專利名稱：淋巴毒素β受體藥劑與化療劑的聯(lián)合用藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)和癌癥診斷及治療領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及淋巴毒素β受體(LT-β-R)活化劑與化療劑在治療方法中的聯(lián)合用藥。
背景技術(shù)：
淋巴細胞毒素β受體(本申請中稱之為LT-β-R)是腫瘤壞死因子家族的一個成員，其在免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中和免疫系統(tǒng)中眾多細胞，包括濾泡樹狀細胞和許多基質(zhì)細胞類型功能保持中發(fā)揮的作用已有詳細的闡述(Crowe et al.(1994)Science264707；BRowning et al.(1993)72847；BRowning et al.(1995)15433；Matsumotoet al.(1997)Immunol.Rev.156137)?，F(xiàn)已查明LT-β-R的活化誘導(dǎo)某些癌細胞系的體內(nèi)凋亡(PCT/US96/01386)。因此，用激動劑LT-β-R活化劑處理，例如特異性人源化抗LT-β-R抗體處理，可用于治療或減緩患者(例如，人)腫瘤形成的進程、嚴重程度或作用。癌癥是當今世界上最普遍的健康問題之一，在美國大約每5個人中就有一個受到影響。因此，控制腫瘤細胞和治療各種癌癥現(xiàn)在是而且將來也可能仍是一項重要的保健需要。
發(fā)明概述部分地，本發(fā)明提供了抑制腫瘤體積并治療癌癥的方法，其中包括淋巴毒素β受體(LT-β-R)激動劑和化療劑的使用，該化療劑不是淋巴毒素受體激動劑。激動劑和化療劑的聯(lián)用取得的腫瘤抑制效果大于單獨使用激動劑和化療劑的預(yù)期效果。這種效果在本申請中稱為“超-相加(supra-additive)”抑制，這可能由協(xié)同的或加強性的相互作用造成。本發(fā)明還提供了用于實施本發(fā)明方法的藥物組合物、遞送裝置和試劑盒。
本發(fā)明提供了一種用于抑制腫瘤體積方法，其中包括施用有效量的淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑和有效量的至少一種化療劑，其中LT-β-R激動劑和化療劑的施用導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。
本發(fā)明還提供了一種用于抑制腫瘤體積的方法，其中包括施用有效量的抗淋巴毒素-β受體(LT-β-R)抗體和有效量的至少一種化療劑，其中抗LT-β-R抗體和化療劑的施用導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。
本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其中含有有效量的LT-β-R激動劑、有效量的至少一種化療劑和可藥用的載體，將該組合物施用給受試者導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。
本發(fā)明還包括有效量的淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑和有效量的化療劑在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，將該藥物施用給患者導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用是協(xié)同性的。另一個實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有小于1.00的聯(lián)用指數(shù)(combination index)。另一實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用是加強性的。在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有小于0.05的P-值。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述的LT-β-R激動劑是抗LT-β-R抗體。另一個實施方案中，本發(fā)明所述的抗LT-β-R抗體是單克隆抗體，其中所述單克隆抗體選自BKA11，CDH10，BCG6，AGH1，BDA8，CBE11或BHA10。本發(fā)明的另一實施方案中，所述抗LT-β-R抗體是人源化抗體，包括例如，huCBE11和huBHA10。另一個實施方案中，本發(fā)明所述的抗LT-β-R抗體是多價的抗LT-β-R抗體。本發(fā)明的一個實施方案中，所述的多價的抗LT-β-R抗體是多特異性的。
本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗體偶聯(lián)于化療劑。
本發(fā)明的另一實施方案中，所述化療劑是干擾DNA合成的藥劑。一個實施方案中，所述的干擾DNA合成的藥劑是核苷類似物化合物，包括，例如，吉西他濱(gemcitabine)。另一個實施方案中，所述的干擾DNA合成的藥劑是蒽環(huán)類抗生素(anthracyclines)，包括，例如，阿霉素(adriamycin)。
本發(fā)明的另一個實施方案中，所述化療劑是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑，包括，例如，Camptosar。另一個實施方案中，所述化療劑烷化劑，包括，例如，鉑化合物(platinum compound)。一個實施方案中，所述鉑化合物是卡鉑(carboplatin)或順氯氨鉑(cisplatin)。
另一個實施方案中，所述化療劑植物堿(plant alkaloid)。一個實施方案中，所述植物堿是紫杉烷(taxane)，包括，例如，紅豆杉醇(Taxol)。
一個實施方案中，用于抑制腫瘤體積的方法，其包括施用有效量的淋巴毒素-β受體(LT-β-R)和有效量的化療劑，該化療劑不是淋巴毒素受體激動劑，其中LT-β-R激動劑和化療劑的施用導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。所述對腫瘤的超-相加抑制作用是協(xié)同性的，一些實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有小于1.00的聯(lián)用指數(shù)?？蛇x，所述聯(lián)用指數(shù)為約0.85-約0.90；約0.70-約0.85；約0.30-約0.70；約0.10-約0.30。另一個實施方案中，所述聯(lián)用指數(shù)是小于0.10。其它實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用是加強性的，一些實施方案中，所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有小于0.05的p-值?？蛇x，所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有的P-值為約0.05-約0.04；約0.04-約0.03；約0.03-約0.02；約0.02-約0.01。還有另一個實施方案中，所述p-值小于0.01。
各種LT-β-R激動劑中的任一種都可用于用于本發(fā)明所述方法。一些個實施方案中，所述的LT-β-R激動劑可以是抗LT-β-R抗體。一個實施方案中，所述的抗LT-β-R抗體是單克隆抗體。一些實施方案中，所述單克隆抗體選自BKA11，CDH10，BCG6，AGH1，BDA8，CBE11或BHA10。另一實施方案中，所述抗LT-β-R抗體是人源化抗體。一些實施方案中，所述人源化抗體選自huCBE11或huBHA10。一個實施方案中，所述人源化抗體為huCBE11。本發(fā)明中使用的人源化抗體在一些實施方案中可以用選自E46.4(ATCC專利保藏名稱PTA-3357)或細胞系E77.4(ATCC專利保藏名稱3765)的細胞系制備。其它另外的實施方案中，所述抗-LT-β-R抗體是多價抗-LT-β-R抗體構(gòu)建體，一些實施方案中，可以是多特異性的。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述抗LT-β-R抗體偶聯(lián)于化療劑。
同樣地，各種化療劑中的任一種都可用于本發(fā)明所述方法，只要激動劑和化療劑的聯(lián)用取得的腫瘤抑制效果大于單獨使用激動劑和化療劑的預(yù)期效果即可。一些實施方案中，所述化療劑是干擾(disrupt)DNA合成的藥劑。一個實施方案中，所述的干擾DNA合成的藥劑是核苷類似物化合物。一個實施方案中，所述核苷類似物化合物是吉西他濱。另一個實施方案中，所述的干擾DNA合成的藥劑是蒽環(huán)類抗生素，一些實施方案中，所述蒽環(huán)類抗生素是阿霉素。其它實施方案中，所述化療劑拓撲異構(gòu)酶I抑制劑。一個實施方案中，所述拓撲異構(gòu)酶I抑制劑是伊立替康(irinotecan)，包括，例如，Camptosar。其它實施方案中，所述化療劑中可以是烷化劑。一個實施方案中，所述烷化劑是鉑化合物，一些實施方案中，選自卡鉑和順氯氨鉑。一個實施方案中，所述鉑化合物是順氯氨鉑。其它另外的實施方案中，所述化療劑是植物堿。一個實施方案中，所述植物堿是紫杉烷，并且在一些實施方案中，可以是紅豆杉醇。
本發(fā)明提供了用于篩選具有下述特性的化療劑的方法即與淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑一起施用的情況下產(chǎn)生抑制對腫瘤體積的超-相加作用。一個實施方案中，所述方法包括(a)讓受試者中的第一腫瘤與LT-β-R激動劑接觸，然后測量對腫瘤體積的抑制情況；(b)讓受試者中可比的第二腫瘤與候選化療劑接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；以及(c)讓受試者中可比的第三腫瘤與所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑二者接觸，然后測量對腫瘤體積的抑制情況；其中，當所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑二者存在下對腫瘤體積的抑制大于所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑單一存在下對腫瘤體積抑制之和時，則可以認為所述候選化療劑具有抑制腫瘤體積的超-相加作用。
本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述方法中使用的藥物組合物。一個實施方案中，所述藥物組合物含有有效量的LT-β-R激動劑、有效量的至少一種化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑，以及可藥用的載體，其中所述LT-β-R激動劑和所述化療劑的聯(lián)合給藥獲得了超-相加的腫瘤抑制效果。一些實施方案中，所述化療劑選自干擾DNA合成的藥劑、核苷類似物化合物、烷化劑和植物堿。一些實施方案中，所述LT-β-R激動劑可以是抗LT-β-R抗體，一些實施方案中可以是人源化抗體。一個實施方案中，所述人源化抗體為huCBE11。其它實施方案中，所述抗LT-β-R抗體是多價的抗LT-β-R抗體構(gòu)建體。
另外，還提供了所述方法中使用的藥物遞送裝置。一個實施方案中，藥物遞送裝置含有或能負載有效量的LT-β-R激動劑，有效量的化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑，以及可藥用的載體，其中用所述裝置施用所述LT-β-R激動劑和所述化療劑獲得了超-相加的腫瘤抑制效果。一些實施方案中，用所述裝置施用所述所述激動劑和所述化療劑是同時進行的。一些實施方案中，在用所述裝置給藥前，可以先將所述激動劑和化療劑在該裝置中混合。其它另外的實施方案中，用所述裝置施用所述所述激動劑和所述化療劑是依次的進行的。
另外，還提供了用本發(fā)明組合物及治療癌癥或抑制腫瘤體積的方法。一個實施方案中，治療癌癥的方法包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明所述藥物組合物。一些實施方案中，所述受試者是人。一些實施方案中，所述癌癥包括實體瘤。可以向腫瘤位點局部施用所述組合物。一個實施方案中，將所述組合物組合物直接地施至腫瘤的動脈血供給(arterial bloodsupply)。另一個實施方案中，治療受試者中癌癥的方法包括用本發(fā)明所述的藥物遞送裝置向該所述受試者施用有效量的LT-β-R激動劑和有效量的化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑。其它實施方案中，抑制受試者中腫瘤體積的方法包括向該受試者施用有效量的本發(fā)明所述藥物組合物。另一個實施方案中，抑制受試者腫瘤體積的方法包括用本發(fā)明所述的藥物遞送裝置向該所述受試者施用有效量的LT-β-R激動劑和有效量的化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑。
本發(fā)明進一步還提供了試劑盒，其中包括本發(fā)明藥物組合物或藥物遞送裝置，以及任選地使用它們的說明書。所述試劑盒的用途包括，例如，治療應(yīng)用。一些實施方案中，包含在任一試劑盒中的本發(fā)明組合物均已凍干，需要在使用之前再水化。
一個實施方案中，本發(fā)明提供了含有或能盛裝下列物質(zhì)的藥物遞送裝置(1)有效量的LT-β-R激動劑；(2)有效量的至少一種化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑；以及(3)可藥用的載體；從而使得用所述裝置施用所述LT-β-R激動劑和所述化療劑可產(chǎn)生超-相加的腫瘤抑制效果。一個實施方案中，所述裝置同時施用所述LT-β-R激動劑和化療劑。另一個實施方案中，在用所述裝置同時給藥前，可以先將所述LT-β-R激動劑和化療劑在該裝置中混合。在一個單獨的實施方案中，所述LT-β-R激動劑和化療劑用所述裝置順次施用。
其它實施方案中，通過下述方法治療受試者的癌癥用任一上述藥物遞送裝置向該所述受試者施用有效量的LT-β-R激動劑和有效量的化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑。
另一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種治療受試者癌癥的方法，包括向所述受試者施用有效量的藥物組合物權(quán)利要求任一項所述的藥物組合物。一個實施方案中，所述受試者是人。另一個實施方案中，所述癌癥包括實體瘤。就實體瘤的治療而言，一個實施方案提供了將所述藥物組合物向所述腫瘤位點的局部給藥。另一個有關(guān)實體瘤治療的實施方案中，將所述藥物組合物直接地施用至腫瘤的動脈血供給。
本發(fā)明的另一個實施方案中，是通過向所述受試者施用有效量的任一上述藥物組合物來抑制腫瘤體積的。在一個單獨的實施方案中，通過下述方法抑制受試者的腫瘤體積用任一上述藥物遞送裝置向該所述受試者施用有效量的LT-β-R激動劑和有效量的化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑。
另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療受試者癌癥的試劑盒，其中含有任一種上述藥物合成物。另一個實施方案中，所述試劑盒進一步還包括向所述受試者施用所述組合物用的說明書。
另一個實施方案中，本發(fā)明提供了用藥物遞送裝置治療受試者癌癥所用的試劑盒，其中包括有效量的LT-β-R激動劑和有效量的化療劑，該化療劑不是LT-β-R激動劑，以及任選地還包括使用說明書。
最后的實施方案中，本發(fā)明提供了篩選具有下述特性的化療劑的方法即與淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑一起施用產(chǎn)生超-相加的抑制腫瘤體積的作用，該方法包括讓受試者中的第一腫瘤與LT-β-R激動劑接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；讓受試者中可比的第二腫瘤與候選化療劑接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；以及讓受試者中可比的第三腫瘤與所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑二者接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；其中，當所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑二者存在下對腫瘤體積的抑制大于所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑單獨存在下對腫瘤體積抑制之和時，則可以認為所述候選化療劑具有抑制腫瘤體積的超-相加作用。
本發(fā)明的其它特點和優(yōu)勢可以從下面的發(fā)明詳述和權(quán)利要求部分明顯地看出。
附圖簡述

