列的單獨(dú)挑選的濃度。如下文進(jìn)一步所述，脂肪形成組合物中可以包括Y分泌酶抑制、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑。脂肪細(xì)胞`本文描述的各種實(shí)施方案誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪或脂肪樣細(xì)胞。脂肪細(xì)胞可以由祖細(xì)胞形成。脂肪細(xì)胞可以由前脂肪細(xì)胞或干細(xì)胞(諸如間充質(zhì)干細(xì)胞)形成。在各種實(shí)施方案中，脂肪或脂肪樣細(xì)胞由祖細(xì)胞分化而成。通過(guò)檢測(cè)脂肪特異性標(biāo)記物可以鑒定脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或包含上述細(xì)胞的組織(參見例如，Poulous et al.2010Exp Biol Med235, 1185-1193)。例如，通過(guò)檢測(cè)一種或更多種早期脂肪特異性標(biāo)記物可以鑒定脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或包含上述細(xì)胞的組織，所述標(biāo)記物諸如ADFP(脂肪分化相關(guān)蛋白，亦稱adipophilin)、p0b24、脂蛋白脂肪酶、或pGH3。作為另一個(gè)實(shí)例，通過(guò)檢測(cè)一種或更多種晚期脂肪特異性標(biāo)記物可以鑒定脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或包含上述細(xì)胞的組織，所述標(biāo)記物諸如脂肪生成酶(通常包括磷酸甘油脫氫酶，具體的是甘油-3-磷酸脫氫酶)、aP2、和脂肪酶。作為另一個(gè)實(shí)例，利用⑶34標(biāo)記物通過(guò)檢測(cè)脂肪干細(xì)胞，可以鑒定脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或包含上述細(xì)胞的組織。作為另一個(gè)實(shí)例，通過(guò)檢測(cè)三?；视偷姆e聚，可以鑒定脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或包含上述細(xì)胞的組織。作為另一個(gè)實(shí)例，利用油紅-O通過(guò)檢測(cè)脂質(zhì)積聚，可以鑒定脂肪或脂肪樣細(xì)胞，或包含上述細(xì)胞的組織(參見實(shí)施例1)。脂肪樣細(xì)胞是展示一種或更多種脂肪細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物(諸如上述那些脂肪標(biāo)記物中的任一種)的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞以約0.0001百萬(wàn)細(xì)胞(Μ)πιΓ1至約1000M πιΓ1的密度在支架或基質(zhì)材料中形成。例如，脂肪或脂肪樣細(xì)胞可以按照以下密度在支架或基質(zhì)材料中形成:約 IM ι Γ\5Μ Iiir1UOM πιΓ\ 5Μ πιΓ\20Μ πιΓ\25Μ πιΓ\30Μ ml'35Μ ι Γ\40Μ ι Γ\45Μ ι Γ\50Μ ι Γ\55Μ ι Γ\60Μ ι Γ\65Μ ι Γ\70Μ ι Γ\75Μ ι Γ\80Μml \85Μ ml \90Μ ml \95Μ ml \或 100Μ ml、脂肪形成抑制的衰減子(attenuator)本文內(nèi)容提供用于減輕或消除脂肪形成抑制的組合物和方法。在各種實(shí)施方案中，可以使用蛋白激酶激動(dòng)劑或抑制劑，諸如表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)拮抗劑來(lái)增加脂肪形成。可以在本文描述的組合物和方法中使用Y (ga_a)分泌酶抑制劑，以便增加脂肪形成。Y分泌酶是膜內(nèi)在蛋白質(zhì)，其切割單通道(single-pass)跨膜蛋白。可以從各種來(lái)源商購(gòu)獲得Y分泌酶抑制劑(例如，Tocris Bioscience, MO; Santa CruzBiotechnology, Inc., CA; Axon Medchem, The Netherlands)。y 分泌酶抑制劑包括但不限于 DAPT、JLK6、化合物 W、化合物 E sc-222308、和 DBZ。如本文所示，Y分泌酶抑制劑導(dǎo)致三天后脂肪形成特異性標(biāo)記物最高10倍的增加；并且在4周后，導(dǎo)致甘油和瘦素的水平增加(參見例如，實(shí)施例2)。因此，通過(guò)減弱EGF受體(其在祖細(xì)胞諸如造血干細(xì)胞中是富集的)的功效，可以增強(qiáng)脂肪形成。此外，如本文所示，Notch Y分泌酶 抑制劑(Inhl)上調(diào)PPAR Y表達(dá)(參見例如，實(shí)施例3);上調(diào)C/EBPa表達(dá)(參見例如，實(shí)施例4);誘導(dǎo)脂質(zhì)積聚(參見例如，實(shí)施例5);或起始脂聯(lián)素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，實(shí)施例6)?？梢栽诒疚拿枋龅慕M合物和方法中使用絲裂原活化的蛋白激酶(MAPk)抑制劑，以便增加脂肪形成。如本文所示，MAPk抑制劑(Inh2)上調(diào)PPAR Y表達(dá)(參見例如，實(shí)施例3);上調(diào)C/EBPa表達(dá)(參見例如，實(shí)施例4);誘導(dǎo)脂質(zhì)積聚(參見例如，實(shí)施例5);或起始脂聯(lián)素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，實(shí)施例6)?？梢栽谥Ъ芑蚧|(zhì)材料中包括上述減弱脂肪形成抑制劑的物質(zhì)(包括但不限于Y分泌酶抑制劑、NotChY分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑)?？梢栽诩?xì)胞歸巢組合物中包括上述減弱脂肪形成抑制劑的物質(zhì)(包括但不限于Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制齊IJ、或MAPk抑制劑)。可以在脂肪形成組合物中包括上述減弱脂肪形成抑制劑的物質(zhì)(包括但不限于Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑)。減弱脂肪形成抑制劑的物質(zhì)(包括但不限于Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑)可以按照約0.1 μ M至約1，000 μ M的濃度存在。例如，Y分泌酶抑制劑可以按照約1.0 μ M至約100 μ M的濃度存在。作為另一個(gè)實(shí)例，Y分泌酶抑制劑可以按照以下濃度存在:約0.1、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、或約20 μ Μ、約50 μ Μ、或約100 μ M0作為另一個(gè)實(shí)例，Y分泌酶抑制劑可以按照約10 μ M的濃度存在(參見實(shí)施例2)。作為另一個(gè)實(shí)例，Notch Y分泌酶抑制劑可以按照約1.0 μ M至約100 μ M的濃度存在。作為另一個(gè)實(shí)例，Notch Y分泌酶抑制劑可以按照以下濃度存在:約0.1、約0.5、約
1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、或約20 μ M、約50 μ M、或約100 μ Μ。作為另一個(gè)實(shí)例，Notch Y分泌酶抑制劑可以按照約10 μ M的濃度存在。作為另一個(gè)實(shí)例，MAPk抑制劑可以按照約1.0 μ M至約100 μ M的濃度存在。作為另一個(gè)實(shí)例，MAPk抑制劑可以按照以下濃度存在:約0.1、約0.5、約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、或約20 μ Μ、約50 μ Μ、或約100 μ M0作為另一個(gè)實(shí)例，MAPk抑制劑可以按照約10 μ M的濃度存在。在一些實(shí)施方案中，可以將減弱脂肪形成抑制劑的物質(zhì)(包括但不限于Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑)包裹在微球中。例如，Y分泌酶抑制劑可以按照約0.1/250至約250/250 ( μ g抑制劑每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，Y分泌酶抑制劑可以按照以下比例包裹在微球中:約