圖1圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用伊立替康(圓形)和單用huCBE11(三角形)相比，伊立替康(Camptosar)與huCBE11(正方形)聯(lián)合用藥對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的最初劑量都用一個箭頭標示。
圖2圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用吉西他濱(圓形)和單用huCBE11(三角形)相比，吉西他濱與huCBE11聯(lián)合用藥(正方形)對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的最初劑量都用一個箭頭標示。
圖3圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用紅豆杉醇(圓形)和單用huCBE11(三角形)相比，紅豆杉醇與huCBE11聯(lián)合用藥(正方形)對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的最初劑量都用一個箭頭標示。
圖4圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用順氯氨鉑(圓形)和單用huCBE11(三角形)相比，順氯氨鉑(CDDP)與huCBE11聯(lián)合用藥(正方形)對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的最初劑量都用一個箭頭標示。
圖5圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用阿霉素(圓形)和單用huCBE11(三角形)相比，阿霉素與huCBE11聯(lián)合用藥(正方形)對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的最初劑量都用一個箭頭標示。
圖6圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用順氯氨鉑(實心正方形)和單用huCBE11(空心正方形)相比，順氯氨鉑(1mg/kg)與huCBE11(三角形；500μg)聯(lián)合用藥對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的劑量給藥用箭頭標示。
圖7圖示了治療過程中，與鹽水對照(實心三角形)、單用阿霉素(實心圓形)和單用huCBE11(空心正方形)相比，阿霉素(6mg/kg)與huCBE11(實心正方形；500μg)聯(lián)合用藥對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的劑量給藥用箭頭標示。
圖8圖示了治療過程中，與鹽水對照(正方形)、單用Camptosar(三角形)和單用huCBE11(圓形)相比，Camptosar(3mg/kg)與huCBE11(菱形；20mg/kg)聯(lián)合用藥對WiDr人腫瘤重量的影響。每種藥劑的劑量給藥用箭頭標示。
圖9圖示的是在WiDr結(jié)腸直腸腺癌模型中huCBE11與Camptosar聯(lián)合用藥對于減小腫瘤體積在每一效果水平的聯(lián)用指數(shù)的曲線。聯(lián)用指數(shù)(CI)相對于受影響分值(the fraction affected)(Fa)繪圖。聯(lián)用指數(shù)＜1表明協(xié)同作用。
圖10圖示的是在對KM-20L2直腸結(jié)腸腺癌模型治療的多個時間點，huCBE11與Camptosar(huCBE11∶Camptosar的固定劑量比例為1∶0.63)聯(lián)合用藥對于減小腫瘤體積在每一效果水平的聯(lián)用指數(shù)的曲線。聯(lián)用指數(shù)(CI)相對于觀察到的腫瘤抑制百分比繪圖。聯(lián)用指數(shù)＜1表明協(xié)同作用。
圖11圖示的是WiDr結(jié)腸直腸腺癌模型中huCBE11與Camptosar聯(lián)合用藥對于減小腫瘤體積在每一效果水平的聯(lián)用指數(shù)的曲線圖。聯(lián)用指數(shù)(CI)相對于受影響分值(Fa)繪圖。聯(lián)用指數(shù)＜1表明協(xié)同作用。
圖12圖示了治療過程中，與鹽水對照(十字形)、單用吉西他濱(圓形)和單用huCBE11(三角形)相比，吉西他濱(20mg/kg)與huCBE11(正方形；4mg/kg)聯(lián)合用藥對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌腫瘤重量的影響。每種藥劑的劑量用箭頭標示。
圖13圖示的是在KM-20L2直腸結(jié)腸腺癌模型治療的多個時間點，huCBE11與Camptosar(huCBE11∶吉西他濱的固定劑量比例為4∶5)聯(lián)合用藥對于減小腫瘤體積在每一效果水平的聯(lián)用指數(shù)的曲線。聯(lián)用指數(shù)(CI)相對于觀察到的腫瘤抑制百分比繪圖。聯(lián)用指數(shù)＜1表明協(xié)同作用。
圖14給出的是，當huCBE11∶吉西他濱以4∶5的固定比例施用給KM-20L2直腸結(jié)腸癌模型小鼠時，huCBE11∶吉西他濱聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)范圍的三維圖。
圖15圖示的是huCBE11與紅豆杉醇聯(lián)用對于減小腫瘤體積在每一效果水平的聯(lián)用指數(shù)的曲線。聯(lián)用指數(shù)(CI)相對于受影響分值(Fa)作圖。聯(lián)用指數(shù)＜1表明協(xié)同作用。
發(fā)明詳述定義為了方便起見，在描述本發(fā)明之前，在此給出說明書、實施例和所附權(quán)利要求中使用的一些術(shù)語的定義。
除上下文有清楚地說明外，所述單數(shù)形式“一”、“一種”和“所述(該)”也將復(fù)數(shù)情況包括在內(nèi)。
術(shù)語″施用″包括用于將藥物組合物或治療藥物遞送至受試者系統(tǒng)內(nèi)或者特定部位之內(nèi)或之上的任一方法。″系統(tǒng)施用″、″系統(tǒng)地施用″、″外周施用″和″外周地施用″在本申請中是指化合物、藥物或其它物質(zhì)通過除直接進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)之外的施用方式進入患者系統(tǒng)，從而經(jīng)過新陳代謝及其它類似過程，例如，經(jīng)皮下施用?！敖?jīng)非胃腸道施用”和“非胃腸道地施用”是指除腸道和局部施用之外的施用方式，通常經(jīng)注射，包括，但不限于，靜脈內(nèi)，肌肉內(nèi)，動脈內(nèi)，鞘內(nèi)，囊內(nèi)，眶內(nèi)，心內(nèi)，皮內(nèi)，腹膜內(nèi)，經(jīng)氣管，皮下，表皮下，關(guān)節(jié)內(nèi)，包囊下，蛛網(wǎng)膜下，脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射及輸注。
“干擾(disrupt)DNA合成的藥劑”是指能夠減緩或抑制DNA合成進程的任一分子或化合物。干擾DNA合成的藥劑的實例包括但不限于實施或促進DNA合成的酶的抑制劑，例如拓撲異構(gòu)酶I，或者核苷類似物例如嘧啶或嘌呤類似物。
“烷基化試劑”是指能與親核基團(例如，胺，醇，酚，有機和無機酸)反應(yīng)從而在另一分子例如蛋白質(zhì)或核酸上添加烷基的任一分子或化合物。用作化療劑的烷化劑的實例包括白消安(busulfan)、chloarmbucil，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)，異環(huán)磷酰胺(isosfamide)，氮芥(mechlorethamine)，苯丙氨酸氮芥(melphalan)，硫替派(thiotepa)，各種亞硝基脲(nitrosourea)化合物，以及鉑化合物例如順氯氨鉑和卡鉑(carboplatin)。
″抗腫瘤活性″是指物質(zhì)或組合物針對與其相互作用腫瘤細胞表現(xiàn)出的阻遏其增殖或誘導(dǎo)其死亡的能力。″凋亡″是指程序性細胞死亡過程。
″癌癥″或“腫瘤”通常是指任一惡性腫瘤或細胞的自發(fā)生長或增殖。在本申請中該術(shù)語包括充分發(fā)育的惡性贅生物，以及惡變前的病變?！灏┌Y″患者，例如，患有腫瘤或白細胞增殖例如白血病。一些實施方案中，患有癌癥的患者具有腫瘤，例如實體瘤。涉及實體瘤的癌癥包括但不限于非小細胞肺癌(NSCLC)，睪丸癌(testicular cancer)，肺癌(lung cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，子宮癌(uterine cancer)，宮頸癌(cervical cancer)，胰腺癌(pancreatic cancer)，結(jié)腸直腸癌(colorectal cancer)(CRC)，乳腺癌(breastcancer)，以及前列腺(prostate)癌、胃(gastric)癌、皮膚癌、胃(stomach)癌、食管和膀胱癌。
″化療劑″是指被用于治療異源細胞或惡性細胞，諸如腫瘤引發(fā)疾病的任一分子或組合物。本申請中的化療劑包括能與本發(fā)明抗體偶聯(lián)的藥劑，或者可選能與本發(fā)明抗體聯(lián)用但不與所述抗體偶聯(lián)的藥劑。在本發(fā)明的一個實施方案中，用于與本發(fā)明抗體聯(lián)用的化療劑包括，但不限于鉑(即順式鉑)，蒽環(huán)類抗生素，核苷類似物(嘌呤和嘧啶)，紫杉烷，喜樹堿，表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)，DNA烷化劑，葉酸拮抗劑，長春花生物堿(vincaalkaloid)，核糖核苷酸抑制劑，雌激素抑制劑，孕酮(progesterone)抑制劑，雄激素抑制劑，芳香酶抑制劑，干擾素，白細胞介素，單克隆抗體，紅豆杉醇，Camptosar，阿霉素(dox)，5-氟尿嘧啶和吉西他濱?？梢酝ㄟ^將所述抗體與所述化療藥物一起施用而在本發(fā)明的實踐中將所述化療劑與本發(fā)明抗體聯(lián)用。一個實施方案中，本發(fā)明抗體不與化療劑偶聯(lián)。本發(fā)明的另一個實施方案中，所述化療劑和所述抗-LT-βR激動劑抗體偶聯(lián)在一起。
″聯(lián)用指數(shù)″是指用Chou and Talalay(1984)Adv.Enz.Regul.2227中方法測定時對至少兩種分子或化合物的聯(lián)合劑量效果(combined dose-effct)的測量，該方法在發(fā)明詳述和實施例部分有進一步的描述。如果劑量影響是協(xié)同的，所述聯(lián)用指數(shù)小于1.00?？蛇x，顯示協(xié)同作用的聯(lián)用指數(shù)為約0.85-約0.90；約0.70-約0.85；約0.30-約0.70；約0.10-約0.30。
″有效量″是指化合物、物質(zhì)或含有本發(fā)明化合物的組合物足以獲得預(yù)期效果的量，所述預(yù)期效果包括但不限于，例如，體外或體內(nèi)減小腫瘤體積。本發(fā)明藥物組合物的有效量是指足以獲得預(yù)期臨床結(jié)果的所述藥物組合物的量，包括但不限于，例如改善，穩(wěn)定，防止或延遲患者體內(nèi)癌癥的發(fā)展。兩種情況下，本發(fā)明所述化合物的有效量都可以以一次或多次給藥的方式施用。上述這些指標的檢測和測定已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，包括，但不限于例如，腫瘤負荷的減小，腫瘤大小的抑制，第二(secondary)腫瘤增殖的減少，腫瘤組織中基因的表達，生物標志物的出現(xiàn)，淋巴結(jié)的累積，組織學(xué)分級，以及細胞核分級。
“人源化抗體”是指這樣的抗體或抗體構(gòu)建體，其中將來自一物種的抗體的互不決定區(qū)(CDR)嫁接于人抗體可變區(qū)的框架區(qū)。
“腫瘤體積的抑制”是指腫瘤體積的減小或縮小。藥物組合物或治療劑抑制腫瘤體積的能力可以通過“受影響分值(fraction affcted value)”測量。“受影響分值(Fa)”是指腫瘤被抑制分值的測量值，是通過用治療組的平均腫瘤體積的縮小除以對照組平均腫瘤體積得出的。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。Fa的計算在發(fā)明詳述部分有進一步的描述。
″淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑″是指能使配體與所述LT-β-R結(jié)合、細胞表面LT-β-R聚簇和/或LT-β-R信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強的任一藥劑。
″抗LT-β-R抗體″是指能識別和結(jié)合LT-β受體至少一個表位的任一分子?？筁T-β-R抗體的實例包括單克隆抗體、嵌合抗體、人源化抗體和多價抗體。“抗體”意圖包括完整的抗體，例如，任一同種型(IgG，IgA，IgM，IgE，等)，并且包括其能與脊椎動物例如哺乳動物蛋白質(zhì)特異性反應(yīng)的片段，以及含有抗體片段的融合蛋白質(zhì)?？梢杂贸Ｒ?guī)方法將抗體片段化，用與如上述對完整抗體所用方法相同的方法篩選片段。因此，該術(shù)語中包括抗體分子蛋白水解切割或重組制備得到的片段，其能與特定蛋白質(zhì)選擇性反應(yīng)。所述蛋白水解的和/或重組片段的非限制性實例包括Fab，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)ab’，F(xiàn)v，以及含有通過肽接頭連接在一起的V[L]和/或V[H]結(jié)構(gòu)域的單鏈抗體?！蹇贵w″還包括″抗體構(gòu)建體″，其中含有連接于5類Ig(例如IgA，IgD，IgE，IgG和IgM)中任一類的恒定區(qū)上的兩或多個可變區(qū)。本發(fā)明包括多克隆抗體、單克隆抗體、人源化抗體，或其它的抗體純化制劑，以及重組抗體。
“單克隆抗體”是指只含有能與具體表位免疫反應(yīng)或結(jié)合抗原結(jié)合位點的抗體分子。對于針對表位的單克隆抗體或其衍生物、片段、類似物或同系物的制備，可以采用通過連續(xù)細胞系培養(yǎng)來制備抗體分子的任一技術(shù)。這樣的技術(shù)包括，但不限于，雜交瘤技術(shù)(參見Kohler & Milstein(1975)Nature 256495-497)；三體瘤(trioma)技術(shù)；人B細胞雜交瘤技術(shù)(參見Kozbor，et al.(1983)Immunol.Today 472)以及用于制備人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(參見Cole，et al.，1985 InMonoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。人單克隆抗體可以用于實施本發(fā)明，并且可以通過使用人雜交瘤(參見Cote et al.(1983).Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802026-2030)或者通過用EB病毒體外轉(zhuǎn)化B細胞(參見Cole et al.(1985)InMonoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)來制備。
“多價抗體”或“多價抗體構(gòu)建體”是指這樣的抗體或抗體構(gòu)建體，其中含有一種以上的抗原識別位點。例如，″二價″抗體構(gòu)建體具有2種抗原識別位點，而″四價″抗體構(gòu)建體具有四種抗原識別點。術(shù)語″單特異性″，″雙特異性″，″三特異性″，″四特異性″，等，是指本發(fā)明多價抗體構(gòu)建體中存在的不同抗原識別點特異性的數(shù)目(與抗原識別點數(shù)目不同)。例如″單特異性″抗體構(gòu)建體的抗原識別點全部結(jié)合同一表位?！咫p特異性″抗體構(gòu)建體具有至少一個與第一表位結(jié)合的抗原識別位，以及至少一個與不同于第一表位的第二表位結(jié)合的抗原識別位點。″多價單特異性″抗體具有多個全部與同一表位結(jié)合的抗原識別位點?！宥鄡r雙特異性″抗體具有多個抗原識別位點，其中的一部分與第一表位結(jié)合，一部分與不同于第一表位的第二表位結(jié)合。所述多價抗體構(gòu)建體及其制備和使用方法的實例，見題為″Anti-LT-β-R Multispecific Multivalent Antibody Constructs，and Methods ofMaking and Using the Same″的臨時專利申請，該申請?zhí)峤挥?002年12月20日，美國臨時申請?zhí)枮?0/435154，在此全文引入作為參考。
術(shù)語″P-值″是指概率值。p-值表示完全隨機狀態(tài)下試驗獲得所述結(jié)果的可能性。在本發(fā)明的一個實施方案中，為雙尾單樣本T-檢驗(two-tailedone-sample T-test)的P-值。p-值小于0.05被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的，即不可能是完全隨機的?？蛇x，統(tǒng)計學(xué)顯著的p-值為約0.05-約0.04；約0.04-約0.03；約0.03-約0.02；約0.02-約0.01。一些情況下，p-值可能會小于0.01。在本申請中，所述p-值可用于測定當將淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑和非淋巴毒素受體激動劑的化療劑施用至腫瘤或長有腫瘤的受試者時，是否取得了統(tǒng)計學(xué)顯著的腫瘤體積超-相加抑制作用。當統(tǒng)計學(xué)顯著性在并非偶然一天而是在一系列治療日都觀察到的情況下，存在生物學(xué)相關(guān)性。
“患者”或“受試者”或“宿主”是指人或非人動物。
術(shù)語″藥物遞送裝置″是指可將治療劑或藥劑施用至受試者的任一用具。N藥物遞送裝置的非限制性實例包括皮下注射器，多室注射器(multichambersyringe)，支架，導(dǎo)管，經(jīng)皮貼劑(transcutaneous patch)，顯微操作針(microneedle)，顯微研磨器(microabraders)，和可植入控制釋放用具。一個實施方案中，術(shù)語″藥物遞送裝置″是指可將兩種化合物在注射前混合的雙室注射器。
術(shù)語“可藥用的”在本申請中是指化合物、物質(zhì)、組合物、和/或劑量形式，在合適的醫(yī)療判斷范圍內(nèi)，適用與人及動物組織接觸而不會產(chǎn)生毒性、放射性、過敏反應(yīng)或其它問題或并發(fā)癥，具有合理的利益/風險比。
術(shù)語″可藥用的載體″在本申請中是指可藥用的原料、組合物或載體，例如液態(tài)或固態(tài)填料、稀釋劑、賦形劑、或溶劑包封原料，涉及將目標化合物從身體的一個器官或部分傳送或輸送到身體的另一器官或部分。從與制劑中其余組分適配并且對患者無害意義上說每一載體都必須是″可接受的″?？勺鳛榭伤幱幂d體的原料的一些實例包括(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；(3)纖維素，及其衍生物，例如羧甲基纖維素鈉鹽、乙基纖維素和醋酸纖維素；(4)黃蓍膠(tragacanth)粉；(5)麥芽；(6)白明膠；(7)滑石；(8)賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；(9)油劑，例如花生油、棉花籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和豆油；(10)乙二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)瓊脂；(14)緩沖劑，例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；(15)藻酸；(16)無熱原的水；(17)等滲鹽水；(18)林格氏(Ringer’s)溶液；(19)乙醇；(20)pH緩沖的溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；以及(22)其它藥物制劑中使用的無毒相容物質(zhì)。
“可藥用的鹽”是指化合物的相對無毒的無機和有機酸加成鹽。這些鹽可以在給藥載體或劑型制備過程中原位制備，或者通過下述方法制備讓以游離堿形式存在的經(jīng)純化的本發(fā)明化合物與合適的有機或無機酸反應(yīng)，分離隨后純化過程中形成的鹽。本發(fā)明化合物的可藥用鹽包括所述化合物的常規(guī)無毒鹽或季銨鹽，例如，來自無毒的有機或無機酸。
術(shù)語“植物堿”是指屬于下述特性的分子家族的化合物即源自植物且具有生物學(xué)活性和細胞毒的堿性含氮分子。植物堿的實例包括，但不限于，紫杉烷例如多西紫杉醇(docetaxel)和紫杉醇(paclitaxel)，長春胺(vinca)例如長春花堿(vinblastine)、長春新堿(vincristine)，以及長春烯堿(vinorelbine)。一個實施方案中，所述植物堿是紅豆杉醇。
術(shù)語″超-相加″是指聯(lián)合用藥的效果，其中該聯(lián)合用藥的效果大于單個藥物單獨用藥效果的總和。超-相加效果的實例包括加強和協(xié)同作用。術(shù)語″加強″是指這樣一種情況2或多種藥物的同時效應(yīng)大于這些藥物單獨給藥作用的總和。一個實施方案中，發(fā)生的加強是這樣一種情況，一種藥劑單獨施用時沒有任何抑制作用，但是聯(lián)合用藥時加強了第二種藥劑的作用。在本發(fā)明的一個實施方案中，LT-β-R激動劑或化療劑中只有一種具有抑制腫瘤體積的能力，但是聯(lián)合用藥時所述藥劑的作用得到了加強。
術(shù)語″腫瘤的超-相加抑制″是指腫瘤體積縮小的總數(shù)大于每種藥劑單個用藥時產(chǎn)生作用之和。在本發(fā)明的一個實施方案中，腫瘤的超-相加抑制包括LT-β-R激動劑與非LT-β-R激動劑的化療劑聯(lián)合用藥產(chǎn)生的平均腫瘤抑制，統(tǒng)計學(xué)上顯著地大于所述LT-β-R激動劑和化療劑分別單獨用藥時產(chǎn)生的腫瘤抑制作用的總和。LT-β-R激動劑和化療劑聯(lián)合給藥產(chǎn)生的腫瘤抑制作用是否“統(tǒng)計學(xué)上顯著大于”單個化合物的預(yù)期相加值，可以用發(fā)明詳述中描述的多種統(tǒng)計學(xué)方法測定。
術(shù)語″協(xié)同的″是指比任兩或多種單個藥劑的相加效應(yīng)更有效的聯(lián)合。在本發(fā)明的一個實施方案中，術(shù)語協(xié)同包括超-相加抑制，其中LT-β-R激動劑和化療劑各自都具有抑制腫瘤體積的能力。
術(shù)語“拓撲異構(gòu)酶I抑制劑”是指能夠抑制或減少拓撲異構(gòu)酶I酶生物活性的分子或化合物。拓撲異構(gòu)酶I抑制劑的非限制性實例包括蒽環(huán)類抗生素例如daunombicin、阿霉素和idambicin，以及表鬼臼毒素例如依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide)。
“治療癌癥”或“治療患有癌癥的受試者”是指向受試者施用藥物治療，例如，施用藥物，從而使得癌癥程度被減弱或防止。治療癌癥是指抑制癌細胞的復(fù)制，抑制癌癥的擴散，縮小腫瘤體積，減少體內(nèi)癌細胞的數(shù)目，和/或改善或減輕癌癥引發(fā)疾病的癥狀。如果死亡率和/或發(fā)病率下降則可認為治療是有療效的。在本發(fā)明的一個實施方案中，術(shù)語治療癌癥是指縮小腫瘤體積。治療包括(但不限于)組合物的施用，例如藥物組合物，并可以以預(yù)防為目的進行施用，或者發(fā)病開始之后施用。
術(shù)語″腫瘤體積″是指腫瘤的總體積，包括所述腫瘤本身再適當加上受影響的淋巴結(jié)。腫瘤體積可以用本領(lǐng)域已知的多種方法測定，例如，如，通過使用測徑計(calipers)、計算機斷層攝影術(shù)(CT)或核磁共振成像(MRI)掃描來測定腫瘤的維數(shù)，然后根據(jù)例如Z軸直徑或常規(guī)形狀例如球體、橢圓體或立方體使用方程計算體積。
淋巴毒素-β-受體(LT-β-R)激動劑多種LT-β-R激動劑中的任一種都可用于用于本發(fā)明所述方法。U.S.6,312,691和WO 96/22788，在此全文引入作為參考，描述了用于使用觸發(fā)癌細胞死亡的LT-β-R激動劑治療癌癥的方法和組合物。例如，U.S.6,312,691描述了本發(fā)明使用的LT-β-R激動劑，包括膜-結(jié)合LT-α/β復(fù)合體、可溶性LT-α/β復(fù)合體及抗LT-β-R抗體，以及其制備和純化的方法。
表面LT-α/β異聚復(fù)合體可以通過用LT-α和LT-β基因共轉(zhuǎn)染過宿主細胞來重構(gòu)。表面LT復(fù)合體無法在穩(wěn)定的細胞系上觀察到，因為該細胞系只能表達單一的LT基因。但是，如果宿主細胞正常能產(chǎn)生大量LT-α(例如RPMI1788細胞；見下文)，然后用編碼所需LT-β多肽的LT-β基因轉(zhuǎn)染應(yīng)該能足以生成其中含有全長LT-α亞單位的LT-α/β復(fù)合體。
LT-α和LT-β多肽在多種真核表達系統(tǒng)中的共表達能夠?qū)崿F(xiàn)它們作為活性配體的裝配和輸出(Crowe et al.，J.Immunol.Methods，168，79-89(1994))。宿主系統(tǒng)包括但不限于CHO細胞，COS細胞，B細胞包括骨髓瘤，桿狀病毒-感染的昆蟲細胞和酵母。本發(fā)明所述的LT-α/β異聚復(fù)合體中的LT-α亞單位可以選自淋巴毒素-α、天然人或動物淋巴毒素-α、重組淋巴毒素-α、可溶性淋巴毒素-α、分泌型淋巴毒素-α、具有LT-α生物活性的淋巴毒素-α突變型蛋白，或者任何上述具有LT-α生物活性的淋巴毒素-α的淋巴毒素-α片段。
可溶性的(非膜-結(jié)合的)LT-α/β異聚復(fù)合體含有LT-β亞單位，其已經(jīng)從膜-結(jié)合形式變?yōu)榭扇苄问健＿@些復(fù)合體在申請人的同時待審的國際申請中做了詳細的描述(PCT/US93/11669，公開于1992年1月9日，公開號為WO 94/13808).可溶性的LT-β肽是用淋巴毒素-β的氨基酸序列定義的，其中在跨膜區(qū)末端(即在大約#_44氨基酸)和第一TNF同源區(qū)(即在#_88氨基酸)之間的任一點切割該序列，所述氨基酸的編號根據(jù)B Rowning et al(1993)Cell 72847.的編號系統(tǒng)。
可以通過截短LT-β的N-末端除去胞質(zhì)尾部和跨膜區(qū)制備可溶性的LT-β多肽(Crow et al.，Science，264，pp.707-710(1994)?？蛇x，可以通過缺失或者通過用親水氨基酸殘基取代組成跨膜結(jié)構(gòu)域的常規(guī)疏水氨基酸殘基，使所述跨膜結(jié)構(gòu)域失活。兩種情況都創(chuàng)造了基本上親水的水療法方案(hydropathy profile)，這樣便降低了脂類親合力并且提高了水溶性。缺失所述跨膜結(jié)構(gòu)域比用親水性的氨基酸殘基進行替代更為優(yōu)選，因為這樣可以避免引入潛在的免疫原表位。
可以通過用編碼LT-α和可溶性的LT-β的DNA共轉(zhuǎn)染合適的宿主細胞，制備可溶性LT-α/β異聚復(fù)合體(Crow et al，(1994)J.Immunol.Methods，16879)。在無LT-α存在條件下，分泌的可溶性LT-β高度寡聚。但是，當與LT-α共表達時，形成了一種70kDa的三聚-樣結(jié)構(gòu)，其中含有兩種蛋白質(zhì)。另外，還可以通過用編碼可溶性LT-β多肽的基因轉(zhuǎn)染通常情況下只表達LT-α(例如上述RPMI 1788細胞)的細胞系，制得可溶性的LT-α1/β2異聚復(fù)合體?？梢苑謩e合成LT-α和LT-β多肽，用溫和的去污劑使其變性，混合在一起，通過除去所述去污劑使其復(fù)性，形成可分離的混合LT異聚復(fù)合體(見下文)。
一些實施方案中，所述的LT-β-R激動劑可以是抗LT-β-R抗體。一些實施方案中，所述的抗LT-β-R抗體可以是多克隆抗體。免疫后，可以獲得可與LT-β-R反應(yīng)的抗血清，如果需要，可以從中分離出多克隆抗體。另一個實施方案中，所述的抗LT-β-R抗體是單克隆抗體。一些實施方案中，所述單克隆抗體可選自BKA11，CDH10，BCG6，AGH1，BDA8，CBE11或BHA10。為了制備單克隆抗體，從免疫后的動物收獲產(chǎn)抗體的細胞(淋巴細胞)，然后用常規(guī)體細胞融合方法與無限增殖的細胞例如骨髓瘤細胞融合，得到雜交瘤細胞。這類技術(shù)已為本領(lǐng)域所熟知，包括例如，雜交瘤技術(shù)(最初由Kohler and Milstein，(1975)Nature，256495-497開發(fā))，人B細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar et al.，(1983)Immunology Today，472)，以及用于制備人單克隆抗體的EBV雜交瘤技術(shù)(Cole et al.，(1985)Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.pp.77-96)?？梢酝ㄟ^免疫化學(xué)方法篩選能產(chǎn)生可與LT-β-R特異性反應(yīng)的雜交瘤細胞，分離單克隆抗體。一些實施方案中，用選自表1中細胞系的細胞系制備本發(fā)明所使用的單克隆抗體表1細胞系 mAb名稱 保藏號a)AG.H1.5.1 AGH1HB 11796b)BD.A8.AB9 BDA8HB 11798c)BC.G6.AF5 BCG6B 11794d)BH.A10BHA10 B 11795e)BK.A11.AC10 BKA11 B 11799f)CB.E11.1 CBE11 B 11793g)CD.H10.1 CDH10 B 11797其它實施方案中，所述抗LT-β-R抗體是人源化抗體。一些實施方案中，所述人源化抗體選自huCBE11或huBHA10。一個實施方案中，所述人源化抗體為huCBE11，其描述于WO 02/30986；美國臨時申請No.60/240,285；美國臨時申請60/275,289；美國臨時申請60/299,987。另一個實施方案中，所述人源化抗體為huBHA10，描述于PCT申請PCT US03/20762；美國臨時申請60/392,993；和美國臨時申請60/417,372。
上表中申請人的申請，其內(nèi)容在此全文引入，描述了用huCBE11和huBHA10分別治療癌癥觸發(fā)癌細胞死亡所使用的方法和組合物。用目的抗原免疫動物，分離相應(yīng)的抗體，將導(dǎo)致特異性抗原結(jié)合的可變區(qū)序列部分。然后，將動物-來源的抗原結(jié)合區(qū)克隆入其中的抗原結(jié)合區(qū)已經(jīng)刪除的人抗體的合適位置。參見，例如，Jones，P.et al.(1986)，Nature 321，522-525 orTempest et al.(1991)Biotechnology 9，266-273。另外，還可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它哺乳動物表達人源化抗體。所述人源化可以是部分的或者完全的。人源化抗體將人抗體中的異源(種間)序列的利用降至最低，因而在所處理的受試者中激發(fā)免疫應(yīng)答的可能性較低。一些實施方案中，可以使用選自下列細胞系的細胞系制備本發(fā)明所使用的人源化抗體E46.4(ATCC專利保藏號PTA-3357)或細胞系E77.4(ATCC專利保藏號3765).
另外還可以使用常規(guī)重組DNA技術(shù)制備各種形式的抗LT-β-R抗體(Winter and Milstein，Nature，349，pp.293-99(1991))。例如，可以構(gòu)建″嵌合″抗體，其中來自動物抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域被連接于人恒定結(jié)構(gòu)域(例如Cabilly et al.，U.S.Pat.No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81，pp.6851-55(1984))。嵌合抗體可減少當動物抗體用于人臨床治療時激發(fā)的可見免疫原性應(yīng)答。另外，還可以通過制備其中含有抗LT-β-R可變區(qū)和自不同類免疫球蛋白類型分離的人恒定區(qū)(CH1，CH2，CH3)的嵌合或人源化抗體，完成不同類重組抗LT-β-R抗體的構(gòu)建。例如，可以通過將抗原結(jié)合位點克隆入攜帶人mu鏈恒定區(qū)的載體，重組制備出抗原結(jié)合位點效價增加了的抗LT-β-R IgM抗體(Arulanandam et al.，J.Exp.Med.，177，pp.1439-50(1993)；Lane et al.，Eur.J.Immunol.，22，pp.2573-78(1993)；Traunecker et al.，Nature，339，pp.68-70(1989))。此外，可以使用常規(guī)重組DNA技術(shù)，通過改變抗原結(jié)合位點附近的氨基酸殘基，改變重組抗體與其抗原間的結(jié)合親合力。參見，例如，(Queen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86，pp.10029-33(1989)；WO 94/04679)。
另外，如本領(lǐng)域所知，本發(fā)明的抗LT-β-R抗體還可以是交聯(lián)的。交聯(lián)后的最終偶聯(lián)物優(yōu)選可溶于生理性液體例如血液。偶聯(lián)形式的所述聚合體不應(yīng)該是高度免疫原性的，而且在選擇經(jīng)靜脈內(nèi)輸注或注射之一作為施用方式的情況下，還應(yīng)該具有適于經(jīng)靜脈內(nèi)輸注或注射的粘稠度。
其它實施方案中，所述抗LT-β-R抗體是多價的抗LT-β-R抗體構(gòu)建體，并且一些實施方案中，可以是多特異性的。這類多價抗體構(gòu)建體的實例，及其制備和使用方法，描述于美國臨時申請60/435,154和名為″Anti-LT-β-R Multispecific Multivalent Antibody Constructs，and Methods ofMaking and Using the Same″的PCT申請No.＿＿＿，與本申請同日提交，在此全文引入作為參考。
一個實施方案中，所述多價抗體是淋巴毒素-β受體的激動劑，其中含有至少兩個能結(jié)合所述受體并誘導(dǎo)LT-β-R信號的結(jié)構(gòu)域。這些構(gòu)建體可以包括重鏈和含有一個或多個可變區(qū)的輕鏈，其中所述重鏈包含兩個或多個含可特異性結(jié)合LT-β受體的抗原識別位點；或者被構(gòu)建成只包括重鏈或輕鏈，其中包含兩個或多個含可特異性結(jié)合LT-β受體的CDR的可變區(qū)。
一方面，本發(fā)明包括多價抗體構(gòu)建體，該構(gòu)建體是人淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑。一個實施方案中，多價抗體構(gòu)建體含有至少一個特異性結(jié)合LT-β-R表位的抗原識別位點。一些實施方案中，至少一個所述抗原識別位點位于scFv結(jié)構(gòu)域，其它實施方案種，所有抗原識別位點都位于scFv結(jié)構(gòu)域。
抗體構(gòu)建體可以是二價的，三價的，四價的或五價的。一些實施方案中，所述抗體構(gòu)建體是單特異性的。一個實施方案中，所述抗體構(gòu)建體特異于可與CBE11結(jié)合的表位。其它實施方案中，本發(fā)明的所述抗體是單特異性的四價LT-β-R激動劑抗體，其中含有四個CBE11-抗原識別位點。另一個實施方案中，所述抗體構(gòu)建體特異于BHA10表位，一些實施方案中是四價的。這些實施方案的任一個中，至少一個抗原識別位點位于scFv結(jié)構(gòu)域，而這些實施方案中的一些中，所有抗原識別位點都位于scFv結(jié)構(gòu)域?？贵w可以是多特異性的，其中本發(fā)明所述抗體可結(jié)合人LT-β受體上的不同表位。
一些實施方案中，所述抗體構(gòu)建體是雙特異性的。其它實施方案中，所述抗體構(gòu)建體特異性針對淋巴毒素-β受體(LT-β-R)表位組中的至少兩個成員，該表位組是由可與下列抗體之一結(jié)合的表位組成的BKA11，CDH10，BCG6，AGH1，BDA8，CBE11或BHA10。一個實施方案中，所述抗體構(gòu)建體特異性針對可與CBE11和BHA10結(jié)合的表位，一些實施方案中，該構(gòu)建體是四價的。一個實施方案中，所述抗體構(gòu)建體具有2個CBE11-特異性抗原識別位點和2個BHA10-特異性識別位點，其中所述抗體是雙特異性的四價的LT-β-R激動劑抗體。任一所述多特異性的抗體構(gòu)建體中，至少一個抗原識別位點位于scFv結(jié)構(gòu)域，一些實施方案中，所有抗原識別位點都位于scFv結(jié)構(gòu)域。
其它實施方案中，本發(fā)明所述抗體構(gòu)建體包含下表2中的多核苷酸序列和編碼的多肽序列表2