0.1/250;約 0.5/250;約 1/250;約 2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約 13/250;約 14/250;約15/250;約 16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約100/250;約150/250;約200/250;或約250/250 μ g抑制劑每mg微球材料。作為另一個(gè)實(shí)例，Notch Y分泌酶抑制劑可以按照約0.1/250至約250/250 ( μ g抑制劑每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，NotchY分泌酶抑制劑可以按照以下比例包裹在微球中:約0.1/250;約0.5/250;約1/250;約2/250;約3/250;約4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約13/250;約 14/250;約 15/250;約 16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約 35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約 100/250;約 150/250;約 200/250;或約 250/250 μ g 抑制劑每 mg微球材料。作為另一個(gè)實(shí)例，MAPk分泌酶抑制劑可以按照約0.1/250至約250/250 ( μ g抑制劑每mg微球材料)的比例包裹在微球中。例如，MAPk抑制劑可以按照以下比例包裹在微球中:約 0.1/250;約 0.5/250;約 1/250;約 2/250;約 3/250;約 4/250;約 5/250;約 6/250;約 7/250;約 8/250;約 9/250;約 10/250;約 11/250;約 12/250;約 13/250;約 14/250;約15/250;約 16/250;約 17/250;約 18/250;約 19/250;約 20/250;約 25/250;約 30/250;約35/250;約 40/250;約 45/250;約 50/250;約 60/250;約 70/250;約 80/250;約 90/250;約100/250;約150/250;約200/250;或約250/250 μ g抑制劑每mg微球材料。在一些實(shí)施方案中，可以在本文所述的組合物或方法中順序或同時(shí)使用減弱脂肪形成抑制劑的一種或更多種物質(zhì)(包括但不限于Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑)。例如，Notch Y分泌酶抑制劑和MAPk抑制劑的聯(lián)合治療顯示提供疊加或協(xié)同效果，上調(diào)PPAR Y表達(dá)(參見例如，實(shí)施例3);上調(diào)C/ΕΒΡα表達(dá)(參見例如，實(shí)施例4);誘導(dǎo)脂質(zhì)積聚(參見例如，實(shí)施例5);或起始脂聯(lián)素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，實(shí)施例6)。
制劑本文描述的物質(zhì)和組合物可以使用一種或更多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑通過(guò)任意常規(guī)方式進(jìn)行配制，描述于例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences (A.R.Gennaro, Ed.)，21版，ISBN: 0781746736 (2005)，完整引入本文作為參考。這類制劑將包含治療有效量的本文所述生物活性劑(優(yōu)選的以純化形式)，以及合適量的載體以便提供用于給對(duì)象合適施用的形式。所述制劑應(yīng)當(dāng)適合施用的方式。可以通過(guò)已知的方法配制用于本發(fā)明的物質(zhì)，用于使用數(shù)種途徑給對(duì)象施用，所述途徑包括但不限于，腸胃外、肺、口服、局部、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外、眼、口腔、和直腸。單個(gè)物質(zhì)還可以與一種或更多種其他物質(zhì)聯(lián)合施用，或與其他生物活性或生物無(wú)活性物質(zhì)共同施用。這類生物活性劑或無(wú)活性物質(zhì)可以與所述物質(zhì)處于流體或機(jī)械相連，或通過(guò)離子、共價(jià)、范德華、疏水、親水或其他物理力與所述物質(zhì)連接。可以配制控釋(或持續(xù)釋放)制劑以延長(zhǎng)物質(zhì)活性和降低給藥頻率。還可以使用控釋制劑來(lái)影響作用發(fā)生的時(shí)間或其他特征，諸如物質(zhì)的血液水平，從而影響副作用的發(fā)生?？梢詫⒖蒯屩苿┰O(shè)計(jì)為最初釋放產(chǎn)生所需治療功效的量的物質(zhì)，并逐漸和連續(xù)釋放其它量的物質(zhì)以在較長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)維持治療功效的水平。為了維持物質(zhì)在體內(nèi)接近恒定的水平，可以按照取代被代謝或從身體排泄的物質(zhì)量的速率從所述劑型釋放物質(zhì)。物質(zhì)的控釋可以受到各種誘導(dǎo)物的刺激，例如，PH的改變、溫度的改變、酶、水、或其他生理?xiàng)l件或分子。微球 本文描述的各種實(shí)施方案使用控釋組合物。例如，可以將控釋脂肪形成組合物導(dǎo)入支架或基質(zhì)材料。作為另一個(gè)實(shí)例，可以將控釋細(xì)胞歸巢組合物導(dǎo)入支架或基質(zhì)材料。本文描述的控釋系統(tǒng)允許單獨(dú)的化學(xué)試劑或組合物以相似或不同的速率控制釋放。例如，控釋系統(tǒng)允許單獨(dú)的化學(xué)試劑或組合物以不同的速率釋放，以便提供，例如，與脂肪形成組合物不同速率(包括更快或更慢)的細(xì)胞歸巢組合物。作為另一個(gè)實(shí)例，本文描述的控釋系統(tǒng)提供比第二化合物或組合物更早的一種化合物或組合物的輸送。作為具體實(shí)施例，本文描述的控釋系統(tǒng)可以在脂肪形成組合物之前釋放部分或基本上部分的細(xì)胞歸巢組合物。例如，可以在脂肪形成組合物之前約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、或約10天或更多天釋放細(xì)胞歸巢組合物。作為另一個(gè)具體實(shí)施例，本文描述的控釋系統(tǒng)可以在細(xì)胞歸巢組合物之前釋放部分或基本上部分的脂肪形成組合物。例如，可以在細(xì)胞歸巢組合物之前約1、約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、或約10天或更多天釋放脂肪形成組合物。通過(guò)基于載體的系統(tǒng)(諸如包裹賦形劑)，可以將本文描述的組合物(例如，脂肪形成組合物，細(xì)胞歸巢組合物)導(dǎo)入到支架或基質(zhì)材料內(nèi)或?qū)氲街Ъ芑蚧|(zhì)材料上。例如，可以將脂肪形成組合物或細(xì)胞歸巢組合物包裹在聚合輸送系統(tǒng)內(nèi)，以便提供這種組合物從支架或基質(zhì)材料的控釋。這種賦形劑可用做緩釋組合物。例如，各種組合物可以是微囊密封的以提供增強(qiáng)的穩(wěn)定性或延長(zhǎng)的輸送。包裹賦形劑包括，但不限于，微粒，脂質(zhì)體，微球，等等，或任意上述的組合，以提供不同比例的所需釋放模式。物質(zhì)控釋輸送的其他方法是技術(shù)人員已知的。此外，這些和其他系統(tǒng)可以組合或改造以優(yōu)化支架或基質(zhì)材料內(nèi)的物質(zhì)整合/釋放。
例如,聚合遞送系統(tǒng)可以是聚合微球,優(yōu)選的PLGA聚合微球。各種聚合輸送系統(tǒng)，以及包裹分子諸如生長(zhǎng)因子的方法，是本領(lǐng)域已知的(參見例如，Varde and Pack(2004)Expert Opin Biol Ther4, 35-51)?？梢允褂锰烊淮嬖诨蚝铣傻亩嗑垠w來(lái)產(chǎn)生聚合微球,它們是大小范圍為0.1到500 μ m的顆粒體系。聚合微膠粒和聚合物體(polymerome)是具有與微球類似特征的聚合載體，還可以促進(jìn)本文所述化合物的包裹和基質(zhì)整合。用于各種負(fù)載的微球的制造、包裹和穩(wěn)定都在本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)(參見例如，Varde & Pack(2004)Expert Opin.Biol.4 (I) 35-51)?？梢愿鶕?jù)多聚體的類型,聚合物分子量,共聚物組合物,添加到微球制劑的賦形劑，以及微球大小，定制微球的釋放率?？捎糜谛纬晌⑶虻木酆喜牧习≒LA、PLGA, DPPC包被的PLGA、DPPC, DSPC、EVAc,明膠、白蛋白、殼聚糖、葡聚糖、DL-PLG,SDLMs、PEG (例如,ProMaxx)、透明質(zhì)酸鈉、環(huán)縮二氨酸衍生物(例如，Technosphere)、磷酸鈣-PEG顆粒、和/或寡糖衍生物DPPG (例如，So I i dose)。例如，使用水/油單乳化方法、水-油-水雙乳化方法、或凍干，可以實(shí)現(xiàn)包裹。已有數(shù)種商品化包裹技術(shù)(例如，ProLease⑧，Alkerme)。還可以使用脂質(zhì)體將本文所述組合物與支架或基質(zhì)材料整合。脂質(zhì)體的物質(zhì)運(yùn)載能力和釋放率取決于脂質(zhì)組合物，大小，荷電情況，藥品/脂質(zhì)比例，和輸送方法。常規(guī)脂質(zhì)體由中性或陰離子型脂質(zhì)(天然或合成的)組成。常用的脂質(zhì)是卵磷脂諸如磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，和磷脂酰肌醇。脂質(zhì)體包裹法是本領(lǐng)域公知的(Galovic et al.(2002)Eur.J.Pharm.Sc1.15, 441-448;Wagner et al.(2002)J.Liposome Res.12，259-270)。祀向脂質(zhì)體和活性脂質(zhì)體還可以與物質(zhì)和基質(zhì)聯(lián)用。革巴向脂質(zhì)體具有靶向配體，諸如單克隆抗體或外源凝集素，粘附到它們的表面，允許與特定受體和/或細(xì)胞類型相互作用?；钚曰蚨鄳B(tài)性脂質(zhì)體包括各種各樣的脂質(zhì)體，它們的共性是在特定相互作用時(shí)傾向于改變它們的相和結(jié)構(gòu)(例如，PH敏感性脂質(zhì)體)(參見例如，Lasic(1997)Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, FL)。