另外，含有SEQ ID NOs11-14所示重鏈和輕鏈的五聚CBE11構(gòu)建體還可以用于篩選試驗，鑒定聯(lián)合用藥的療效。
所述抗原識別位點或整個可變區(qū)可以是源自一種或多種親代抗體。所述親代抗體可以包括天然存在的抗體或抗體片段，由天然存在抗體改造而來的抗體或抗體片段，使用已知特異于LT-β受體的抗體或抗體片段的序列從頭構(gòu)建的抗體?？梢栽醋杂H代抗體的序列比包括重和/或輕鏈可變區(qū)和/或CDR，其框架區(qū)或其它部分。
多價的、多特異性抗體可以含有包含兩個或多個可變區(qū)的重鏈和/或包含一個或多個可變區(qū)的輕鏈，其中所述可變區(qū)中的至少2個識別LT-β受體上的不同的表位。
用于制造多價多特異性抗體的方法已為本領(lǐng)域所知。全長雙特異性抗體的常規(guī)制備方法是基于2個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對共表達，其中這2個鏈具有不同的特異性(milstein等。，Nature，305537-539(1983))。因為免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機組合，所以這些雜交瘤(quadromas)生產(chǎn)出10種不同抗體分子的潛在混合物，其中只有一種抗體分子具有所述正確的雙特異性的結(jié)構(gòu)。該正確分子的純化，通常通過親和層析步驟完成，相當繁重，并且產(chǎn)量很低。類似方法的描述見WO 93/08829，以及Traunecker et al.，EMBO J.，103655-3659(1991)。
可以使用源自親代抗LT-β-R抗體的不同序列按照多種方式構(gòu)建多價抗LT-β-R抗體，包括鼠或人源化BHA10(B Rowning et al.，J.Immunol.15433(1995)；BRowning et al.J.Exp.Med.183867(1996))和/或鼠或人源化CBE11(美國專利6,312,691)。
根據(jù)一種不同的方法，將帶有所需結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合部位)的抗體可變區(qū)融合于免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。優(yōu)選地，所述融合是與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域融合，其中含有至少部分鉸鏈區(qū)，CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選地，具有含有輕鏈結(jié)合必需位點的第一重鏈恒定區(qū)(CH1)，其出現(xiàn)在至少一種所述融合體中。將編碼所述免疫球蛋白重鏈融合體的DNA以及如果需要還有編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA插入獨立的表達載體，然后共轉(zhuǎn)染入合適的宿主有機體。這就為當在構(gòu)建中使用比例不等的三種多肽鏈以提供最適產(chǎn)量的實施方案，提供了很大的靈活性調(diào)整實施方案中所述三種多肽相互間的比例。但是，當至少兩種多肽鏈等比例表達得到高產(chǎn)時，或者當所述比例不特別重要時，可以將兩種或全部三種多肽鏈的編碼序列插入一個表達載體。
本發(fā)明的另一實施方案包括人抗LT-β-R抗體的用途，其可以在非人類動物，例如攜帶一種或多種人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生。這類動物可以作為制備雜交瘤所需脾細胞的來源，描述見美國專利5,569,825，WO00076310，WO00058499和WO00037504，在此引入作為參考。
一些實施方案中，本發(fā)明所述抗體和抗體片段可以是用化學(xué)方法修飾達到所需要的效果。例如，本發(fā)明抗體和抗體片段的聚乙二醇化可以使用本領(lǐng)域已知的任一聚乙二醇化反應(yīng)完成，描述參見，例如，下列參考文獻Focus on Growth Factors 34-10(1992)；EP 0 154 316；EP 0 401 384(這些文獻中的每一篇在此均全文引入作為參考)。優(yōu)選地，所述聚乙二醇化通過與聚乙二醇分子(或類似的反應(yīng)性水溶性聚合物)的?；磻?yīng)或烴基化反應(yīng)實現(xiàn)。用于本發(fā)明所述抗體和抗體片段聚乙二醇化的優(yōu)選的水溶性聚合物為聚乙二醇(PEG)。在本申請中，“聚乙二醇”是指已經(jīng)被用于衍生化其它蛋白質(zhì)的任一形式的PEG，例如單(C1-C1O)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
用于制備聚乙二醇化的本發(fā)明抗體和抗體片段的方法通常包括下列步驟(a)讓抗體或抗體片段與聚乙二醇例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物，在所述抗體或抗體片段能夠結(jié)合于一個或多個PEG基團的條件下發(fā)生反應(yīng)，以及(b)獲取反應(yīng)產(chǎn)物。根據(jù)已知參數(shù)和預(yù)期結(jié)果選擇最佳反應(yīng)條件或?；磻?yīng)對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
聚乙二醇化抗體和抗體片段通?？捎糜谥委熗ㄟ^施用本申請所述抗體和抗體片段可減輕或調(diào)節(jié)的疾病。與非聚乙二醇化抗體和抗體片段相比，聚乙二醇化抗體和抗體通常具有延長的半衰期。所述聚乙二醇化抗體和抗體片段可以單獨使用，或者與其它藥物組合物聯(lián)合用藥。
本發(fā)明的其它實施方案中，使用本領(lǐng)域已知技術(shù)將所述抗體或其抗原結(jié)合片段偶聯(lián)于白蛋白。
本發(fā)明的另一個實施方案中，抗體，或其片段，經(jīng)過修飾減少或消除了潛在的糖基化位點。這類經(jīng)過修飾的抗體通常稱為″去糖基化的(aglycosylated)″抗體。為了提高抗體或其抗原-結(jié)合片段的結(jié)合親合力，可以改變所述抗體的糖基化位點，例如，通過誘變(例如，定點誘變)?！逄腔稽c″是指被真核細胞識別作為糖基結(jié)合位置的氨基酸殘基。碳水化合物例如寡糖結(jié)合的氨基酸通常為天冬酰胺(O-連接)，絲氨酸(O-連接)，和蘇氨酸(O-連接)殘基。為了鑒定抗體或抗原-結(jié)合片段中潛在的糖基化位點，例如，使用公眾可獲得的數(shù)據(jù)庫對所述抗體的序列進行檢測，所述數(shù)據(jù)庫諸如the Center for Biological Sequence Analysis提供的網(wǎng)址(參見http∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/用于預(yù)測N-連接的糖基化位點)和http∥www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/用于預(yù)測氧-連接的糖基化位點)。用于改變抗體糖基化位點的其它方法的描述參見美國專利6,350,861和5,714,350。
本發(fā)明的另一個實施方案中，可以改變抗體或其片段，其中該抗體的恒定區(qū)經(jīng)過修飾，相對于未經(jīng)修飾的抗體減少了至少一種恒定區(qū)-介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)器功能。為了修飾本發(fā)明的抗體使得其與Fc受體(FcR)結(jié)合能力減弱，可以在FcR相互作用所必需的特定區(qū)域?qū)⑺隹贵w的免疫球蛋白恒定區(qū)片段突變(參見例如，Canfield et al(1991)J.Exp.Med.1731483；andLund，J.et al.(1991)J.of Immunol.1472657)。抗體FcR結(jié)合能力的減弱還能降低其它依賴FcR相互作用的效應(yīng)器功能，例如調(diào)理作用和吞噬作用和抗原-依賴性細胞的細胞毒性。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明還提供了具有改變的效應(yīng)器功能的抗體，例如結(jié)合效應(yīng)分子的能力，例如補體或效應(yīng)細胞上的受體。具體而言，本發(fā)明所述人源化抗體具有改變了的恒定區(qū)，例如，F(xiàn)c區(qū)，其中至少一個氨基酸殘基已經(jīng)被不同殘基或側(cè)鏈所取代，從而減弱了該抗體結(jié)合FcR的能力。抗體FcR結(jié)合能力的減弱還能減弱其它依賴于FcR相互作用的效應(yīng)器功能，例如調(diào)理作用和吞噬作用和抗原-依賴性細胞的細胞毒性。一個實施方案中，所述修飾后的人源化抗體是IgG類，包含至少一個Fc區(qū)中的氨基酸殘基取代，從而使得所述人源化抗體具有改變了的效應(yīng)器功能，例如，與未經(jīng)修飾的人源化抗體相比。具體實施方案中，本發(fā)明所述人源化抗體具有改變了的效應(yīng)器功能因而其免疫原性減弱(例如，不能激發(fā)非所需效應(yīng)細胞活性、溶解或補體結(jié)合)，和/或具有更合乎需要的半衰期，同時仍然保持了針對LTβR或其配體的特異性。
可選，本發(fā)明涉及人源化抗體，其恒定區(qū)改變從而提高其與FcR，例如FcgR3結(jié)合的能力。這類抗體可用于調(diào)節(jié)效應(yīng)細胞功能，例如，用于增加ADCC活性，例如，具體而言為用于本發(fā)明的腫瘤學(xué)應(yīng)用。
在本申請中，″抗體-依賴性細胞-介導(dǎo)細胞毒″和″ADCC″是指細胞-介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達FcR的非特異性細胞毒性細胞(例如自然殺傷(NK)細胞，嗜中性細胞和巨噬細胞)能夠識別結(jié)合于靶細胞上的抗體，隨后引發(fā)所述靶細胞的溶解。介導(dǎo)ADCC的初級細胞，NK細胞，只表達抗體例如該抗體與另一藥劑或抗體的偶聯(lián)物的FcgRIII，而單核細胞表達抗體例如該抗體與另一藥劑或抗體的偶聯(lián)物的FcgRI、FcgRII和FcgRIII。
另一個實施方案中，本發(fā)明所述抗LT-β-R抗體可以與化療劑偶聯(lián)以超-相加方式抑制腫瘤體積?？梢耘c本發(fā)明所述抗體偶聯(lián)的示范性的化療劑包括，但不限于放射性偶聯(lián)物(90Y，131I，99mTc，111In，186Rh，等)，腫瘤-活化的前藥(美登類化合物(maytansinoid)，CC-1065類似物，clicheamicin衍生物，蒽環(huán)類抗生素，長春花生物堿(vinca alkaloid)，等)，蓖麻毒，白喉(diphtheria)毒素，假單胞菌屬外毒素。
公知，其它LT-β-R激動劑——包括但不限于使用體外腫瘤細胞毒性試驗鑒定的那些——當單獨施用或聯(lián)合施用給動物或者人時，在體內(nèi)具有類似的抗腫瘤作用。
LT-β-R激動劑對腫瘤細胞的細胞毒作用在LT-β-R活化劑，具體為IFN-γ存在下得到加強。能誘導(dǎo)干擾素優(yōu)選IFN-γ的任一藥劑，和能增強LT-α/β異聚復(fù)合體和抗LT-β-R抗體對腫瘤細胞的細胞毒性作用的任一藥劑，都屬于本發(fā)明所述的LT-β-R激動劑。例如，臨床實驗已經(jīng)顯示了雙股RNA(dsRNA)治療的干擾素誘導(dǎo)。因此，多核糖鳥苷酸/多核糖胞苷酸(聚-rG/rC)及其它形式的dsRNA可以充當干擾素誘導(dǎo)劑(Juraskova et al.，Eur.J.Pharmacol.，221，pp.107-11(1992))。
可以將上述方法制備的LT-β-R激動劑純化至適于用作藥物組合物的純度。通常，純化的組合物是指該組合物中一種組分超過全部組分的約85％，超過全部組分的約85％、90％、95％、99％或更多。所述目的組分可以純化至基本同質(zhì)(在所述組合物中用常規(guī)檢測方法檢測不到污染組分)，其中所述組合物基本上由單一組分組成。按照本申請的教導(dǎo)，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用蛋白質(zhì)純化的常規(guī)方法純化本發(fā)明的多肽。多肽的純度可以用本領(lǐng)域已知的多種方法測定，包括例如，氨基-末端氨基酸序列分析，凝膠電泳和質(zhì)譜分析。
LT-βR激動劑和化療劑的超-相加抑制3.1化療劑本發(fā)明提供了淋巴毒素-β受體激動劑和化療劑聯(lián)合用藥治療癌癥。同樣地，多種化療劑中任一種都可用于或受試用于本發(fā)明所述方法，只要激動劑和化療劑的聯(lián)用實現(xiàn)的腫瘤抑制效果大于將單獨使用激動劑和化療劑的效果單純相加的預(yù)期效果即可。根據(jù)如何影響癌細胞中特異性化學(xué)物質(zhì)的不同，將化療藥物分為數(shù)類，所述藥物干擾細胞活性或程序，所述藥物影響所述細胞周期的特定時期。
一些實施方案中，所述化療劑是干擾DNA合成的藥劑。一個實施方案中，所述的干擾DNA合成的藥劑是核苷類似物化合物。一些實施方案中，所述核苷類似物化合物是吉西他濱。另一實施方案中，所述的干擾DNA合成的藥劑是蒽環(huán)類抗生素，一些實施方案中，所述蒽環(huán)類抗生素是阿霉素。
其它實施方案中，所述化療劑是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑。一些實施方案中，所述拓撲異構(gòu)酶I抑制劑是Camptosar。
其它實施方案中，所述化療劑中是烷化劑。烷化劑直接作用于DNA阻止癌細胞的復(fù)制。作為一類藥物，這些藥劑不是階段-特異性(換句話說，它們在細胞周期的全部階段中都發(fā)揮作用)。烷化劑通常具有抗下列疾病的活性慢性白血病(chronic leukemias)、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin’slymphoma)、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma)、以及一些肺癌、乳腺癌及卵巢癌。烷化劑的實例包括白消安、順氯氨鉑、卡鉑、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，氮烯唑胺(DTIC)、氮芥(mechlorethamine)(氮芥(nitrogen mustard)，和苯丙氨酸氮芥(melphalan)。一個實施方案中，所述烷化劑是鉑化合物，一些實施方案中，選自卡鉑和順氯氨鉑。一些實施方案中，所述鉑化合物是順氯氨鉑。
其它實施方案中，所述化療劑植物堿。一個實施方案中，所述植物堿是紫杉烷，包括，例如，紅豆杉醇。
也可以使用各種形式的化療劑和/或其它生物活性劑。這些包括，但不限于，不帶電的分子、分子復(fù)合體、鹽、醚、酯、酰胺等，當植入、注射入或者插入腫瘤中時它們在生物學(xué)意義上被活化。
3.2超-相加化療劑的篩選本發(fā)明提供了用于篩選具有下述特性的化療劑的方法即當與淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑聯(lián)合用藥時產(chǎn)生超-相加的腫瘤體積抑制效果。一個實施方案中，所述方法包括(a)讓受試者中第一腫瘤與LT-β-R激動劑接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；(b)讓受試者中可比的第二腫瘤與候選化療劑接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；以及(c)讓受試者中可比的第三腫瘤與所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑二者接觸，然后測量腫瘤體積的抑制情況；其中，當所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑二者存在下對腫瘤體積的抑制大于所述LT-β-R激動劑和所述候選化療劑單一存在下對腫瘤體積抑制之和時，則可以認為所述候選化療劑具有抑制腫瘤體積的超-相加作用。
在本申請中，″對腫瘤的超-相加抑制″是指LT-β-R與化療劑聯(lián)合用藥產(chǎn)生的平均腫瘤抑制，統(tǒng)計學(xué)上顯著地于所述LT-β-R激動劑和化療劑分別單獨用藥時產(chǎn)生的腫瘤抑制的總和。LT-β-R激動劑和化療劑聯(lián)合給藥產(chǎn)生的腫瘤抑制是否“統(tǒng)計學(xué)上顯著大于”單個化合物的預(yù)期相加值，可以用下述方法測定。所述超-相加抑制可以是加強性的，或者協(xié)同性的，如上所定義。
通常，可以通過下述方法評估加強測定試驗組聯(lián)合用藥是否能夠產(chǎn)生這樣的平均腫瘤體積縮小，其與試驗組分別單個用藥產(chǎn)生的平均腫瘤體積縮小之和相比，為統(tǒng)計學(xué)上顯著超-相加的。所述平均數(shù)腫瘤體積縮小可以計算為對照組和試驗組之間平均腫瘤體積的差。腫瘤體積的被抑制分值，″受影響分值″(Fa)，可以通過用試驗組平均數(shù)腫瘤體積縮小除以對照組平均數(shù)腫瘤體積計算得出。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。檢驗統(tǒng)計學(xué)上的顯著加強需要計算每一試驗組的Fa。聯(lián)合用藥的預(yù)期相加Fa被認為是單獨接受所述聯(lián)合用藥中任一種藥物的組的平均Fa之和。例如，可以使用雙尾單樣本T-檢驗來評估試驗得到的結(jié)果有多大可能是單純隨機產(chǎn)生的，如通過p-值測定的那樣。小于0.05的p-值被認為是統(tǒng)計學(xué)顯著的，包括但不限于約0.05-約0.04；約0.04-約0.03；約0.03-約0.02；約0.02-約0.01，即，不可能是隨機產(chǎn)生的。一些情況下，p-值可能會小于0.01。因此，要認定是聯(lián)合用藥產(chǎn)生了加強的超-相加效果，那么聯(lián)合用藥試驗組的Fa就必須統(tǒng)計學(xué)上顯著大于單因素試驗組的預(yù)期相加Fa。
協(xié)同效應(yīng)是否源自于聯(lián)合用藥可以通過中間值-效果/聯(lián)用-指數(shù)等效線圖解法評定(Chou，T.，and Talalay，P.(1984)Ad.Enzyme Reg.，2227-55)。在該方法中，根據(jù)從LT-β-R激動劑單用時的、化療劑單用時的以及這二者以一定摩爾比聯(lián)用時的中間值-效果曲線得到的參數(shù)，計算出不同劑量-效果水平的聯(lián)用指數(shù)(CI)值。CI值＜1表明協(xié)同作用，所述CI值包括但不限于約0.85-約0.90；約0.70-約0.85；約0.30-約0.70；約0.10-約0.30。還有另一個實施方案中，所述聯(lián)用指數(shù)是小于0.10。這種分析可以使用劑量效果分析用的CalcuSyn、Windows_軟件(Biosoft，CamβRidge UK)實施。
本領(lǐng)域已知的或隨后發(fā)展的用于分析超-相加效果是否因聯(lián)合治療而產(chǎn)生的任一方法都可用于篩選合適的化療劑。
在本發(fā)明的一個實施方案中，在治療癌癥方面具有聯(lián)合超-相加效果的激動劑/化療劑聯(lián)用通過本領(lǐng)域已知的篩選實驗包括測定腫瘤體積抑制情況的實驗進行鑒定。腫瘤體積常常用作評定一種化合物或聯(lián)用化合物的抗-癌癥藥效的代表(參見實施例，Naundorf，et al.(2002)Int.J.Cancer，100101；Goel.，et al.(2001)Clin Cancer Res.7175；Liao，et al.(2000)Cancer Res.606805；Prewett，et al.(1999)Cancer Res.595209；Boudreau M.D.，et al.(2001)Cancer Res.611386)，腫瘤體積可以使用異種移植模型進行研究。用于篩選激動劑/化療劑的異種移植模型的實例包括WiDr人結(jié)腸直腸腺癌和KM-20L2人結(jié)腸直腸腺癌。另外，現(xiàn)在還已經(jīng)公開了抗-Erb2抗體Herceptin(參見美國專利No.6,627,196)和抗-VEGF抗體(參見美國專利No.5,955,311)使小鼠模型的腫瘤體積縮小或抑制。用于評定腫瘤大小(例如腫瘤體積)的指導(dǎo)方案記載于，“NCI-cooperative group-industryrelationship guidelines，appendix XVII(Status of the NCI preclinical antitumoragent discovery screen，principles and practice of oncology updates)”。
評價一種或多種抗體和/或化學(xué)治療化合物抗癌藥效的其它方法包括存活及死亡率分析試驗，以及合適的標記物(例如前列腺癌癥中的PSA，結(jié)腸癌中的TPA)評價，其中所述標記物的水平可以在評估化合物的抗癌活性中進行評估。
4.藥物組合物及遞送裝置4.1藥物組合物本發(fā)明提供了含有上述LT-β-R激動劑和化療劑的藥物組合物。一個方面，本發(fā)明提供了可藥用的組合物，其中含有一種治療-有效量的一種或多種上述化合物，以及與之配制在一起的一種或多種可藥用的載體(相加)和/或稀釋劑。另一個方面，一些實施方案中，本發(fā)明所述化合物獨自或與可藥用的載體混合施用，以及還可以與其它化療劑聯(lián)合施用。因此，結(jié)合(聯(lián)合)治療包括活性化合物的連續(xù)、同時以及分別或以隨后施用時首先施用藥物的治療效果還未完全消失的方式共-施用。
無論選擇什么樣的施用途徑，都應(yīng)通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將可采用水合形式的本發(fā)明所述化合物和/或本發(fā)明所述藥物組合物配制成可藥用的劑型。盡管本發(fā)明的化合物可以單獨施用，但是優(yōu)選將所述化合物以藥物制劑(組合物)形式施用。本發(fā)明所述化合物可以配制成與其它藥物類似的任何便于人醫(yī)或獸醫(yī)施用的形式。
如下文詳述，可以將本發(fā)明所述藥物組合物為施用而專門配制為固相或液相形式，包括適合于下列施用途徑的制劑形式(1)口服，例如，灌劑(drench)(含水或非水溶液或懸液)，片劑，例如，用于頰、舌下和系統(tǒng)吸收的片劑，丸劑，粉劑，顆粒劑，用于舌頭的糊劑；(2)腸胃外施用，例如，通過皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或硬膜外注射，作為例如無菌溶液或懸液，或緩釋制劑給藥；(3)局部施用，例如，乳膏劑，軟膏劑，或者應(yīng)用于皮膚的控制-釋放的貼劑或噴霧劑；(4)阻道內(nèi)或者直腸內(nèi)施用，例如，作為陰道栓(pessary)、乳膏或泡沫；(5)舌下施用；(6)在眼部施用；(7)透皮；或者(8)在鼻部施用。一個實施方案中，所述藥物組合物配制為用于腸胃外施用。另一個實施方案中，所述藥物組合物配制為用于動脈內(nèi)注射。另一個實施方案中，所述藥物組合物配制為用于系統(tǒng)給藥。
其它情況下，本發(fā)明所述化合物可以含有一或多個酸性功能基團，因而能與可藥用的堿基形成可藥用的鹽。
潤濕劑、乳化劑和潤滑劑例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑，釋放劑(release agent)，包被劑，甜味劑、調(diào)味劑及芳香劑，防腐劑以及抗氧化劑也可以存在于所述組合物中。
本發(fā)明的制劑包括適于口服、經(jīng)鼻、局部(包括頰和舌下)、直腸、陰道和/或腸胃外給藥的制劑。所述制劑可以便利地以單位劑型存在，可以用制藥領(lǐng)域熟知的任一方法制備?？梢耘c載體物質(zhì)結(jié)合制備單一劑型的活性成分的量隨要治療的宿主、具體的給藥方式而變化?？梢耘c載體物質(zhì)聯(lián)合制備單一劑型的活性成分的量通常是所述化合物產(chǎn)生療效的量。
本發(fā)明所述化合物的口服液態(tài)劑型包括可藥用的乳劑、微乳劑、溶液、懸液、糖漿和酏劑。除所述活性成分之外，所述液體劑型還可以含有本領(lǐng)域常用惰性稀釋劑，例如，水或者其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例如乙醇，異丙醇，碳酸乙酯(ethyl carbonate)，乙酸乙酯，苯甲基醇(benzyl alcohol)，苯甲酸芐酯(benzyl benzoate)，丙二醇，1，3-丁二醇，油(具體是棉籽油油，花生，玉米油，胚芽油(germ)，橄欖油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氫呋喃甲醇(tetrahydrofuryl alcohol)，聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯，及其混合物。除惰性稀釋劑之外，所述口服組合物還可以包含佐劑例如潤濕劑、乳化及懸浮劑，甜味劑、調(diào)味劑、著色劑、芳香劑及防腐劑。懸液，除所述活性化合物之外，還可以含有助懸劑，例如，乙氧化的異硬脂酰醇，聚氧乙烯山梨醇及山梨聚糖酯，微晶纖維素，氫氧化鋁(aluminummetahydroxide)，斑脫土(bentonite)，瓊脂-瓊脂(agar-agar)和黃蓍膠，及其混合物。