支架本文描述的各種實(shí)施方案使用支架或基質(zhì)材料。例如，支架內(nèi)或支架上可以包括細(xì)胞歸巢組合物或脂肪形成組合物。支架任選的不包括移植的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，S卩，沒(méi)有細(xì)胞被用于支架；存在于支架的任何細(xì)胞是遷移入支架內(nèi)的。支架可以由技術(shù)人員利用公認(rèn)有用的任意基質(zhì)材料來(lái)制備?；|(zhì)材料可以是通常形成多孔、微孔(microcelIular)支架的生物相容性材料,其為細(xì)胞遷移提供物理支持物。這種基質(zhì)材料可以:允許細(xì)胞連接和遷移；輸送和保留細(xì)胞和生化因子；啟動(dòng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物和表達(dá)產(chǎn)物的擴(kuò)散；或發(fā)揮一些機(jī)械和生物影響以改變細(xì)胞時(shí)相的特性?；|(zhì)材料通常形成生物相容性材料的多孔、微孔支架，其在體外或體內(nèi)培養(yǎng)期間為細(xì)胞的募集和生長(zhǎng)提供物理支持物和粘附基質(zhì)。合適支架和基質(zhì)材料描述于，例如，Ma and Elisseeff, ed.(2005)Scaffolding In Tissue Engineering, CRC, ISBN 1574445219;Saltzman(2004)TissueEngineering!Engineering Principles for the Design of Replacement Organs andTissues, Oxford ISBN019514130X。例如，基質(zhì)材料可以是，至少部分的，固體異體的(例如，輕基憐灰石)(Kuboki et al.1995Connect Tissue Res32, 219-226;Murata etal.1998Int J Oral Maxillofac Surg27, 391-396),固體異質(zhì)的(聚乙烯多聚體)材料(Saito and Takaoka2003Biomaterials242287 - 93;Isobe et al.1999J Oral MaxillofacSurg57, 695-8)，或自體的凝膠(Sweeney et al.1995.J Neurosurg83, 710-715),異體的(Bax et al.1999Calcif Tissue Int65, 83-89;Viljanen et al.1997Int J OralMaxillofac Surg26, 389-393),或異質(zhì)來(lái)源的(Santos et al.1998.J Biomed MaterRes41, 87-94),以及上述的組合(Alpaslan et al.1996Br J of Oral MaxillofacSurg34, 414-418)。包括支架的基質(zhì)具有足夠的孔隙和足夠的孔徑以便于在細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物整體結(jié)構(gòu)中的細(xì)胞募集和擴(kuò)散。基質(zhì)可以是可生物降解的，以便周圍組織可以吸收基質(zhì)，這可以消除手術(shù)取出的必要性。降解發(fā)生的速率盡可能符合組織或器官形成的速率。因此，當(dāng)細(xì)胞圍繞自身構(gòu)造它們自己的天然結(jié)構(gòu)時(shí)，基質(zhì)能夠提供結(jié)構(gòu)完整性，并最終分解，留下新生組織，新形成的組織或器官，其可以承擔(dān)機(jī)械負(fù)載。在一些配置中，所述基質(zhì)可以是注射用基質(zhì)?？梢允褂们忠u性最小的內(nèi)窺鏡方法，將基質(zhì)輸送到組織。支架可以包括具有不同粘性相的基質(zhì)材料。例如，基質(zhì)可以為基本上液相或基本上膠體相。相之間的轉(zhuǎn)換可以通過(guò)各種因素來(lái)刺激，包括但限于，光、化學(xué)、磁、電、和機(jī)械刺激。例如，基質(zhì)可以是熱敏基質(zhì)，在大約室溫下基本上液相，在大約體溫下基本上膠體相?；|(zhì)的液相具有較低的粘性，其提供生長(zhǎng)因子或其他添加劑的最佳分布以及注射能力，而基質(zhì)的固相具有升高的粘性，其可用于基質(zhì)保留在靶組織上或靶組織內(nèi)。支架可以包括由合成多聚體形成的基質(zhì)材料。這種合成多聚體包括,但不限于,聚氨基甲酸酯、聚正酯、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚乙烯基吡咯烷酮、海洋膠粘劑蛋白、氰基丙烯酸酯，上述物質(zhì)的類似物，混合物、組合和衍生物?？蛇x的，基質(zhì)可以由天然存在的生物聚合物形成。這種天然存在的生物聚合物包括，但不限于，纖維蛋白、纖維蛋白原、纖連蛋白、膠原、和其他合適的生物聚合物。此外，基質(zhì)可以由天然存在的生物聚合物和合成多聚體的混合物形成。

支架可以包括一種或更多種基質(zhì)材料，包括但不限于，膠原凝膠、聚乙烯醇海綿、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)纖維基質(zhì)、丙交酯乙交酯聚合物(polyglactin)纖維、海藻酸鈣凝膠、聚乙醇酸網(wǎng)絲、聚酯(例如，聚(L-乳酸)或聚酐)、多糖(例如藻酸鹽)、聚磷腈、聚丙烯酸酯、或聚環(huán)氧乙烷-聚丙二醇嵌段共聚物?？梢詮牡鞍?例如細(xì)胞外基質(zhì)蛋白諸如纖維蛋白、膠原、和纖連蛋白)、多聚體(例如，聚乙烯吡咯烷酮)、或透明質(zhì)酸來(lái)產(chǎn)生基質(zhì)。還可以使用合成的多聚體，包括可生物蝕解的多聚體(例如，聚(丙交酯)、聚(羥基乙酸)、聚(丙交酯-共乙交酯)、聚(己內(nèi)酯)、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐、聚氨基酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚腈基丙烯酸酯)、可降解的聚氨基甲酸酯、非蝕解的多聚體(例如，聚丙烯酸酯、亞乙基-醋酸乙烯酯多聚體和其他酰基替代的醋酸纖維素及其衍生物)、非蝕解的聚氨基甲酸酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯、聚(乙烯基咪唑)、氯磺化聚烯烴、聚環(huán)氧乙烷、聚乙烯醇，Teilon⑧，或尼龍。支架還可以包括任意其他生物活性分子，例如抗生素或另外的趨化性生長(zhǎng)因子或另一種骨生成、牙質(zhì)生成、釉質(zhì)生成或牙骨質(zhì)生成生長(zhǎng)因子。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)添加例如，人血清白蛋白(HSA)、羥乙基淀粉、葡聚糖、或其組合來(lái)增強(qiáng)支架。用于施用組合物的這些化合物的合適濃度是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，或無(wú)需過(guò)度實(shí)驗(yàn)就可以輕易確定。
支架中化合物或組合物的濃度將隨化合物或組合物的性質(zhì)，其生理作用，以及所需的治療或診斷效果而改變。治療有效量通常是顯示預(yù)期效果而無(wú)過(guò)度毒性的治療劑的足夠濃度。例如，基質(zhì)可以包括采用上述濃度的脂肪形成組合物。作為另一個(gè)實(shí)例，基質(zhì)可以包括采用上述濃度的細(xì)胞歸巢組合物?？梢酝ㄟ^(guò)任意已知的方法將化合物摻入支架或基質(zhì)材料。在一些實(shí)施方案中，將化合物包埋入凝膠，例如，膠原凝膠摻入支架或基質(zhì)材料的孔?？蛇x的，可以使用化學(xué)修飾法將化合物或組合物共價(jià)連接到基質(zhì)材料。使用本領(lǐng)域公知的偶聯(lián)劑諸如醛化合物、碳二亞胺等等，基質(zhì)的表面功能團(tuán)可以與化合物或組合物的活性功能團(tuán)偶聯(lián)，以形成共價(jià)鍵。此外，可以使用間隔物分子在表面反應(yīng)基和生物分子的反應(yīng)基之間制造間隙以允許這種分子在基質(zhì)表面的柔性更高。將生物分子粘附到基質(zhì)內(nèi)部或外部的其他類似方法將是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的?？梢詫⒅Ъ艿目缀屯ǖ罉?gòu)建為具有各種直徑。例如，支架的孔可以具有微米到毫米的直徑范圍。在一些實(shí)施方案中，基質(zhì)材料的孔包括微通道。微通道通常具有約0.1 μ M至約 I, 000 μ Μ，例如，約 50 μ M 至約 500 μ M (例如約 100 μ Μ、150 μ Μ、約 200 μ Μ、約 250 μ Μ、約300 μ Μ、約350 μ Μ、約400 μ Μ、約450 μ Μ、約500 μ Μ、或約550 μ Μ)的平均直徑。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，微通道直徑的分布可具有任意分布，包括正態(tài)分布或非正態(tài)分布。在一些實(shí)施方案中，微通道是基質(zhì)材料天然存在的特征。在其他實(shí)施方案中，微通道是經(jīng)工程化出現(xiàn)在基質(zhì)材料中?？梢允褂脭?shù)種方法來(lái)構(gòu)建多孔支架，包括微粒浸出，氣體發(fā)泡，電旋轉(zhuǎn)，冷凍干燥，從漿液的陶瓷發(fā)泡，以及聚合海綿的形成(參見，實(shí)施例1)?？