適于口服的本發(fā)明制劑可以采用下列劑型膠囊劑，扁囊劑(cachet)，藥丸，片劑，糖錠(lozenge)(使用一種加香的基質(zhì)，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)，粉末，顆粒，或者含水或非水液體中的溶液或懸液，或者水包油或油包水型乳液，或者酏劑或糖漿，或者錠劑(pastille)(使用一種惰性的基質(zhì)，例如明膠和甘油，或者蔗糖和阿拉伯膠)和/或漱口劑等，每一種劑型都含有預(yù)定量的本發(fā)明化合物作為活性成分。本發(fā)明的化合物還可以以丸劑(bolus)、藥糖劑(electuary)或糊劑(paste)的形式施用。
在口服的本發(fā)明固體劑型(膠囊、片劑、藥丸、糖衣丸(dragee)、粉劑、顆粒等)中，所述活性成分混以一種或多種可藥用的載體，例如檸檬酸鈉或者磷酸氫鈣，和/或任一下列物質(zhì)(1)填料或者膨脹劑，例如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇，和/或硅酸；(2)粘合劑，例如，羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯基吡咯烷酮，蔗糖和/或阿拉伯膠；(3)濕潤劑，例如甘油；(4)崩裂劑，例如瓊脂-瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯或者木薯淀粉，藻酸，某些硅酸鹽，以及碳酸鈉；(5)溶液阻滯劑(solution retarding agent)，例如石蠟；(6)吸收促進劑，例如季銨化合物；(7)潤濕劑，例如鯨蠟基醇，單硬脂酸甘油酯，和非離子型表面活性劑；(8)吸收劑，例如高嶺土(kaolin)及班脫土(bentonite clay)；(9)潤滑劑，例如滑石，硬脂酸鈣，硬脂酸鎂，固體聚乙二醇，月桂基硫酸鈉，及其混合物；以及(10)著色劑。就膠囊、片劑和藥丸而言，所述藥物組合物還可以含有緩沖劑。類似類型的固態(tài)組合物還可以利用乳糖或乳糖等賦形劑以及高分子量聚乙二醇等作為軟及硬殼膠囊中的填料。
片劑可以通過壓制或模制而成，任選含有一種或多種附加成分。壓制片的制備可以使用粘合劑(例如，明膠或者羥丙基甲基纖維素)，潤滑劑，惰性稀釋劑，防腐劑，崩解劑(例如，淀粉羥基乙酸鈉或者交聯(lián)的羧甲基纖維素鈉)，表面活性劑或者分散劑。模制片可以通過將濕潤的粉末化合物與惰性液態(tài)稀釋劑的混合物在合適的機器中澆模制備而成。本發(fā)明所述藥物組合物的片劑及其它固體劑型，例如糖衣丸，膠囊、藥丸和顆粒，可以任選地加上包衣或外殼制成，例如腸溶包衣以及本領(lǐng)域熟知的其它包衣。另外，還可以將它們配制以提供其中活性成分的緩慢或受控制的釋放，例如，使用能提供所需釋放曲線的不同比例的羥丙基甲基纖維素，其它聚合物基質(zhì)，脂質(zhì)體和/或微球體?？梢詫⑺鼈兣渲茷榭焖籴尫诺男问剑?，凍干的。可以通過下述方法將它們滅菌例如用阻菌(bacteria-retaining)濾膜過濾，或者在無菌固相組合物中引入滅菌劑，該組合物可以即用即配溶于無菌水或一些其它無菌可注射介質(zhì)。這些組合物還可以任選含有遮光劑(opacifyingagents)，而且可以是這樣一種組合物，即它們僅在或者優(yōu)選在胃腸道的某一部分釋放，任選以延遲方式?？梢允褂玫陌窠M合物的實例包括聚合物及蠟。所述活性成分還可以微膠囊化形式存在，如果合適，使用一種或多種上述賦形劑。
本發(fā)明所述化合物的局部或透皮施用的劑型包括粉劑、噴霧劑、軟膏劑、糊劑、乳膏劑、洗液、凝膠劑、溶液、貼劑和吸入劑。所述活性化合物可以在無菌條件下與可藥用的載體混合，并且需要的話混以任一種防腐劑、緩沖液、或者推進劑。除本發(fā)明所述的活性化合物之外，所述軟膏劑、糊劑、乳膏劑及凝膠劑可以含有賦形劑，例如動物和植物脂肪，油劑，蠟，石蠟，淀粉，黃蓍膠，纖維素衍生物，聚乙二醇，硅酮，班脫土，硅酸，滑石及氧化鋅，或其混合物。除本發(fā)明所述的化合物之外，粉劑及噴霧劑可以含有賦形劑例如乳糖，滑石，硅酸，氫氧化鋁，硅酸鈣及聚酰胺粉末，或這些物質(zhì)的混合物。另外，噴霧劑還可以含有常用推進劑，例如氯氟烴及揮發(fā)性的未被取代的烴，例如丁烷及丙烷。
適于腸胃外施用的本發(fā)明所述藥物組合物含有一種或多種本發(fā)明的化合物以及一種或多種可藥用的無菌等滲含水或無水溶液、分散液(dispersions)、懸液或乳液，或者無菌粉末，該粉末可以即用即配重新溶解于無菌注射液或者分散液，所述注射液或分散液中可以含有糖，酒精，抗氧化劑，緩沖液，抑菌劑，可使該制劑與目的接受者的血液等滲的溶質(zhì)或者助懸或增稠劑。這些組合物還可以含有佐劑例如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。為了確保本發(fā)明化合物不受微生物的作用可以在加入各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如，對羥苯甲酸(paraben)，氯代丁醇，苯酚山梨酸(phenolsorbic acid)等。此外，還可以根據(jù)需要在所述組合物中含有等滲劑，例如糖、氯化鈉等。此外，還可以通過引入可延遲吸收的試劑例如單硬脂酸鋁及明膠，實現(xiàn)可注射藥物形式的長效吸收。
一些情況下，為了延長藥物的效果，根據(jù)需要減緩皮下或肌肉注射的吸收。這一點可以通過利用水溶性很差的結(jié)晶或非結(jié)晶物質(zhì)的液體懸浮液完成。然后，所述藥物的吸收率取決于它的溶解速度，反過來溶解速度取決于晶粒大小及結(jié)晶形狀?？蛇x，通過將所述藥物溶解或懸浮于油載體中，實現(xiàn)胃腸外-施用藥物形式的延遲吸收。
通過用可生物降解的聚合物例如聚交酯-聚乙醇酸(polyactide-polyglycolide)將本發(fā)明化合物微膠囊化制成可注射的儲存(depot)形式?？梢愿鶕?jù)藥物與聚合物之間的比例和所采用的具體聚合物的特性，控制藥物釋放的速率。其它可生物降解的聚合物的實例包括聚(原酸酯)及聚(酐)。還可以通過將所述藥物包埋于與身體組織相容的脂質(zhì)體或微乳劑，制備可注射的貯存劑型。
遞送方法與裝置另外，還可以利用藥物遞送裝置施用本發(fā)明所述的藥物組合物，所述的遞送裝置包括皮下注射器，多室注射器，支架，導(dǎo)管，經(jīng)皮貼劑，顯微操作針，顯微研磨器，和可植入控制釋放用具。一個實施方案中，藥物遞送裝置含有或能裝有至少有效量的LT-β-R激動劑及有效量的化療劑。一些實施方案中，所述裝置能同時遞送或施用所述LT-β-R激動劑及化療劑。在用所述裝置施用之前，所述裝置能夠?qū)⑺黾觿┖突焺┗旌?。其它另外的實施方案中，所述裝置連續(xù)地施用所述LT-β-R激動劑和化療劑。
一種加強型的藥物遞送裝置是能在注射前混合兩種化合物或順序遞送它們的多室注射器。常用的兩室注射器以及預(yù)裝填的所述注射器的自動化生產(chǎn)方法公開于Neue Verpackung，No.3，1988，p.50-52；Drugs Made inGermany，Vol.30，Pag.136-140(1987)；Pharm.Ind.46，Nr.10(1984)p.1045-1048 and Pharm.Ind.46，Nr.3(1984)p.317-318。注射器型安瓿是一種雙室裝置，該裝置具有一個開放用于連接針頭的前瓶區(qū)，兩個活塞和外部的繞流管(by-pass)，使得盛裝于前室的凍干粉與后室中的重配液在該繞流管中混合。所述方法包括下列主要步驟洗滌并硅烷化注射器筒，將多個注射器筒插入載體托盤(carrier tray)，滅菌，將中間活塞經(jīng)由筒尾端引入，翻轉(zhuǎn)(upside down)所述托盤，通過筒尾端加入粉末溶液，凍干成干粉，在凍干室中時關(guān)閉前開口，翻轉(zhuǎn)托盤，通過筒尾末端插引入重配的液體，插入尾塞(rear piston)，移去托盤中的產(chǎn)物，最后控制(final control)并包裝。可以生產(chǎn)預(yù)裝填了不同成分的安瓿以便與所述注射器配合使用。
另一個實施方案中，所述多室注射器是一種Lyo-Lyo-Ject系統(tǒng)(Vetter Pharma Turm，Yardley，PA)。所述Lyo-Ject可以讓用戶將所述藥物直接凍干于注射器中，并且該系統(tǒng)還配套有用于快速重配并注射的稀釋劑。描述見專利4,874,381和5,080,649。
其它實施方案中，所述化合物利用兩個單獨的注射器、導(dǎo)管、顯微針、或其它能完成注射的裝置來施用。
本發(fā)明所述的藥物組合物還可以利用放入所作用組織內(nèi)的、附近的或者與受影響組織或血流相聯(lián)系的微球體、脂質(zhì)體、其它微粒遞送系統(tǒng)或緩釋劑型施用。緩釋載體的合適的實例包括成型制品例如栓劑或微膠囊形式的半透性聚合物基質(zhì)?？芍踩氲幕蛭⒛倚途忈尰|(zhì)包括聚交酯(美國專利No.3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidmanet al.，Biopolymers，22，pp.547-56(1985))；聚(2-羥乙基-異丁烯酸)或乙烯-乙酸乙烯共聚物(Langer et al.，J.Biomed.Mater.Res.，15，pp.167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12，pp.98-105(1982))。本發(fā)明所述組合物將以有效劑量施用治療特定的臨床病癥。優(yōu)選藥物制劑的確定以及給定應(yīng)用的治療有效劑量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員考慮到下列因素而確定，例如，患者的身體狀況及體重，預(yù)期治療程度以及所述患者對所述治療的耐受性。
經(jīng)皮貼劑具有額外的好處，能將本發(fā)明化合物控制送遞至身體。這類劑型可以通過將所述化合物溶解或分散于適當介質(zhì)制備而成。另外還可以利用吸收增強因子增加所述化合物透過皮膚的通量。所述通量的速率可以通過下述手段控制提供一種速率控制膜或?qū)⑺龌衔锓稚⒂诰酆衔锘蚰z中。
治療方法本發(fā)明進一步還提供了新型的治療癌癥治療方法，其中包括向所述受試者施用有效量的本發(fā)明藥物組合物，任選使用上述的遞送裝置。
本發(fā)明所述方法可用于治療任一癌癥，包括但不限于治療實體瘤，可以用本發(fā)明化合物治療的實體瘤的實例，包括但不限于乳腺癌，睪丸癌，肺癌，卵巢癌，子宮癌，宮頸癌，胰腺癌，非小細胞肺癌(NSCLC)，結(jié)腸癌，以及前列腺癌，胃癌，皮膚癌，胃癌，食道癌和膀胱癌。一些實施方案中，所述方法包括以胃腸道外方式向受試者施用有效量的本發(fā)明藥物組合物。一個實施方案中，所述方法包括以經(jīng)動脈內(nèi)方式向受試者施用本發(fā)明的組合物。其它實施方案中，所述方法包括直接向受試者中腫瘤的動脈血供給施用有效量的本發(fā)明所述組合物。一個實施方案中，所述方法包括使用導(dǎo)管直接向癌性腫瘤的動脈血供給施用有效量的本發(fā)明所述組合物。在使用導(dǎo)管施用本發(fā)明組合物的實施方案中，所述的導(dǎo)管插入可以通過熒光檢查或其它本領(lǐng)域已知的觀察和/或引導(dǎo)導(dǎo)管插入的方法而得以引導(dǎo)或觀察。另一個實施方案中，所述方法包括化療栓塞。例如化療栓塞方法可以包括，用一種由混以油基劑的樹脂-樣材料(例如混入乙碘油中的聚乙烯醇)與一或多種化療劑組成的組合物，將為癌性腫瘤提供營養(yǎng)的血管堵塞。其它另外的實施方案中，所述方法包括以系統(tǒng)施用的方式向受試者施用本發(fā)明的組合物。
通常，使用本發(fā)明藥物組合物的化療栓塞或定向動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射治療往往采用類似的方式，與位點無關(guān)。簡而言之，待栓塞區(qū)域的血管造影術(shù)(血管的分布圖)或更具體地說一些實施方案中待栓塞區(qū)域的動脈圖(arteriography)可首先通過將不透射線的反襯物通過插入動脈或靜脈(根據(jù)待栓塞或待注射的位點而定)的導(dǎo)管來注入而作為用X射線獲得。所述導(dǎo)管可以經(jīng)皮或通過外科手術(shù)插入。然后，使本發(fā)明的藥物組合物通過導(dǎo)管回流將所述血管栓塞，直至觀察到血流停止?？梢酝ㄟ^重復(fù)所述血管造影術(shù)驗證閉塞。在使用直接注射的實施方案中，隨后用所需劑量的本發(fā)明藥物組合物輸注入所述血管。
通常，栓塞治療導(dǎo)致含抑制劑的組合物的分布遍及被治療腫瘤或血管腫塊的空隙。堵塞動脈管腔的拴塞顆粒的物理體積導(dǎo)致血液供給的阻斷。除這些效果之外，抗血管生成因子的存在能夠防止供養(yǎng)腫瘤或血管腫塊的新生血管的形成，增強切斷血液供給的促老(devitalizing)作用。直接的動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)給藥通常也能導(dǎo)致含抑制劑的組合物的分布遍及被治療腫瘤或血管腫塊的空隙。但是，通常不提倡使用該方法阻斷血液供給。
本發(fā)明一個方面，肝或其它組織的原發(fā)和繼發(fā)腫瘤可以使用栓塞或直接動脈內(nèi)或靜脈內(nèi)注射療法來治療。簡而言之，插入導(dǎo)管使其經(jīng)由股動脈或肱動脈進入肝動脈，所述過程通過在熒光導(dǎo)引下將導(dǎo)管引入動脈系統(tǒng)來實施。所述導(dǎo)管前盡可能進入肝動脈樹深處，以便將供給腫瘤的血管完全堵塞，而且為正常組織提供盡可能多的動脈分支供給。理想地這是肝動脈的節(jié)段性分支，但是，也可以是肝動脈末梢至胃十二指腸動脈起點的全部，或者甚至根據(jù)腫瘤及其單獨血液供給的程度需要阻斷多個分離的動脈。一旦獲得目的導(dǎo)管位置，那么就通過動脈插管注射組合物(如上所述)栓塞所述動脈直至待阻塞動脈中血流停止，優(yōu)選觀察5分鐘之后仍然如此。所述動脈的堵塞可以通過下述方法驗證通過所述導(dǎo)管注射不透射線的反襯物，然后通過熒光檢查或X射線底片顯示預(yù)先充滿反襯物的血管不再能通過所述反襯物(no longer does so)。在使用直接注射的實施方案中，通過將所需劑量的組合物(如上所述)注入動脈插管來灌注所述動脈?？梢詫γ恳粋€待阻塞供給動脈重復(fù)同樣的操作。
大多數(shù)實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物包括足夠量的待遞送物質(zhì)，所述量足以使得遞送給患者治療有效量的所摻入治療劑或其它物質(zhì)作為部分預(yù)防或治療性治療?；钚曰衔镌谒鲱w粒中的所需濃度取決于所述藥物的吸收、失活和排出速率以及所述化合物的遞送速度。應(yīng)當注意的是劑量值還應(yīng)隨待減輕疾病的嚴重程度而變動。還應(yīng)理解的是，對于任一特定的受試者來說，特異性給藥方案應(yīng)該根據(jù)個體需要和實施或監(jiān)督組合物施用的人士的專業(yè)判斷而隨時調(diào)整。通常，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)確定劑量。選用的劑量取決于多種因素，包括所用的本發(fā)明所述具體化合物或者其酯、鹽或酰胺的活性，施用途徑，施用時間，所使用的具體化合物的排泄或新陳代謝速度，與所用具體化合物聯(lián)合使用的其它藥物、化合物和/或原料，患者的年齡、性別、體重、身體狀況、總體健康及既往病史，以及醫(yī)療領(lǐng)域熟知的類似因素。
劑量基于每公斤患者體重的組合物的量。其它的量已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并且易于測定。可選，可以根據(jù)所述組合物的血漿濃度測定本發(fā)明所述劑量。例如，可以使用最大血漿濃度(Cmax)和從0到無窮大(AUC(0-4))的血漿濃度-時間關(guān)系曲線下面積。本發(fā)明的劑量包括能得出上述Cmax和AUC(0-4)值的劑量以及能得出這些參數(shù)的更大或更小值的其它劑量。
具有本領(lǐng)域普通技術(shù)的醫(yī)生或獸醫(yī)能夠很容易地測定并給出所需要的藥物組合物有效量。例如，所述醫(yī)生或獸醫(yī)開始可以在藥物組合物中使用低于獲得預(yù)期治療效果所需水平的本發(fā)明所述化合物的劑量，然后逐漸增加所述劑量直至達到預(yù)期效果。
通常，本發(fā)明化合物的合適日劑量為該化合物產(chǎn)生療效的最小有效劑量。所述有效劑量通常取決于上述因素。
能在給定患者中產(chǎn)生最有效治療的任何具體化合物的準確施用時間及用量取決于具體化合物的活性、藥物動力學(xué)和生物利用率，患者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病的類型及階段、總的健康狀況、對給定劑量及劑型藥物的反應(yīng))，施用途徑等。本申請給出的指導(dǎo)原則可用于優(yōu)化治療，例如確定最適的給藥時機和/或量，只需要常規(guī)試驗包括監(jiān)測所述受試者并調(diào)整所述劑量和/或時機即可。
當對患者進行治療時，可以在24-小時時段內(nèi)通過在預(yù)定時間測量一個或多個相關(guān)指數(shù)，監(jiān)測該患者的健康狀況。治療包括給藥的添加物(supplement)、量、時機和制劑，可以根據(jù)監(jiān)測結(jié)果進行優(yōu)化?？梢灾芷谛缘貙λ龌颊哌M行再評估，通過測量相同參數(shù)測定改善程度，首次的所述再評估通常在治療開始起4周末進行，隨后在治療期內(nèi)每4-8周進行再評估，此后為每3個月評估。治療可以持續(xù)數(shù)月乃至數(shù)年，對于人而言治療期長短通常為至少1個月?？梢愿鶕?jù)這些再評估，對所用藥量以及在可能情況下對施用時機進行調(diào)整。
治療可以從小于所述化合物最佳量的較小劑量開始。此后，通過小量增加來提高劑量直至達到最佳療效。
知曉這一點有助于腫瘤學(xué)家判定哪些藥物可以在一起很好發(fā)揮作用，以及如果使用一種以上藥物時，每一藥物給藥的確切計劃(其中包括用藥的先后順序及頻率)。
數(shù)種本發(fā)明化合物的聯(lián)用，或者可選，與其它化療劑的聯(lián)用，可以減少任一單一組分的所需劑量，這是因為不同成分的顯效起始時間及持續(xù)時間可以互補。在所述的聯(lián)合治療中，不同的活性藥劑可以一起或分別遞送，并且可以同時或在一天中的不同時間點遞送。本發(fā)明化合物毒性及療效可以通過細胞培養(yǎng)或?qū)嶒瀯游镏械某Ｒ?guī)藥物學(xué)方法測定，例如，測定LD50和ED50。優(yōu)選那些顯現(xiàn)出較大治療指數(shù)的組合物。盡管可以使用有毒副作用的化合物，但是為了減少副作用，應(yīng)該小心設(shè)計將所述化合物靶向目標位點的遞送系統(tǒng)。
細胞培養(yǎng)試驗和動物研究中得到的數(shù)據(jù)可以用于配制人用的各種劑量。任一添加劑的劑量，或者可選，其中任一成分的劑量，優(yōu)選位于循環(huán)濃度的范圍內(nèi)，包括幾乎或根本無毒性的ED50。落在該范圍內(nèi)的劑量取決于采用的劑型和采用的施用途徑。對于本發(fā)明的藥劑而言，可以首先從細胞培養(yǎng)試驗測定治療有效劑量?？梢杂嬎愠鰟游锬Ｐ椭械膭┝恳垣@得循環(huán)血漿濃度范圍，其中包括細胞培養(yǎng)測定中的IC50(即，能實現(xiàn)對癥狀的半數(shù)-最大抑制的測試化合物的濃度)。這些信息可以用于更加精確地測定人用劑量。血漿中的水平可以，例如，通過高效液相層析法測定。
試劑盒本發(fā)明提供了用于治療各種癌癥的試劑盒。例如，試劑盒可以包括一種或多種上述藥物組合物以及任選地還包括其使用說明書。其它另外的實施方案中，本發(fā)明提供的試劑盒中含有一種或多種藥物組合物以及一種或多種用于完成所述組合物給藥的裝置。例如，本發(fā)明的試劑盒可以包括藥物組合物和用于完成將所述組合物直接經(jīng)動脈內(nèi)注射入癌性腫瘤的導(dǎo)管。其它實施方案中，本發(fā)明的試劑盒可以包括預(yù)充滿LT-β-R激動劑和化療劑的安瓿，所述物質(zhì)任選地配制為藥物或凍干的，以便利用遞送裝置來施用。
實施例本發(fā)明通過下列實施例作進一步說明，這些實施例無論如何都不應(yīng)被理解為是對本發(fā)明的限制。
材料與方法WiDr小鼠模型為了研究化療劑與huCBE11聯(lián)合用藥的效果，使用了WiDr異種移植模型?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)CBE11對作為嚴重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠中的異種移植物生長的WiDr腫瘤的抗腫瘤活性(BRowning et al.(1996)J.Exp.Med.183867)。將治療劑，即LTβR激動劑和化療劑，施用給已經(jīng)植入WiDr腫瘤細胞的無胸腺裸鼠。根據(jù)WiDr異種移植的人結(jié)腸直腸腫瘤的生長，對抗腫瘤活性包括所述聯(lián)合治療的協(xié)同或加強效果進行了研究，其中在已有的、預(yù)先形成的腫瘤塊上開始進行治療。
WiDr細胞獲自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)(Manassas，VA)。將細胞體外培養(yǎng)于加有2mM L-谷氨酰胺的90％Eagle’s極限必需培養(yǎng)基和經(jīng)調(diào)整含有下列物質(zhì)的Earle’s平衡鹽液(BSS)1.5g/L碳酸氫鈉、0.1mM非必需氨基酸，和1mM丙酮酸鈉，外加10％胎牛血清(FBS)，無抗生素(5％CO2)。為了確保植入后24和48小時所有培養(yǎng)物都無細菌污染，對植入小鼠的腫瘤勻漿制劑取等分量進行細菌培養(yǎng)。
在第0天，將200μL無血清RPMI 1640中的2×106WiDr細胞接種物經(jīng)皮下植入右脅腹部位。從第3天開始每周兩次記錄腫瘤重量和體重的測量結(jié)果，對于包括Camptosar的試驗在第4天開始記錄所述重量。當測得的腫瘤長寬都約為5mm時，將小鼠隨機分為治療組和對照組。從第0天開始每周兩次記錄體重的測量結(jié)果。
KM-20L2小鼠模型為了研究化療劑與huCBE11聯(lián)合用藥的效果，使用了KM-20L2異種移植模型。將治療劑，即LTβR激動劑和化療劑，施用給已經(jīng)植入WiDr腫瘤細胞的無胸腺裸鼠。根據(jù)WiDr異種移植的人結(jié)腸直腸腫瘤的生長，對抗腫瘤活性包括聯(lián)合治療的任何協(xié)同或加強效果進行了研究，其中在已有的、預(yù)先形成的腫瘤塊上起始治療。
KM-20L2獲自NCI腫瘤貯藏所(repository)。將細胞培養(yǎng)于無抗生素的含10％胎牛血清的90％RPMI-1640。為了確保植入后24和48小時所有培養(yǎng)物都無細菌污染，對植入小鼠的腫瘤細胞勻漿制劑取等分量進行細菌培養(yǎng)。
在第0天，將無血清培養(yǎng)基中的2×106或3×106KM-20L2細胞接種物皮下植入小鼠右脅腹部位。定期記錄腫瘤大小的測量結(jié)果。當測得的腫瘤長寬都約為5mm(65毫克)時，將小鼠隨機分為治療組和對照組。
腫瘤測量使用游標卡尺測量腫瘤。依照研究定期記錄腫瘤大小的測量結(jié)果，直至所述研究結(jié)束。根據(jù)2維腫瘤測量數(shù)值，利用長橢球體積計算公式計算腫瘤體積(mm3)腫瘤體積(mm3)＝(長×寬2[L×W2])÷2。假定單位密度，將體積換算為重量(即，1mm3＝1mg)。腫瘤生長抑制用％T/C評定，其中T為治療組的平均腫瘤重量，C為對照組的平均腫瘤重量。就這種類型的試驗而言，％T/C值為42％或更小，就可以認為具有國立癌癥研究院(USA)規(guī)定的有意義活性。據(jù)此犧牲動物。
統(tǒng)計學(xué)分析根據(jù)標準統(tǒng)計方法，對腫瘤重量測量值進行統(tǒng)計學(xué)分析。在所有評估試驗中，測定所有劑量組的體重和腫瘤重量的平均值、標準差(SD)和平均值的標準誤(SEM)。對每次評估包括每一試驗的終了的平均腫瘤重量進行Student′s t檢驗，測定在每個治療組與載體對照組之間以及每一聯(lián)合用藥治療組與單獨施用huCBE11的組之間是否存在任何統(tǒng)計學(xué)上的顯著差異。
進行分析，確定在用huCBE11與化療劑聯(lián)合治療過程中是否產(chǎn)生了協(xié)同的或加強的抗腫瘤活性。如果單用化療劑治療荷WiDr腫瘤小鼠產(chǎn)生了劑量-反應(yīng)型抗腫瘤效力，那么huCBE11加化療劑聯(lián)合用藥的協(xié)同作用可以通過計算聯(lián)用指數(shù)來評估(Chou and Talalay(1984)Adv.Enz.Regu.2227)。此外，還可以通過下述方法評估加強作用測定與單獨治療產(chǎn)生的效果之和相比，聯(lián)合治療產(chǎn)生的效果是否為統(tǒng)計學(xué)上顯著的超-相加。
通過比較每一治療組的腫瘤體積與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。平均的腫瘤體積縮小可以計算為對照組和試驗組之間平均腫瘤體積的差。腫瘤體積的被抑制分值(fraction inhibition)，即，受影響分值(Fa)，可以通過用試驗組平均數(shù)腫瘤體積縮小除以對照組平均腫瘤體積計算得出。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。據(jù)此作進一步的統(tǒng)計學(xué)分析。
協(xié)同作用分析CI表示的協(xié)同作用或拮抗作用程度的總體解釋，其描述見下表3。
表3用于描述協(xié)同作用或拮抗作用的符號的解釋