梢允褂闷渌椒▉?lái)構(gòu)建多孔支架，包括計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD),以及利用Bioplotter合成支架(例如，固體形式自由的構(gòu)建)(例如，Bioplotter , EnvisionTec,德國(guó))?？梢蕴砑拥奖景l(fā)明組合物的生物藥物包括免疫調(diào)節(jié)劑和其他生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑通常包括生物分子(例如，肽，肽片段，多糖，脂質(zhì)，抗體)，它們參與調(diào)節(jié)生物應(yīng)答，諸如免疫應(yīng)答或組織或器官生長(zhǎng)和修復(fù)，以增強(qiáng)具體所需治療功效的方式，例如，細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞溶解或組織-或器官-特異性細(xì)胞的生長(zhǎng)或血管生成。還可以將生物藥物直接摻入基質(zhì)組分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道，或輕易的確定，可以用做合適的非生物和生物藥物的其他物質(zhì)。還可以將本文描述的組合物改造以摻入診斷劑，諸如不透射線的物質(zhì)。這種物質(zhì)的存在允許醫(yī)生監(jiān)測(cè)內(nèi)部發(fā)生的創(chuàng)傷愈合的進(jìn)展。這種化合物包括硫酸鋇以及包含碘的各種有機(jī)化合物。上述后者化合物的實(shí)例包括碘酸胺酸，膽影酸，碘氧胺酸甲基葡胺，碘番酸，以及泛影葡胺衍生物，諸如泛影葡胺鈉。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以輕易地確定可在組合物中使用的其他造影劑，包括，例如，放射性標(biāo)記的脂肪酸或其類似物的使用。組合物中物質(zhì)的濃度將隨化合物的性質(zhì)，其生理作用，以及所需的治療或診斷效果而改變。治療有效量通常是顯示預(yù)期效果而無(wú)過(guò)度毒性的治療劑的足夠濃度。診斷有效量通常是有效監(jiān)測(cè)組織移植物的整合并且將潛在毒性最小化的診斷劑的濃度。無(wú)論如何，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠輕易確定特定情況下具體化合物的所需濃度。植入各種實(shí)施方案提供組合物和方法，通過(guò)使用細(xì)胞歸巢組合物來(lái)募集、歸巢或誘導(dǎo)祖細(xì)胞的分化，隨后使用脂肪形成組合物來(lái)促進(jìn)或誘導(dǎo)募 集的祖細(xì)胞分化形成脂肪或脂肪樣細(xì)胞?？梢詫⒓?xì)胞歸巢組合物，脂肪形成組合物，和支架或基質(zhì)植入對(duì)象，以便募集內(nèi)源祖細(xì)胞進(jìn)入支架或基質(zhì)材料，并將募集的祖細(xì)胞分化為脂肪或脂肪樣細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，提供引起祖細(xì)胞遷移到支架并在支架上分化形成脂肪或脂肪樣細(xì)胞的方法。所述方法包括放置包含細(xì)胞歸巢組合物和脂肪形成組合物(與細(xì)胞液體聯(lián)通)的支架。如本文使用的，如果細(xì)胞沒(méi)有阻止細(xì)胞遷移到支架的物理屏障(例如，基膜、網(wǎng)形結(jié)締組織、脂肪結(jié)締組織等等)，則支架處于與細(xì)胞“液體聯(lián)通”。不受任何具體機(jī)制的束縛，普遍認(rèn)為響應(yīng)細(xì)胞歸巢組合物的存在(形成到細(xì)胞的濃度梯度，從而影響細(xì)胞向著支架上細(xì)胞歸巢組合物的更高濃度遷移)，細(xì)胞從其來(lái)源沿著濕潤(rùn)途徑遷移到支架。支架任選的不包括移植的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，S卩，沒(méi)有細(xì)胞被用于支架；存在于支架的任何細(xì)胞是遷移入支架內(nèi)的。通常理解支架是三維結(jié)構(gòu)，當(dāng)支架置于組織部位時(shí)，細(xì)胞、組織、血管等等可以在其中生長(zhǎng)、定殖和繁殖。方法的支架可以如本文所討論。本文描述的組合物和方法具有重要的臨床價(jià)值，這是因?yàn)樗鼈兡技瘍?nèi)源祖細(xì)胞的能力，從而可選的避免給對(duì)象移植細(xì)胞。治療需要的確定一般通過(guò)處于爭(zhēng)論中的(atissue)符合組織或器官缺陷的病史和身體檢查來(lái)評(píng)價(jià)。需要本文所述治療方法和組合物的對(duì)象可以是患有、診斷患有、疑似患有組織或器官缺陷(諸如軟組織缺陷)的對(duì)象或具有患上述缺陷的風(fēng)險(xiǎn)的對(duì)象。軟組織缺陷通常理解為皮膚皮下脂肪層內(nèi)的空隙，這經(jīng)常導(dǎo)致“正?！苯M織輪廓的改變。軟組織缺陷包括，但不限于，外傷性損傷(例如，顯著燒傷)，腫瘤切除術(shù)(例如，乳房切除術(shù)和癌切除)，和先天性缺陷。可通過(guò)本文所述方法治療的各種病癥的診斷在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。對(duì)象可以是動(dòng)物對(duì)象，包括但不·限于，哺乳動(dòng)物、爬行動(dòng)物、和鳥類，更優(yōu)選馬、牛、狗、貓、綿羊、豬、小鼠、大鼠、猴、豚鼠、和雞，和最優(yōu)選人。細(xì)胞歸巢組合物的有效量是可以誘導(dǎo)祖細(xì)胞募集或祖細(xì)胞遷移的量。脂肪形成組合物的有效量是可以誘導(dǎo)祖細(xì)胞分化為脂肪或脂肪樣細(xì)胞的量。包含細(xì)胞歸巢組合物和脂肪形成組合物的支架或基質(zhì)材料的有效量是可以誘導(dǎo)祖細(xì)胞募集或祖細(xì)胞遷移并誘導(dǎo)募集的祖細(xì)胞分化為脂肪或脂肪樣細(xì)胞的量。包含細(xì)胞歸巢組合物和脂肪形成組合物的支架或基質(zhì)材料的有效量是可以募集和誘導(dǎo)足夠數(shù)量的祖細(xì)胞遷移，并誘導(dǎo)至少一部分募集的祖細(xì)胞形成脂肪或脂肪樣細(xì)胞以便增加組織或器官的生物功能的量。包含細(xì)胞歸巢組合物和脂肪形成組合物的支架或基質(zhì)材料的有效量是恢復(fù)軟組織功能或外觀的量。作為一個(gè)實(shí)例，有需求的對(duì)象可以具有至少約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、約90%或更高的脂肪細(xì)胞或組織缺陷，本文描述的組合物和方法可以提供脂肪細(xì)胞或組織的數(shù)目或功能的增加。作為另一個(gè)實(shí)例，有需求的對(duì)象具有組織或器官的損傷，所述方法提供組織或器官生物功能的增加至少約5%、約10%、約25%、約50%、約75%、約90%、約100%、或約200%，或甚至差不多約300%、約400%、或約500%。仍作為另一個(gè)實(shí)例，有需求的對(duì)象可能患有脂肪相關(guān)疾病，失常，或病癥，所述方法提供工程化的支架，其足以募集祖細(xì)胞并形成脂肪細(xì)胞或組織，足以改善或穩(wěn)定疾病、失?；虿“Y。例如，對(duì)象可能患有導(dǎo)致脂肪細(xì)胞損失、萎縮、功能異常和/或死亡的疾病，失常或病癥。在另一個(gè)實(shí)例中，有需求的對(duì)象可能具有增加的患上疾病、失?；虿“Y(可以通過(guò)所述方法延遲或預(yù)防)的風(fēng)險(xiǎn)。仍作為另一個(gè)實(shí)例，有需求的對(duì)象可能經(jīng)歷脂肪細(xì)胞的死亡或功能異常，這是因?yàn)橛糜谥委熈硪患膊』虿“Y的藥物的副作用，例如作為治療多發(fā)性硬化的Copaxone (醋酸格拉替雷)的使用；*HIV陽(yáng)性個(gè)體中抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的使用。組織或器官可以選自脂肪、膀胱、腦、神經(jīng)組織、神經(jīng)膠質(zhì)、食管、輸卵管、心臟、胰、腸、膽囊、腎、肝、肺、卵巢、前列腺、脊髓、脾、胃、精巢、胸腺、甲狀腺、氣管、泌尿生殖道、輸尿管、尿道、子宮、乳腺、骨骼肌、皮膚、牙齒、骨、和軟骨。祖細(xì)胞可以來(lái)自在其中移植支架和/或基質(zhì)的同一對(duì)象?？蛇x的，祖細(xì)胞可以來(lái)自于相同種屬，或甚至不同的種屬。工程化構(gòu)建體的植入屬于本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。支架或基質(zhì)材料可以完全或部分植入對(duì)象的組織或器官以成為其的功能部分。優(yōu)選的，植入物最初通過(guò)細(xì)胞單層與宿主連接和相通。隨時(shí)間推移，內(nèi)源細(xì)胞可以遷移入支架以形成組織。圍繞工程化組織的細(xì)胞可以被生物活性物質(zhì)所吸引，包括生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑，諸如多糖、蛋白、肽、基因、抗原，和抗體，其可以選擇性摻入基質(zhì)以提供所需的選擇性，例如，將細(xì)胞受體連接到基質(zhì)，刺激細(xì)胞遷移入基質(zhì)，或上述兩者?；|(zhì)可以包括膠體相和互連通道，以允許通過(guò)生物和物理-化學(xué)梯度增強(qiáng)細(xì)胞遷移。例如，圍繞植入基質(zhì)的細(xì)胞可以被生物活性物質(zhì)(包括IGFl和bFGF)所吸引。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚并知道如何使用適合于將細(xì)胞吸引到基質(zhì)的其他生物活性物質(zhì)。本文描述的方法，組合物，和裝置可以包括利用一種或更多種酶，離子，生長(zhǎng)因子，和生物藥劑(諸如凝血酶和鈣)，或其組合的同時(shí)或連續(xù)治療。本文描述的方法，組合物，和裝置可以包括利用非生物和/或生物藥物的同時(shí)或連續(xù)治療。當(dāng)用于本文描述的治療時(shí)，治療有效量的脂肪形成組合物或細(xì)胞歸巢組合物可以使用純化形式(當(dāng)存在這種形式時(shí))，或采用藥學(xué)上可接受的鹽形式并且包含或不包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。例如，可以采用能夠增加組織或器官的生物功能的足夠量，按照適合于任意醫(yī)學(xué)治療的合理受益/風(fēng)險(xiǎn)比施用本文描述的化合物，。與藥學(xué)上可接受的載體組合產(chǎn)生單劑型的本文所述組合物的量將根據(jù)接受治療的宿主和具體的施用方式而改變。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，每種劑型的單獨(dú)計(jì)量包含的藥劑單位含量無(wú)需自身構(gòu)成治療有效量，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)施用大量單獨(dú)劑量達(dá)到必需的治療有效量。可以通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)物和/或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中測(cè)定LD5tl(導(dǎo)致50%群體死亡的劑量)和ED50 (在50%群體中治療有效的劑量)的標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)步驟來(lái)確定本文所述組合物的毒性和治療效果，毒性和治療效果的劑量比值是療效指數(shù)，其可以表示為L(zhǎng)D5(i/ED5(i的比值，其中優(yōu)選高的療效指數(shù)。針對(duì)任意特定患者的具體治療有效劑量水平取決于各種因素，包括待治療的病癥和病癥的嚴(yán)重程度；治療部位的位置和大??；使用的具體化合物的活性；使用的具體組合物；患者的年齡，體重，全身健康狀況，性別和飲食；施用時(shí)間；施用途徑；所用組合物的排泄速率；治療的持續(xù)時(shí)間；與所用具體化合物聯(lián)合或者同時(shí)使用的藥物；以及醫(yī)藥領(lǐng)域公知的類似因素。(參見例如，Koda-Kimble et al.(2004)Applied Therapeutics:TheClinical Use of Drugs, Lippincott ffilliams&ffilkins, ISBN0781748453;ffinter(2003)Basic Clinical Pharmacokinetics, 4th ed.,Lippincott ffilliams&ffilkins, ISBN0781741475;Sharqel(2004)Applied Biopharmaceutics&Pharmacokinetics, McGraw-Hill/Appleton&Lange, ISBN0071375503)。例如，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員都清楚組合物的起始劑量水平低于要 求實(shí)現(xiàn)所需治療效果的水平，逐漸增加劑量直到實(shí)現(xiàn)所需治療效果。如果需要，為了施用，有效的每日劑量可以分成多個(gè)劑量。因此，單次劑量的組合物可以包含這種量或者其小部分(submultiples)以構(gòu)成每日劑量。但是應(yīng)該理解,本發(fā)明化合物和組合物的總體每日使用將由主治醫(yī)師在合理醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)來(lái)決定。組合物或包括本文所述組合物的支架的施用可以作為單個(gè)事件發(fā)生，或在治療的時(shí)程內(nèi)發(fā)生。例如，施用可以是每天，每周，每?jī)芍?，或每月的?？梢栽谟糜诮M織或器官缺陷的常規(guī)治療方式之前、同時(shí)或之后進(jìn)行根據(jù)本文所述方法的治療。組合物或包括本文所述組合物的支架可以與另一藥劑(諸如抗生素、抗炎藥)，或另一藥劑同時(shí)或順序施用。例如，施用可以與另一藥劑(諸如抗生素或抗炎藥)同時(shí)進(jìn)行。試劑盒還提供試劑盒。這種試劑盒可以包括本文描述的藥劑或組合物和，在一些實(shí)施方案中，施用說(shuō)明。這種試劑盒便于實(shí)施本文描述的方法。當(dāng)作為試劑盒提供時(shí)，組合物的不同組分可以包裝在分開的容器中，并在使用前立即混合。組分包括，但不限于支架，基質(zhì)材料，細(xì)胞歸巢組合物，脂肪形成組合物，和控釋系統(tǒng)，諸如微球，任選的包裹其他組分。如果需要，組分單獨(dú)的這種包裝可以存在于包裝或分配裝置中，其包括一個(gè)或更多個(gè)含有組合物的單位劑型。包裝可以，例如，包括金屬或塑料薄膜諸如泡狀包裝。在一些情況下，組分單獨(dú)的這種包裝還可以允許長(zhǎng)期保存，并且不損失組分的活性。試劑盒也可以在分開的容器中包括試劑，諸如例如，待添加到凍干活性成分的無(wú)菌水或鹽水單獨(dú)包裝。例如，密封的玻璃安瓿可以包含凍干組分，并且在分開的安瓿中，無(wú)菌水、無(wú)菌鹽水或無(wú)菌，它們中每種均在中性非反應(yīng)氣體(諸如氮?dú)?中包裝。安瓿可以由任意合適材料組成，諸如玻璃，有機(jī)聚合物，諸如聚碳酸酯，聚苯乙烯，陶瓷，金屬或通常用于保存試劑的任意其他材料。合適容器的其他實(shí)例包括瓶子(可以由安瓿的類似物質(zhì)制備)，和封套(可以由箔襯里內(nèi)面諸如鋁或合金組成)。其他的容器包括試管，小瓶，長(zhǎng)頸瓶，瓶子，注射器等等。容 器可以具有無(wú)菌進(jìn)入孔，諸如具有塞子(可以通過(guò)皮下注射針頭刺入)的瓶子。其他容器可以具有可被輕易去除的膜分隔的兩個(gè)小室，所述膜在去除時(shí)允許組分混合?？沙サ哪た梢允遣Ａ?，塑料，橡膠，等等。在一些實(shí)施方案中，試劑盒提供說(shuō)明材料。說(shuō)明書可以打印在紙或其他基質(zhì)上，和/或作為電子可讀的介質(zhì)提供，諸如軟盤，迷你CD-ROM，CD-ROM，DVD-ROM，Zip盤，錄像帶，錄音帶，等等。詳細(xì)的說(shuō)明書可以不與試劑盒實(shí)際上在一起；反之，可以將用戶導(dǎo)向由試劑盒的制造商或批發(fā)商指定的因特網(wǎng)站點(diǎn)。本文描述的利用分子生物學(xué)方案的組合物和方法是依照本領(lǐng)域已知的各種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(參見，例如，Sambrook and Russel (2006) Condensed Protocols from MolecularCloning:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ISBN-10:0879697717;Ausubel et al.(2002)Short Protocols in Molecular Biology,5thed.，Current Protocols, ISBN-10:0471250929;Sambrook and Russel(2001)MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN-10:0879695773;Elhaij J.and WolkjC.P.1988.Methods in Enzymology167, 747-754;Studier (2005)Protein Expr Purif.41(I), 207 - 234;Gellissenj ed.(2005)Production ofRecombinant Proteins:Novel Microbial and Eukaryotic Expression Systems, Wiley-VCH, ISBN-10:3527310363;Baneyx(2004)Protein Expression Technologies, Taylor &Francis, ISBN-10:0954523253)。本文描述的定義和方法是提供用于更好的限定本發(fā)明并指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)應(yīng)由相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)用法來(lái)理解。在一些實(shí)施方案中，表示成分?jǐn)?shù)量、特性諸如分子量，反應(yīng)條件等等的數(shù)字(用于描述和要求本文描述的一些實(shí)施方案)，應(yīng)被理解為在一些情況下被術(shù)語(yǔ)“約”修飾。在一些實(shí)施方案中，術(shù)語(yǔ)“約”用于表示，數(shù)值包括用于確定該數(shù)值的裝置或方法的平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差。在一些實(shí)施方案中，在所寫說(shuō)明書和所附權(quán)利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其取決于通過(guò)具體實(shí)施方案設(shè)法獲得的所需特性可以不同。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)當(dāng)根據(jù)報(bào)道的有效數(shù)字的數(shù)目并通過(guò)應(yīng)用常規(guī)舍入技術(shù)來(lái)解釋數(shù)值參數(shù)。