實施例1LTβR激動劑與烷基化化療劑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效力huCBE11與順氯氨鉑聯(lián)用的抗腫瘤效力為了測定烷基化化療劑例如順氯氨鉑與huCBE11聯(lián)合用藥是否具有超-相加的抗腫瘤活性，例如，協(xié)同的或加強的活性，將順氯氨鉑與huCBE11聯(lián)合施用給WiDr異種移植模型。
進行劑量范圍試驗，測定出適于研究順氯氨鉑與huCBE11的抗腫瘤效力的順氯氨鉑和huCBE11的劑量。另外，劑量試驗還檢測了每一藥劑單獨施用時抑制腫瘤生長的抗腫瘤效力。用鹽水(對照)、huCBE11(50μg或500μg)或順氯氨鉑(劑量為0.25mg/kg-2mg/kg)對荷有既定WiDr腫瘤的無胸腺裸鼠進行處理(鹽水對照組n＝30；試驗組n＝10每一劑量)。第3天時測定腫瘤大小，此后定期進行直至分期日(staging day)。
在第50天時，生長于2mg/kg、1mg/kg和0.25mg/kg順氯氨鉑劑量組中的腫瘤生長與鹽水對照組差別不顯著。認為，根據(jù)NCI活性標準(％T/C為42或更小)，2mg/kg-0.25mg/kg的順氯氨鉑對WiDr模型無活性。第50天時，只在0.5mg/kg(p＜0.05)這一劑量，順氯氨鉑對生長于裸鼠的WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤產(chǎn)生顯著抑制。平行試驗中測得，第44天時，在500μg(P＜0.001)和50μg(P＜0.01)的劑量，huCBE11產(chǎn)生了對腫瘤生長的顯著抑制。單用順氯氨鉑治療沒有產(chǎn)生劑量-反應(yīng)型的抗腫瘤效力，因此，順氯氨鉑加huCBE11聯(lián)合用藥的協(xié)同作用不能評估。
為了測定順氯氨鉑與huCBE11聯(lián)合用藥是否能使腫瘤生長抑制作用顯著升高，按照上述方法對荷有既定WiDr腫瘤細胞的無胸腺裸鼠進行聯(lián)合用藥試驗。該試驗比較了huCBE11(50和500μg)與順氯氨鉑(1和2mg/kg)的各種聯(lián)用的效果來測定藥效，協(xié)同作用以及強化作用。對順氯氨鉑(1和2mg/kg)與huCBE11(50和500μg)的四種不同劑量組合進行了評估。
聯(lián)合用藥試驗結(jié)果(如表4-6以及圖4和6所示)表明huCBE11與順氯氨鉑聯(lián)用能顯著縮小所處理小鼠內(nèi)的腫瘤體積。所有的腫瘤數(shù)據(jù)都是在第44天采集的。通過比較每一治療組與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。表4顯示了huCBE11和順氯氨鉑單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。
表4量效關(guān)系