盡管闡述本文描述的一些實(shí)施方案的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但在具體實(shí)施例中闡述的數(shù)值應(yīng)盡可能精確的報(bào)告。在本文所述一些實(shí)施方案中存在的數(shù)值必然的包含某些誤差，這是由它們各自的試驗(yàn)測(cè)量中發(fā)現(xiàn)的標(biāo)準(zhǔn)差產(chǎn)生的。本文數(shù)值范圍的描述僅僅旨在用做分別涉及范圍內(nèi)每個(gè)單獨(dú)值的簡(jiǎn)寫方法。除非本文另外指出，每個(gè)單獨(dú)值都被引入說(shuō)明書中，就像它是分別在本文中敘述的一樣。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)用于描述具體實(shí)施方案的情況下(特別是在某些下列權(quán)利要求的情況下)，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)(a) ”和“一個(gè)(an) ”和“the”以及類似的參考應(yīng)被解釋為包括單數(shù)和復(fù)數(shù)，除非其他地方特別作注明。在一些實(shí)施方案中，如本文使用的術(shù)語(yǔ)“或”，包括權(quán)利要求在內(nèi)，用于表示“和/或”，除非明確地表示只涉及二個(gè)中的一個(gè)或備選物是互相排斥的。術(shù)語(yǔ)“包括”、“具有”和“包含”是開放式的聯(lián)系動(dòng)詞。一種或更多種這些動(dòng)詞的任意形式或時(shí)態(tài)，諸如“包括(comprises), ” “包括(comprising), ” “具有(has), ” “具有(having)，” “包含(includes) ”和“包含(including)，”也是開放式的。例如，“包括(comprises), ” “具有(has)”或“包含(includes) ” 一個(gè)或更多個(gè)步驟的任意方法不限于只具有一個(gè)或更多個(gè) 步驟，還可以包括其他沒(méi)有列出的步驟。類似地，“包括(comprises), ” “具有(has)”或“包含(includes) ” 一個(gè)或更多個(gè)特征的任意組合物或裝置不限于只具有一個(gè)或更多個(gè)特征，可以包括其他沒(méi)有列出的特征。本文描述的所有方法可以按照任何合適的順序進(jìn)行，除非本文另外指出，或另外根據(jù)背景明顯抵觸。根據(jù)本文一些實(shí)施方案提供的任意和所有實(shí)施例或示例性語(yǔ)言(例如，“諸如”)的使用僅僅是為了更好的說(shuō)明本發(fā)明，不是為了給本文描述的范圍做出限制，除非另有要求。說(shuō)明書中沒(méi)有語(yǔ)言應(yīng)理解為指示任意未要求的要素是實(shí)施本文內(nèi)容必需的。本文公開的替代性元件或?qū)嵤┓桨傅姆纸M不應(yīng)理解為限制。每組成員可以單獨(dú)提及和要求，或與組內(nèi)的其他成員或本文發(fā)現(xiàn)的其他元件任意組合。為了方便或可專利性，組內(nèi)的一個(gè)或更多個(gè)成員可以包括在組中或從組內(nèi)去除。當(dāng)存在任意這種包括或去除時(shí)，說(shuō)明書在此處應(yīng)認(rèn)為包含修改的組，從而滿足用于所附權(quán)利要求的所有Markush分組的文字說(shuō)明。本文參考文獻(xiàn)的引用不應(yīng)被理解為承認(rèn)這類參考文獻(xiàn)對(duì)于本發(fā)明來(lái)說(shuō)是現(xiàn)有技術(shù)。已經(jīng)詳細(xì)的描述了本發(fā)明，顯而易見的是，在不脫離所附權(quán)利要求限定的本文內(nèi)容的范圍的情況下，改變、變化和等同實(shí)施方案是可能的。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本文內(nèi)容的所有實(shí)施例作為非限制性的實(shí)施例提供。
實(shí)施例提供下列非限制性的實(shí)施例以進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下列實(shí)施例公開的技術(shù)代表本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的在實(shí)施本文內(nèi)容時(shí)作用良好的方法，因此可以被認(rèn)為構(gòu)成其實(shí)施方式的實(shí)施例。但是，在本文內(nèi)容的引導(dǎo)下，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，在公開的具體實(shí)施方案中可以進(jìn)行許多變化，仍然獲得相同或相似的結(jié)果，并且不脫離本文內(nèi)容的精神和范圍。實(shí)施例1本實(shí)施例顯示在體外和體內(nèi)的細(xì)胞歸巢入支架和脂肪形成。制備多孔聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)支架。將兩克85:15PLGA溶于30ml的雙氯甲烷(DCM)。為了產(chǎn)生多孔支架，使用鹽析(salt-leaching)方法。篩選NaCl晶體以產(chǎn)生130 μ M到600 μ M范圍的晶體。將PLGA溶液輕輕的澆注到18克篩選的NaCl晶體，允許DCM在通風(fēng)櫥中蒸發(fā)過(guò)夜。次日，將5μ M直徑的圓盤從PLGA穿孔。將盤置于蒸餾水中48小時(shí)，在前8個(gè)小時(shí)每小時(shí)換水，在剩余時(shí)間每天換兩次水。然后將支架凍干48小時(shí)以去除剩余溶劑，并在_20°C保存。使用前，將支架在70%乙醇中滅菌30分鐘，然后用PBS洗滌2*30分鐘，然后在BME培養(yǎng)基中浸泡兩小時(shí)。制備兩種類型的微球，一種用胰島素樣生長(zhǎng)因子I(IGFl)包裹，另一種用來(lái)自脂肪形成誘導(dǎo)培養(yǎng)基的補(bǔ)充劑包裹，標(biāo)注為脂肪形成微球。對(duì)于這兩種類型，將250mg的50:50PLGA溶于Iml DCM0然后，向PLGA溶液中添加10 μ g IGF-1，或5.15mg吲哚美辛、Img胰島素、11.1mg3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和39.2 μ g地塞米松的組合。然后將微球凍干48小時(shí)以去除溶劑，并在_20°C保存。使用前，微球用環(huán)氧乙烷滅菌。
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在BME培養(yǎng)基中擴(kuò)增小鼠間充質(zhì)細(xì)胞系C3H10T1/2(ATCC，Manassas, VA)。用綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白(Invitrogen，Carlsbad，CA)雙轉(zhuǎn)染細(xì)胞。當(dāng)獲得足夠細(xì)胞時(shí)，收集細(xì)胞，并重懸于 BD Puramatrix 水凝膠溶液(BD Biosciences, San Jose, CA)。將 PLGA 微球添加到懸液，將溶液添加到PLGA支架以允許固化。設(shè)計(jì)總共6組:(i)空支架；(ii)種有5X IO5個(gè)細(xì)胞的小鼠間充質(zhì)細(xì)胞系C3H10T1/2的支架；(iii)具有包裹在微球中的脂肪形成因子IBMX、吲哚美辛、地塞米松和胰島素的混合物的支架；(iv)具有脂肪形成微球和5X 105C3H10Tl/2細(xì)胞的支架；(V)具有包裹在微球中的胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGFl)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的支架；和(vi)具有bFGF&IGFl微球和5X 105C3H10Tl/2細(xì)胞的支架。將支架移植入肥胖C57BL/6N小鼠的腹部脂肪墊兩周。C57BL/6NHsd購(gòu)自Harlan Laboratories (Indianapolis, IN),并喂食含有 60%Kcal 脂肪的高熱量膳食TD.06414(Harlan laboratories),以產(chǎn)生具有大的脂肪墊的肥胖小鼠。出于外科手術(shù)目的，使用14-15周齡小鼠。使用1-5%的異氟烷鎮(zhèn)靜小鼠，在下腹部區(qū)域造成1.5-2cm切口。在皮下脂肪墊造成更小的切口 0.5-lcm，將支架放置在那里。使用細(xì)胞和微球的6種不同組合:空支架，具有500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架，具有5mg脂肪形成微球的支架，具有5mg脂肪形成微球和500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架，具有2.5mg IGF-1微球的支架，具有2.5mgIGF-1微球和500K C3H10T1/2細(xì)胞的支架。兩周后收集全部支架。通過(guò)在體外微包裹的脂肪形成因子從微球的釋放來(lái)鑒定培養(yǎng)時(shí)C3H10T1/2細(xì)胞的脂肪形成和增殖。體內(nèi)移植后兩周，收集組織移植物并切片。結(jié)果顯示脂肪形成的劑量依賴性增加(參見例如，圖1)。與空支架(即，組⑴)或只添加脂肪形成混合物微球的支架(即，組(iii))(參見例如，圖2A和圖3A;圖2C和3C)相比，種有5x10s個(gè)細(xì)胞的支架(即，組(ii))以及具有微包裹bFGF和IGFl的支架(S卩，組(V))具有有效的脂肪組織形成(參見例如，圖2B和圖3B;圖2D和圖3D)。與種有5x105ASCs或添加bFGF和IGFl微球的支架(參見例如，圖2F和圖3F)相比，添加bFGF和IGFl微球的支架(參見例如，圖2E和圖3E)具有實(shí)質(zhì)的脂肪組織形成。因此，包括胰島素，吲哚美辛，IBMX和地塞米松的混合物的控釋在體內(nèi)和體外均誘導(dǎo)脂肪形成。這種混合物可用于分化來(lái)自宿主組織的脂肪前細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞。如上所示，脂肪形成混合物微球在體內(nèi)和體外均促進(jìn)脂肪形成。bFGF和IGFl的組合導(dǎo)致宿主細(xì)胞的歸巢。預(yù)期 脂肪形成混合物微球以及bFGF和IGFl的組合將導(dǎo)致宿主細(xì)胞的歸巢，并在體外和體內(nèi)促進(jìn)脂肪形成。實(shí)施例2本實(shí)施例顯示Y分泌酶抑制劑增強(qiáng)脂肪形成。在3天內(nèi)按照10 μ M的優(yōu)化濃度輸送EGFR拮抗劑(Y分泌酶抑制劑)導(dǎo)致脂肪干細(xì)胞(ASCs)的有效脂肪形成，脂肪形成特異性標(biāo)記物諸如PPARii 2，Glut4表達(dá)增加最高10倍，以及LEPR加速表達(dá)。定量來(lái)說(shuō)，4周后，用EGFR拮抗劑處理的ASCs的甘油和瘦素含量顯著高于無(wú)EGFR拮抗劑的。總之，ASCs的脂肪形成分化能力恢復(fù)到無(wú)HSC共培養(yǎng)的類似水平。所以，向脂肪形成培養(yǎng)基中添加50ng/mL濃度的內(nèi)源EGF進(jìn)一步抑制脂肪形成。上述結(jié)果顯示，通過(guò)減弱抑制劑諸如在造血干細(xì)胞(其共培養(yǎng)被發(fā)現(xiàn)抑制脂肪形成)中富集的EGF受體可以增強(qiáng)脂肪形成。實(shí)施例3本實(shí)施例顯示，當(dāng)與脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM)比較時(shí)，用Y分泌酶抑制劑處理hADSCs是PPAR Y表達(dá)的有效上調(diào)因素。hADSCs中PPAR Y表達(dá)的改變持續(xù)28天。用下述物質(zhì)處理hADSCs:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ;ADM力口 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2);以及 ADM 加 10 μ M Inhl 和 Inh2 (ADM+Inhl, 2)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的ADM相比，所述兩類抑制劑處理，分別的，更有效上調(diào)PPAR Y表達(dá)。此外，Inhl和Inh2的組合處理(ADM+Inhl, 2)比ADM和單獨(dú)的抑制劑I或2更有效的誘導(dǎo)體外hADSCs的PPAR Y表達(dá)(參見例如，圖4)。實(shí)施例4本實(shí)施例顯示，與ADM相比，用抑制劑處理hADCs是C/ΕΒΡα表達(dá)的有效上調(diào)因素。hADSCs的C/EBP α表達(dá)改變持續(xù)28天。用下述物質(zhì)處理hADSCs:對(duì)照培養(yǎng)基；月旨肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ;ADM加10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2);以及 ADM 加 10 μ M Inhl 和 Inh2 (ADM+Inhl, 2)。結(jié)果顯示，與單獨(dú)的ADM相比，所述兩類抑制劑處理更有效的上調(diào)C/EBP α表達(dá)。此外，Inhl和Inh2的組合處理(ADM+Inhl, 2)比ADM和單獨(dú)的抑制劑I或2更有效的誘導(dǎo)體外hASCs的C/ΕΒΡ α表達(dá)(參見例如，圖5)。實(shí)施例5本實(shí)施例顯示，Inhl和Inh2 (ADM+Inhl, I)以及Inhl (ADM+Inhl)的組合處理比單獨(dú)的ADM或ADM+Inh2更有效的誘導(dǎo)hASCs中的脂質(zhì)積聚。用下述物質(zhì)處理hADSCs后四周產(chǎn)生亮視野圖像:(A) ADM;⑶ADM+Inhl; (C)ADM+Inh2;和(D) ADM+Inhl, 2 (參見例如，圖 6A-D)。上述hADSCs脂質(zhì)染色的圖像在亮視野圖像上重疊，表明Inhl和Inh2 (ADM+Inhl, 2)以及Inhl (ADM+Inhl)的組合處理更有效的誘導(dǎo)體外hADSCs中的脂質(zhì)積聚(參見例如，圖 6A1-D1)。實(shí)施例6本實(shí)施例顯示，組合的Inhl和Inh2處理更有效的起始體外脂聯(lián)素細(xì)胞因子的分泌。在處理后兩和四周，測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的脂聯(lián)素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ; ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl)(ADM+Inhl) ; ADM 加 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2)，以及 ADM 力口 10 μ M Inhl 和Inh2 (ADM+Inhl, 2)。結(jié)果顯示，Inhl和Inh2的組合處理(ADM+Inhl, 2組)在第二和四周更有效的起始體外脂聯(lián)素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，圖7)。實(shí)施例7本實(shí)施例顯示抑制劑處理沒(méi)有成功的上調(diào)瘦素。在處理后兩和四周，測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的瘦素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加10 μ M Notch Y分泌酶抑制劑(Inhl) (ADM+Inhl) ;ADM力口 10 μ M MAPK 抑制劑(Inh2) (ADM+Inh2)，以及 ADM 加 10 μ M Inhl 和 Inh2 (ADM+Inhl, 2)。結(jié)果顯示，沒(méi)有抑制劑在體外有效上調(diào)瘦素細(xì)胞因子的分泌。實(shí)際上，Inh2處理(ADM+Inh2和ADM+Inhl, 2組)在體外進(jìn)一步下調(diào)瘦素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，圖8)。實(shí)施例8本實(shí)施例顯示,與單獨(dú)的ADM相比，與ADM—起的Pyrintegrin處理更有效的在體外誘導(dǎo)hADSCs的PPAR Y表達(dá)。測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的PPAR Y表達(dá)共28天:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM)；以及 ADM 力卩 2 μ M Pyrintegrin (ADM+Pyrintegrin)。結(jié)果顯示，與脂肪形成培養(yǎng)基一起的Pyrintegrin處理更有效的在體外誘導(dǎo)hADSCs的PPAR Y表達(dá)(參見例如，圖9)。實(shí)施例9本實(shí)施例顯示,與單獨(dú)的ADM相比，與ADM—起的Pyrintegrin處理更有效的在體外誘導(dǎo)hADSCs的C/ΕΒΡ α表達(dá)。測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的C/ΕΒΡα表達(dá)共28天:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM);以及 ADM 力卩 2 μ M Pyrintegrin (ADM+Pyrintegrin)。結(jié)果顯示，與脂肪形成培養(yǎng)基一起的Pyrintegrin處理更有效的在體外誘導(dǎo)hADSCs的C/EBP α表達(dá)(參見例如，圖10)。實(shí)施例10本實(shí)施例顯示,與單獨(dú)的ADM處理相比，除了 ADM之外用Pyrintegrin處理hADSCs更有效的誘導(dǎo)脂質(zhì)積聚。用下述物質(zhì)處理hADSCs四周后進(jìn)行脂質(zhì)染色:⑷ADM ；和(B)ADM加Pyrintegrin (ADM+Pyrintegrin)。結(jié)果顯示與脂肪形成培養(yǎng)基一起的Pyrintegrin處理更有效的在體外誘導(dǎo)hADSCs的脂質(zhì)積聚(參見例如，圖11A-B)。實(shí)施例11本實(shí)施例顯示不含ADM的Pyrintegrin體外誘導(dǎo)hADSCs的脂肪形成分化。在用下述物質(zhì)處理hADSCs的處理后第四天，測(cè)量PPAR Y和C/ΕΒΡ α基因表達(dá):對(duì)照培養(yǎng)基(對(duì)照);對(duì)照培養(yǎng)基加2 μ M Pyrintegrin (對(duì)照+藥物2 μ Μ);對(duì)照培養(yǎng)基加10 μ M Pyrintegrin (對(duì)照+藥物10 μ Μ)和脂肪形成培養(yǎng)基(ADM)。結(jié)果顯示單獨(dú)的Pyrintegrin可以在體外誘導(dǎo)hADSCs朝向脂肪形成分化途徑(參見例如，圖12)。實(shí)施例12本實(shí)施例顯示,與ADM—起的Pyrintegrin處理增強(qiáng)hADSCs的脂聯(lián)素細(xì)胞因子分泌。