與單獨施用500μg huCBE11相比，500μg huCBE11與2mg/kg順氯氨鉑1mg/kg順氯氨鉑聯(lián)合用藥產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)意義上顯著(分別為P＜0.01和P＜0.05)較小的WiDr腫瘤重量。50μg huCBE11與2mg/kg順氯氨鉑或1mg/kg順氯氨鉑聯(lián)合用藥也產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)意義上顯著(分別為P＜0.001和P＜0.01)較小的WiDr腫瘤重量。第44天時，huCBE11 500μg加順氯氨鉑2mg/kg(P＜0.01)(圖1)或huCBE11 500μg加順氯氨鉑1mg/kg)(P＜0.05)聯(lián)合治療后，腫瘤重量與單獨施用500μg huCBE11時相比顯著減小。此外，huCBE11 50μg加順氯氨鉑2mg/kg(P＜0.001)或huCBE11 50μg加順氯氨鉑1mg/kg(P＜0.01)聯(lián)合治療后，腫瘤重量與單獨施用50μg huCBE11時相比顯著減小。
根據(jù)NCI活性標準，huCBE11加順氯氨鉑聯(lián)合用藥的所有受試劑量組合都被認為在WiDr模型中都具有活性(％T/C 42或更小)。對于huCBE11500μg加順氯氨鉑2mg/kg的劑量組合，第24天(38.4％)至44天(19.4％)當中，％T/C＜42％。對于huCBE11 500μg加順氯氨鉑1mg/kg的劑量組合，第30天(37.3％)-44天(29.0％)當中，％T/C＜42％(圖2)。對于huCBE1150μg加順氯氨鉑2mg/kg的劑量組合，第27天(40.5％)-44天(25.0％)當中，％T/C＜42％(圖3)。對于huCBE11 50μg加順氯氨鉑1mg/kg的劑量組合，第34天(40.0％)-44天(34.6％)當中，％T/C＜42％。
使用獲自這些試驗的腫瘤重量數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)比較測定huCBE11加順氯氨鉑的聯(lián)合用藥是否產(chǎn)生加強作用。使用第44天的個體腫瘤體積(表5)計算每只動物的腫瘤體積的被抑制分值(即，F(xiàn)a)(表6)。對統(tǒng)計學(xué)顯著的加強作用的檢驗需要計算每只動物的Fa。使用個體腫瘤體積(表5)計算每只動物的腫瘤體積的被抑制分值(即，F(xiàn)a)(表6)。如表4所示，F(xiàn)a用下列公式計算(對照組平均腫瘤體積-個體動物腫瘤體積)÷對照組平均腫瘤體積。聯(lián)合用藥的預(yù)期相加Fa是單獨接受所述聯(lián)用藥物之一(huCBE11或順氯氨鉑)的各個組的平均Fa之和。另外，如果治療是簡單相加，也計算了聯(lián)合治療的實際療效與預(yù)期療效之間的差(表6)。使用雙尾單樣本t-檢驗測定所述聯(lián)合治療是否產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于預(yù)期相加值的平均Fa(表6)。與預(yù)期相加的抗腫瘤效力相比，本試驗中采用的所有使用huCBE11加順氯氨鉑的聯(lián)合治療方案都以統(tǒng)計學(xué)上顯著的方式加強了抗腫瘤效力。
表5第44天時的個體腫瘤體積

表6個體的腫瘤體積被抑制分值

huCBE11/順氯氨鉑試驗中使用的所有組合對腫瘤體積都產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)顯著的超-相加抑制(表6)。當與50μg或500μg劑量的huCBE11聯(lián)用時，1和2mg/kg劑量的順氯氨鉑能產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的超-相加效果。這些聯(lián)合顯著地加強了huCBE11的抗腫瘤效力?？傊?，與huCBE11和順氯氨鉑的單獨施用相比，LTβ受體-活化型mAb huCBE11與化療劑順氯氨鉑對皮下植入了WiDr人結(jié)腸直腸腺癌的無胸腺裸鼠中的聯(lián)合治療表現(xiàn)出顯著改善的結(jié)果，即表現(xiàn)出了加強作用。
實施例2LTβR激動劑與蒽環(huán)類抗生素類似物化療劑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效力huCBE11與阿霉素聯(lián)用的抗腫瘤效力為了測定蒽環(huán)類抗生素類似物化療劑例如阿霉素與huCBE11聯(lián)合用藥是否具有超-相加的抗腫瘤活性，例如，協(xié)同的或加強的抗腫瘤活性，將阿霉素與huCBE11聯(lián)合施用給WiDr異種移植腫瘤模型。
首先進行劑量范圍試驗，測定出適于研究阿霉素與huCBE11聯(lián)合用藥抗腫瘤效力的阿霉素與huCBE11的劑量，并且測定出每一藥物單獨施用的單獨效果。將從1mg/kg至6mg/kg遞增劑量的阿霉素通過腹膜內(nèi)注射施用給經(jīng)皮下植入了WiDr腫瘤細胞的無胸腺裸鼠(第0天)。所有測試劑量的阿霉素作為化療劑對WiDr模型都無活性，根據(jù)國立癌癥研究院(NCI)的活性標準(試驗組(test)/對照組(control)百分比[％T/C]等于或低于42)。第42天(試驗結(jié)束)時，阿霉素組與載體對照組之間無顯著差異。在單獨的試驗中，第35天(評估日)時，6mg/kg或4mg/kg的阿霉素也未產(chǎn)生對腫瘤生長的顯著抑制。因此，阿霉素不能產(chǎn)生對WiDr腫瘤的顯著抑制，并且阿霉素組和鹽水對照組組之間無顯著差異。
平行試驗中發(fā)現(xiàn)，第42天時500μg、100μg和50μg劑量的huCBE11抑制腫瘤生長，并且根據(jù)NCI活性標準確定其作為化療劑在WiDr模型中是有活性的。試驗結(jié)束(第42天)時，所有huCBE11抗體試驗組的WiDr腫瘤重量都統(tǒng)計學(xué)上顯著地小于載體對照組。觀察發(fā)現(xiàn)huCBE11 500μg和100μg組在第32-42天期間的％T/C＜42％(因此，滿足NCI活性標準)。
根據(jù)NCI活性標準(％T/C等于或低于42)，經(jīng)測定huCBE11加阿霉素聯(lián)合用藥的所有受試劑量組合在WiDr模型中都具有活性。huCBE11 100μg/注射或500μg/注射與阿霉素6mg/kg(P＜0.001)以及huCBE11 50μg/注射與阿霉素6mg/kg或4mg/kg(p＜0.05)聯(lián)合用藥組與單獨施用huCBE11的對應(yīng)組相比，具有統(tǒng)計學(xué)上顯著較小的腫瘤重量。在所有聯(lián)合劑量組中，從第18、21、或32天至第42天期間，％T/C小于42％，hCBE11 100μg加阿霉素6mg/kg的組中，第42天時％T/C小于8.4％。觀察發(fā)現(xiàn)，在試驗結(jié)束即第42天時，huCBE11 500μg或100μg加阿霉素6mg/kg聯(lián)合用藥組的腫瘤重量在統(tǒng)計學(xué)上顯著低于單獨施用huCBE11的對應(yīng)組(圖5和圖7)。
阿霉素和huCBE11的活性試驗后，進行試驗以更好地表征給予聯(lián)合治療的觀察效果。使用WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤生長模型，向異種移植了WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤的無胸腺裸鼠單獨施用50、100或500μg huCBE11或者聯(lián)合施用4或6mg/kg阿霉素。通過比較每一治療組的腫瘤體積與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。所述平均數(shù)腫瘤體積縮小計算為對照組和試驗組之間平均腫瘤體積的差。腫瘤體積的被抑制分值，即，受影響分值(Fa)，可以通過用治療組平均數(shù)腫瘤體積縮小除以對照組平均數(shù)腫瘤體積計算得出。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。表7顯示了單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。
表7huCBE11與阿霉素聯(lián)合用藥試驗組的量效關(guān)系

單用阿霉素治療荷WiDr腫瘤小鼠沒有產(chǎn)生劑量-反應(yīng)的抗腫瘤效力；因此huCBE11+阿霉素聯(lián)合用藥的協(xié)同作用不能通過計算聯(lián)用指數(shù)來評估(Chou and Talalay(1984)Adv.Enz.Regul.2227)。
通過下述方法對聯(lián)合治療的加強作用進行評估測定與單獨治療產(chǎn)生的效力之和相比，huCBE11/阿霉素聯(lián)合治療產(chǎn)生的效力是否為統(tǒng)計學(xué)上顯著的超-相加。統(tǒng)計學(xué)顯著加強作用的檢驗需要計算每只動物的Fa。在第35天時，使用個體腫瘤體積(表8)計算每只動物腫瘤體積的被抑制分值(Fa)(表9)。如上面的表7所示，F(xiàn)a用下列公式計算(對照組平均腫瘤體積-個體動物腫瘤體積)÷對照組平均腫瘤體積。聯(lián)合用藥的預(yù)期相加Fa是單獨接受所述聯(lián)合用藥中的藥物之一(huCBE11或阿霉素)的各組的平均Fa之和。另外，如果治療是簡單相加，也計算了聯(lián)合治療的實際療效與預(yù)期療效之間的差(表9)。使用雙尾單樣本t-檢驗測定所述聯(lián)合治療是否產(chǎn)生了在統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于預(yù)期相加值的平均Fa(表9)。
表8第35天時用于計算被抑制分值的個體及平均腫瘤體積

表9腫瘤體積的被抑制分值

如表9所示，使用雙尾單樣本t-檢驗證實了大量huCBE11阿霉素聯(lián)合治療相對于huCBE11抗體單獨用藥的超-相加效果。與50μg劑量huCBE11聯(lián)用時，4和6mg/kg劑量的阿霉素都產(chǎn)生了超-相加效果(分別為p＜0.0001和P＝0.0013)。與100μg或500μg劑量huCBE11聯(lián)用時，6mg/kg的阿霉素產(chǎn)生了超-相加效果(P＜0.0001)。由此可以看出這些聯(lián)合用藥顯著地加強了huCBE11的抗腫瘤效力。
與預(yù)期相加的抗腫瘤效力相比，本試驗中采用的大多數(shù)使用huCBE11加阿霉素的聯(lián)合治療方案都統(tǒng)計學(xué)顯著地加強了抗腫瘤效力。總之，與huCBE11及阿霉素的單獨施用相比，LTβ受體-活化型mAb huCBE11與化療劑阿霉素對皮下植入了WiDr人結(jié)腸直腸腺癌的無胸腺裸鼠聯(lián)合治療表現(xiàn)出顯著改善的結(jié)果。這些聯(lián)合用藥顯著地加強了huCBE11的抗腫瘤效力。
實施例3LTβR激動劑與拓撲異構(gòu)酶I化療劑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效力A.WiDr異種移植模型中huCBE11/Camptosar聯(lián)合治療的抗腫瘤效力為了測定拓撲異構(gòu)酶I化療劑例如Camptosar(又稱伊立替康)與huCBE11聯(lián)合用藥是否具有超-相加的抗腫瘤活性，例如，協(xié)同的或加強的抗腫瘤活性，將Camptosar與huCBE11聯(lián)合施用給WiDr鼠模型檢測癌癥治療。
進行劑量范圍試驗(dose ranging study)，測定合適的Camptosar及huCBE11劑量，并測定每一藥物單獨施用的單獨活性。將從1.8mg/kg至10mg/kg遞增劑量的Camptosar施用給經(jīng)皮下植入WiDr腫瘤細胞的無胸腺裸鼠(第0天)。與載體對照組相比，第43天時10mg/kg(P＜0.001)、6mg/kg(P＜0.01)和3mg/kg(P＜0.05)的Camptosar對WiDr腫瘤生長產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上顯著的抑制。除Camptosar 10mg/kg組第24天-31天期間的％T/C降至41％外，所有劑量組中所有其它評估的％T/C都＞45％。劑量試驗結(jié)果表明按照國立癌癥研究院的活性標準(NCI；測試組/對照組百分比[％T/C]為等于或小于42組成活性)，Camptosar在WiDr模型中無活性。
平行試驗中發(fā)現(xiàn)，第43天時500μg(P＜0.001)、50μg(P＜0.001)和5μg(P＜0.05)劑量的huCBE11抑制腫瘤生長。huCBE11 500μg和50μg組在第35或38天至第42天期間的％T/C＜42％。與載體對照組相比，在500μg(P＜0.001)，50μg(P＜0.001)和5μg(P＜0.05)，以及10mg/kg(P＜0.01)和6mg/kg(P＜0.05)在試驗結(jié)束時及3mg/kg(P＜0.05)的劑量情況下，huCBE11產(chǎn)生了對統(tǒng)計學(xué)上顯著的腫瘤生長抑制。在hCBE11 500μg和50μg組中，第35/38天至第42天期間％T/C＜42％。這一結(jié)果表明按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，huCBE11在WiDr模型中有活性。
另外還對huCBE11與Camptosar聯(lián)合用藥的活性進行了分析。第42天時，huCBE11 50μg與10mg/kg Camptosar聯(lián)合用藥治療后腫瘤的重量顯著小于單用huCBE11 50μg治療后的腫瘤重量(P＜0.001)(參見圖1)。此外，huCBE11 50μg加Camptosar 6mg/kg(P＜0.01)以及huCBE11 50μg加Camptosar3mg/kg(P＜0.05)聯(lián)合用藥組的平均腫瘤重量與單獨施用huCBE1150μg組的平均腫瘤重量之間有顯著差異。在huCBE11 50μg加Camptosar10mg/kg組中，％T/C在第17天時降至42％以下，第42天時為6.2％。此外，hCBE11 50μg加Camptosar 6mg/kg組第17-42天以及huCBE11 50μg加Camptosar 3mg/kg組第24-42天，％T/C＜42％。
第42天時，huCBE11 18μg加Camptosar 10mg/kg、huCBE11 10.5μg加Camptosar 6mg/kg或huCBE11 5.4μg加Camptosar3mg/kg聯(lián)合治療組與單獨施用相應(yīng)劑量Camptosar的組之間，平均腫瘤重量無統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。只有huCBE11 18μg加Camptosar 10mg/kg組(第21-42天)的％T/C＜42％。
總之，可以確定的是按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，huCBE11與Camptosar聯(lián)合用藥在WiDr模型中有活性。經(jīng)下列的huCBE11與化療劑聯(lián)用組合治療后，預(yù)先-建立的WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤的重量統(tǒng)計學(xué)顯著地小于單用huCBE11治療后的腫瘤重量(1)50μg huCBE11加10mg/kg Camptosar與單用50μg hCBE11相比(P＜0.001)，第17-42天時的％T.C＜42％(最小為6.2％)；(2)50μg huCBE11加6mg/kg Camptosar與單用50μg hCBE11相比(P＜0.01)，第17-42天時的％T.C＜42％；以及(3)50μg huCBE11加3mg/kg Camptosar與單用50μg hCBE11相比(P＜0.05)，第24-42天時的％T.C＜42％。
進行超-相加試驗，測定huCBE11與Camptosar是否能對植入WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤生長模型的無胸腺裸鼠發(fā)揮協(xié)同作用。選擇10mg/kg、6mg/kg或3mg/kg劑量的Camptosar進行這些huCBE 11/Camptosar聯(lián)合用藥試驗。第21天時得到用于計算Fa值的全部腫瘤數(shù)據(jù)。通過比較每一治療組的腫瘤體積與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。所述平均數(shù)腫瘤體積縮小計算為對照組和試驗組之間平均腫瘤體積的差。腫瘤體積的被抑制分值，即受影響分值(Fa)，是用試驗組平均數(shù)腫瘤體積縮小除以對照組平均數(shù)腫瘤體積計算得出的。Fa為1.000表明腫瘤被完全抑制。表10顯示了單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。然后，用得到的Fa值評估huCBE11與Camptosar聯(lián)合治療的協(xié)同及加強效果。
表10huCBE11與Camptosar聯(lián)合治療的量效關(guān)系