在處理后兩周和四周，測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的脂聯(lián)素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM)；以及ADM加2 μ M Pyrintegrin (ADM+藥物)。結(jié)果顯示，與脂肪形成培養(yǎng)基一起的Pyrintegrin處理增強(qiáng)體外脂聯(lián)素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，圖13)。實(shí)施例13本實(shí)施例顯示,利用Pyrintegrin和ADM的hADSCs處理顯示體外瘦素細(xì)胞因子的增強(qiáng)分泌。在處理后兩周和四周，測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的瘦素含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM)；以及ADM加2 μ M Pyrintegrin (ADM+藥物)。結(jié)果顯示，與脂肪形成培養(yǎng)基一起的Pyrintegrin處理增強(qiáng)體外瘦素細(xì)胞因子的分泌(參見例如，圖14)。實(shí)施例14本實(shí)施例顯示,利用Pyrintegrin和ADM的hADSCs處理顯示體外甘油的增強(qiáng)分泌。在處理后兩周和四周，測(cè)量用下述物質(zhì)處理的hADSCs中的甘油含量:對(duì)照培養(yǎng)基；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM)；以及ADM加2 μ M Pyrintegrin (ADM+藥物)。結(jié)果顯示，與脂肪形成培養(yǎng)基一起的Pyrintegrin處理增強(qiáng)體外甘油的分泌(參見例如，圖15)。實(shí)施例15本實(shí)施例顯示,通過(guò)hADSCs的Western印跡分析證明Pyrintegrin是BMP途徑抑制劑。
在用下述物質(zhì)處理的hADSCs中，處理后I小時(shí)進(jìn)行Western印跡分析:對(duì)照培養(yǎng)基(對(duì)照)；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)；和單獨(dú)的Pyrintegrin (藥物)。結(jié)果顯示，Pyrintegrin是BMP途徑抑制劑，因?yàn)樗柚筍madl/5/8的磷酸化(參見例如，圖16)。實(shí)施例16本實(shí)施例顯示Pyrintegrin不是TGF β /活化素途徑抑制劑。

在用下述物質(zhì)處理的hADSCs中，處理后I小時(shí)進(jìn)行Western印跡分析:對(duì)照培養(yǎng)基(對(duì)照)；脂肪形成分化培養(yǎng)基(ADM) ;ADM加2μΜ Pyrintegrin(ADM+藥物)；和單獨(dú)的Pyrintegrin (藥物)。結(jié)果顯示，Pyrintegrin不祀向TGFβ /活化素途徑(參見例如，圖17)。
權(quán)利要求
1.形成脂肪組織的方法，包括 提供包括有效量的(i)細(xì)胞歸巢組合物和(ii)脂肪形成組合物的支架； 將支架置于與祖細(xì)胞液體聯(lián)通； 誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上；和 誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞，其中所述支架不包括移植的細(xì)胞。
2.治療患有軟組織缺陷的對(duì)象的方法，所述方法包括 將包括有效量的(i)細(xì)胞歸巢組合物和(ii)脂肪形成組合物的支架植入有需要的對(duì)象，其中所述支架在植入前不包括移植的細(xì)胞，其中有效量的細(xì)胞歸巢組合物誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上，并且其中有效量的脂肪形成組合物誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞。
3.軟組織構(gòu)建體,包括 支架，其包括 有效量的細(xì)胞歸巢組合物；和 有效量的脂肪形成組合物， 其中，所述支架不包括移植的細(xì)胞，其中當(dāng)支架與祖細(xì)胞液體聯(lián)通時(shí)有效量的細(xì)胞歸巢組合物能誘導(dǎo)祖細(xì)胞遷移至支架內(nèi)或支架上，并且其中有效量的脂肪形成組合物能誘導(dǎo)從祖細(xì)胞形成脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的 方法或構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞歸巢組合物包括 胰島素樣生長(zhǎng)因子I (IGFl)； 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF);或 IGFl 和 bFGF。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述細(xì)胞歸巢組合物包括 約O. 1/250至約250/250 ( μ g IGFl每mg支架)比例的IGFl ;或 約 O. 1/250 至約 250/250 ( μ g bFGF 每 mg 支架)比例的 bFGF。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述脂肪形成組合物包括吲哚美辛、胰島素、異丁基-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、或Pyrintegrin中的一種或多種。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述脂肪形成組合物包括 約O. 1/250至約250/250 (mg吲哚美辛每mg支架)比例的吲哚美辛； 約O. 1/250至約250/250 (mg胰島素每mg支架)比例的胰島素； 約 O. 1/250 至約 250/250 (mg IBMX 每 mg 支架)比例的 IBMX ； 約O. 1/250至約250/250 (mg地塞米松每mg支架)比例的地塞米松；或 約 O. 1/250 至約 250/250 (mg Pyrintegrin 每 mg 支架)比例的 Pyrintegrin0
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述祖細(xì)胞選自脂肪組織來(lái)源的細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、MSC來(lái)源的細(xì)胞、和脂肪細(xì)胞。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述支架包括生物相容性基質(zhì)材料。
10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述支架包括聚(乳酸-共-羥基乙酸)(PLGA)。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述支架包括至少一個(gè)物理通道。
12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述祖細(xì)胞以約O.0001百萬(wàn)細(xì)胞(M) πιΓ1至約IOOOM πιΓ1的密度存在于支架中。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述脂肪細(xì)胞或脂肪樣細(xì)胞以約O. 0001百萬(wàn)細(xì)胞(Μ)ι Γ1至約1000Μ πιΓ1的密度存在于支架中。
14.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述支架、所述細(xì)胞歸巢組合物、或所述脂肪形成組合物包括Y分泌酶抑制劑。
15.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述支架、所述細(xì)胞歸巢組合物、或所述脂肪形成組合物包括有效減輕、實(shí)質(zhì)上減輕、或消除祖細(xì)胞含有的EGF受體所引起的脂肪形成抑制的量的Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑。
16.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法或構(gòu)建體，其中所述支架、所述細(xì)胞歸巢組合物、或所述脂肪形成組合物包括約I. O μ M至約100 μ M的濃度的、或約O. 1/250至約250/250 ( μ g抑制劑每mg支架 )的比例的Y分泌酶抑制劑、Notch Y分泌酶抑制劑、或MAPk抑制劑。
全文摘要
提供一種引起細(xì)胞遷移到支架并在該處分化以形成脂肪細(xì)胞或組織或者脂肪樣細(xì)胞或組織的方法。還提供一種治療患有組織缺陷的哺乳動(dòng)物的方法。進(jìn)一步提供的是包括細(xì)胞歸巢組合物和脂肪形成組合物的組織支架。此外，提供一種制備組織支架的方法，所述組織支架能夠募集細(xì)胞并分化所募集的細(xì)胞以形成脂肪細(xì)胞或組織或者脂肪樣細(xì)胞或組織。
文檔編號(hào)A61F2/00GK103237885SQ201180057931
公開日2013年8月7日 申請(qǐng)日期2011年10月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月1日
發(fā)明者J·J·毛, B·沙阿 申請(qǐng)人:紐約市哥倫比亞大學(xué)理事會(huì)