本試驗中用于評估藥物加強作用的那些數(shù)據(jù)不限于固定比例的組合。對統(tǒng)計學(xué)顯著的加強作用的檢驗需要計算每只動物的Fa。使用個體腫瘤體積(表41)計算每只動物的腫瘤體積的被抑制分值(Fa)(表42)。用下列公式計算出Fa(對照組平均腫瘤體積-個體動物腫瘤體積)÷對照組平均腫瘤體積。聯(lián)合用藥的預(yù)期相加Fa是單獨接受所述聯(lián)合用藥中的藥物之一的各組的平均Fa相加得出的。如果治療是簡單相加，也計算了聯(lián)合治療的實際療效與預(yù)期療效之間的差(表42)。使用雙尾單樣本t-檢驗測定所述聯(lián)合治療是否產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于預(yù)期相加值的平均Fa(表42)。
表41個體腫瘤體積

表42個體的腫瘤體積被抑制分值

單用Camptosar治療荷WiDr腫瘤小鼠產(chǎn)生了劑量-反應(yīng)型的抗腫瘤效力，因此huCBE11+Camptosar聯(lián)合用藥的協(xié)同作用不能通過計算聯(lián)用指數(shù)(CI)來正式評估。用于評估協(xié)同性藥物作用的那些數(shù)據(jù)是在Camptosar∶huCBE11為0.555μg∶1mg/kg的固定比例情況下得到的。這一比例是以上述試驗中測得的兩種藥劑中值效果劑量(median efiect dose)之比為基礎(chǔ)的。協(xié)同作用的正式評估采用對聯(lián)用指數(shù)(CI)進行計算，使用CalcuSyn V1.1(Biosoft CamβRidge，UK)軟件，該軟件可用于基于windows的劑量-效果分析。如上所述，聯(lián)合用藥治療時，CI＝1代表相加的藥效。CI＜1代表協(xié)同作用。CI＞1代表拮抗作用。CI計算中使用的量效關(guān)系(Fa值)列于表11。
表11用于WiDr異種移植模型中Camptosar-huCBE11協(xié)同作用計算的量效關(guān)系


根據(jù)計算得到的Camptosar與huCBE11的CI值，可以確定Camptosar/huCBE11的固定-比例聯(lián)合治療(0.555mg/kg∶1μg)顯示出協(xié)同的抗腫瘤效力。分別及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)關(guān)系的藥效(Potency)和形狀分別顯示于表12和13。對本發(fā)明試驗使用的具體水平試驗劑量計算得出的CI顯示于表14。因為本發(fā)明試驗使用了被認為具有完全獨立模式作用的藥物，所以使用了非各自獨有的(mutually nonexclusive)的CI值。使用3mg/kgCamptosar+5.4μg huCBE11、6mg/kg Camptosar+10.5μg huCBE11以及10mg/kg Camptosar+18μg huCBE11的聯(lián)合用藥表現(xiàn)出了協(xié)同效果。聯(lián)合用藥劑量水平范圍內(nèi)的CI模擬(Simulations)顯示于表15。從3.3mg/kgCamptosar+6μg huCBE11(腫瘤體積35％被抑制)至313mg/kg Camptosar+563μg huCBE11(腫瘤體積99％被抑制)范圍內(nèi)聯(lián)合用藥劑量表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)。CI表示的協(xié)同或拮抗作用程度的總體解釋見表3。作為受影響分值函數(shù)的CI顯示于圖8?？傊?shù)?1天評估時，使用Camptosar加huCBE11固定-比例(0.555∶1)的聯(lián)合用藥治療表現(xiàn)出了針對預(yù)先建立的WiDr人結(jié)腸直腸腺癌異種移植物的協(xié)同抗腫瘤效力。
表12中值效果劑量

表13量-效曲線特征


表14試驗值的計算的聯(lián)用指數(shù)(CIs)

++ 中等協(xié)同作用+++ 協(xié)同作用表15聯(lián)合指數(shù)(CI)模擬


總之，與huCBE11及Camptosar的單獨施用相比，LTβ受體-活化型mAbhuCBE11與化療劑Camptosar對皮下植入了WiDr人結(jié)腸直腸腺癌的無胸腺裸鼠的聯(lián)合治療表現(xiàn)出顯著改善的結(jié)果。令人驚奇的是，huCBE11與Camptosar以固定比例(0.555mg/kg Camptosar∶1g huCBE11)聯(lián)合治療的效果通過聯(lián)用指數(shù)分析被認為是協(xié)同性的。
B.KM-20L2異種移植模型中huCBE11/Camptosar聯(lián)合治療的抗腫瘤效力此外，還使用了其它的人結(jié)腸直腸腺癌小鼠模型系統(tǒng)KM-20L2模型來測定，同Camptosar與huCBE11聯(lián)合用藥相比時，拓撲異構(gòu)酶I化療劑例如Camptosar與huCBE11聯(lián)合用藥是否具有超-相加的抗腫瘤活性，例如加強的或協(xié)同的抗腫瘤活性。
進行劑量范圍試驗，測定出適于研究順氯氨鉑與huCBE11聯(lián)用抗腫瘤效力的順氯氨鉑和huCBE11的劑量。將從1.8mg/kg至10mg/kg遞增劑量的Camptosar施用給經(jīng)皮下植入了KM-20L2腫瘤細胞的無胸腺裸鼠(第0天)。在第33天(試驗結(jié)束)時，10mg/kg(P＜0.001)和6mg/kg(P＜0.01)和3mg/kg(P＜0.05)劑量的Camptosar治療產(chǎn)生了對KM-20L2腫瘤生長的統(tǒng)計學(xué)顯著的抑制。第11-14天期間首次觀察到抑制。10mg/kg組的％T/C在第18-33天期間等于或小于42％，因此滿足NCI活性標準。在單獨用藥試驗中，與鹽水對照組相比，Camptosar組在第55天結(jié)束時未見顯著的腫瘤抑制，而6mg/kg組在第13-51天期間(P＜0.001第13-44天；P＜0.01第48天；P＜0.05第51天)，3mg/kg組在第13-48天期間(P＜0.001第13-41天；P＜0.01第44天；P＜0.05第48天)以及1.8mg/kg組在第9-44天期間(P＜0.001第16-27，41天；P＜0.01第13，30-37天；P＜0.05第9、44天)觀察到了顯著的腫瘤抑制。6mg/kg組在第16-30天期間以及3mg/kg組在第20天時，％T/C等于或小于42％。因此，根據(jù)NCI活性國立癌癥研究院(％T/C等于或低于42)，可以確定Camptosar在KM-20L2腫瘤模型中是有活性的。
在評估huCBE11在KM-20L2異種移植模型中抗腫瘤活性的平行劑量試驗中發(fā)現(xiàn)，與載體對照組相比，huCBE11 2mg/kg劑量組(第28和33天時)和4mg/kg劑量組(第21-28天)中的腫瘤生長顯著縮小。在平行的單獨用藥試驗中(其中也測定了聯(lián)合治療的效力)，在下列劑量時huCBE11產(chǎn)生了對腫瘤生長的顯著抑制(1)20mg/kg第16-55天(p＜0.001第20-48天；p＜0.01第16、51、55天)，(2)2mg/kg第16-55天(p＜0.001第16-51天；p＜0.01第55天)，以及(3)0.2mg/kg第20-55天(p＜0.001第27-30、41天；p＜0.01第20-23、34-37、44-48天；p＜0.05第51-55天)。
在兩個試驗過程中huCBE11劑量組的％T/C都＞42％。第二個試驗中最小的％T/C出現(xiàn)在20mg/kg組第27天?？傊?，根據(jù)NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，可以確定huCBE11在KM-20L2腫瘤模型中無活性。在第33天劑量試驗結(jié)束時，與載體對照組相比，2mg/kg huCBE11產(chǎn)生了對腫瘤生長統(tǒng)計學(xué)顯著的抑制。抑制還發(fā)現(xiàn)于4mg/kg組第21-28天以及2mg/kg組第28天。在單獨用藥試驗中發(fā)現(xiàn)，與載體對照組相比，huCBE11 20mg/kg組第16-55天，2mg/kg組第16-55天以及0.2mg/kg組第20-55天都出現(xiàn)了顯著的腫瘤抑制。hCBE11 20mg/kg組第27天時％T/C降至低點42.4％。
另外還對huCBE11與Camptosar聯(lián)用效果進行了測定。與huCBE1120mg/kg單獨施用相比，huCBE11 20mg/kg與Camptosar 3mg/kg聯(lián)合用藥使得腫瘤生長出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著的縮小(p＜0.001第16-41、48天；p＜0.01第13、44-55天)(圖8)。當與huCBE11 2mg/kg聯(lián)合用藥時，3mg/1g(P＜0.001，第16-44天；P＜0.01第48-55天；P＜0.05第13天)或1.8mg/kg(P＜0.001第20天；P＜0.01第23天；P＜0.05，第16、27-37天)劑量的Camptosar與單獨施用huCBE11 2mg/kg相比也出現(xiàn)了顯著較低的平均腫瘤重量。與huCBE110.2mg/kg單獨施用相比，Camptosar 1.8mg/kg與huCBE11 0.2mg/kg聯(lián)用時在13-23天出現(xiàn)了對腫瘤生長統(tǒng)計學(xué)顯著(P＜0.05)抑制。此外，huCBE119.48mg/kg加Camptosar 6mg/kg(P＜0.001)，huCBE11 4.74mg/kg加Camptosar 3mg/kg(P＜0.001)以及huCBE11 2.84mg/kg加Camptosar 1.8mg/kg(P＜0.01)在試驗?zāi)┊a(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)顯著的腫瘤生長抑制。這些huCBE11加Camptosar聯(lián)合用藥組的大多數(shù)在從第16或20天到試驗?zāi)┢?，％T/C小于42％。因此，可以確定按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，huCBE11與Camptosar聯(lián)合用藥在KM-20L2腫瘤模型中有活性。
為了測定huCBE11與Camptosar是否能相互加強或發(fā)生協(xié)同作用，在上述的腫瘤生長模型中，使用植入了KM-20L2人結(jié)腸腺癌的無胸腺裸鼠進行了超-相加試驗。選擇6mg/kg、3mg/kg或1.8mg/kg劑量的Camptosar進行這些huCBE11/Camptosar聯(lián)合用藥試驗。用于計算Fa值的全部腫瘤數(shù)據(jù)是在第9、13、16、20、23、27、30、34、37和41天時得到的。通過比較每一治療組的腫瘤體積與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。所述平均數(shù)腫瘤體積縮小被計算為對照組和試驗組之間平均腫瘤體積的差。腫瘤體積的被抑制分值，受影響分值(Fa)，是用試驗組平均數(shù)腫瘤體積縮小除以對照組平均數(shù)腫瘤體積計算得出的。Fa為1.000表明腫瘤被完全抑制。表15顯示了整個試驗時程中單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。然后，用得到的Fa值評估huCBE11與Camptosar聯(lián)合治療的協(xié)同及加強效果。
表15huCBE11與Camptosar預(yù)期相加相對于實際腫瘤體積抑制

表15huCBE11與Camptosar預(yù)期相加相對于實際腫瘤體積抑制(續(xù)表)

在觀察了huCBE11與Camptosar分別及聯(lián)合用藥的抗腫瘤活性以及計算了Fa值后，然后，檢測huCBE11與Camptosar之間的相互關(guān)系是否為協(xié)同作用。由于單用Camptosar治療荷KM-20L2腫瘤小鼠產(chǎn)生了劑量-反應(yīng)型抗腫瘤效力，所以可以通過計算聯(lián)用指數(shù)(CI)對huCBE11+Camptosar的協(xié)同作用進行正式評估。用于CI計算量的量效關(guān)系見表16，中值效果劑量概括于表17。本發(fā)明試驗中用于評估協(xié)同性藥物作用的那些數(shù)據(jù)是在固定比例1∶0.63(mg/kghuCEB11∶mg/kg Camptosar)情況下得到的。這一比例是以上述試驗中測得的兩種藥劑中值效果劑量之比為基礎(chǔ)的。協(xié)同作用的正式評估采用對聯(lián)用指數(shù)(CI)進行計算，所述計算使用CalcuSyn V1.1(Biosoft CamβRidge，UK)軟件，該軟件可用于基于windows的劑量-效果分析。如上所述，聯(lián)合用藥治療時，CI＝1代表相加的藥效。CI＜1代表協(xié)同作用。CI＞1代表拮抗作用。對于給定的聯(lián)合用藥治療，CI＝1代表相加的效力。CI＜1表示協(xié)同作用。CI＞1表明為拮抗作用。通過Camptosar與huCBE11的聯(lián)用指數(shù)檢驗發(fā)現(xiàn)，以1∶0.63固定比例聯(lián)用治療(mg/kg huCEB11∶mg/kg Camptosar)顯示出協(xié)同的抗腫瘤效力。Camptosar與huCBE11分別及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)關(guān)系的藥效(Potency)和形狀分別顯示于表18和19。對聯(lián)合治療試驗中使用的具體水平試驗劑量計算得出的CI列于表19。
表16huCBE11與Camptosar的用于聯(lián)用指數(shù)計算的量-效關(guān)系(Fa值)

表17huCBE11與Camptosar用于聯(lián)用指數(shù)計算的中值效果劑量(mg/kg)

表18huCBE11與Camptosar(KM-20L2異種移植模型)劑量-反應(yīng)曲線特征

表19huCBE11與Camptosar(Cam)試驗值的聯(lián)用指數(shù)(CI)

+++++極強協(xié)同作用++++強協(xié)同作用+++協(xié)同作用±近乎相加-輕度拮抗作用----強拮抗作用因為本發(fā)明試驗使用了被認為具有完全獨立模式作用的藥物，所以能夠應(yīng)用非各自獨有的的CI值。使用2.84mg/kg+1.8mg/kg Camptosar，4.74mg/kg huCBE11+3mg/kg Camptosar以及9.48mg/kg huCBE11+6mg/kgCamptosar的聯(lián)合用藥劑量在第16-41天表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)(表19)。聯(lián)合用藥劑量水平范圍內(nèi)的CI模擬顯示于表20和21，CI表示的協(xié)同或拮抗作用程度的總體解釋見表3。協(xié)同效應(yīng)遍及整個治療期間。作為腫瘤抑制百分比函數(shù)的CI顯示于圖10。大多數(shù)情況下，協(xié)同作用定位在50％以上水平的腫瘤抑制。聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)峰值出現(xiàn)在第16天。產(chǎn)生20％至80％腫瘤抑制的劑量范圍聯(lián)用了劑量水平為1-100mg/kg的兩種藥物。總之，huCBE11加Camptosar以1∶0.63固定比例聯(lián)合用藥出現(xiàn)了協(xié)同的抗腫瘤效力。
表20聯(lián)用指數(shù)模擬各自獨有的作用方式


表20聯(lián)用指數(shù)模擬各自獨有的作用方式(續(xù)表)

表21huCBE11和Camptosar(Cam)聯(lián)用指數(shù)模擬非各自獨有的(完全獨立)作用方式


表21huCBE11和Camptosar(Cam)聯(lián)用指數(shù)模擬非各自獨有的(完全獨立)作用方式(續(xù)表))

總之，與huCBE11及Camptosar的單獨施用相比，LTβ受體-活化型mAb huCBE11與化療劑Camptosar對皮下植入了KM-20L2人結(jié)腸直腸腺癌的無胸腺裸鼠聯(lián)合治療表現(xiàn)出顯著改善的結(jié)果。令人驚奇的是，huCBE11與Camptosar以1∶0.63固定比例(mg/kg hCEB11∶mg/kg Camptosar)聯(lián)合治療的效果通過聯(lián)用指數(shù)分析是協(xié)同性的。與用同樣化合物對WiDr鼠模型進行聯(lián)合用藥分析得到的結(jié)果類似。
實施例4LTβR激動劑與核苷類似物化療劑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效力A.WiDr異種移植小鼠模型中huCBE11/吉西他濱聯(lián)合治療的抗腫瘤效力為了測定核苷類似物化療劑例如吉西他濱與huCBE11聯(lián)合用藥是否具有超-相加的抗腫瘤活性，例如協(xié)同的抗腫瘤活性，將吉西他濱與huCBE11聯(lián)合施用給WiDr小鼠模型。
進行劑量范圍試驗，測定出適于研究吉西他濱與huCBE11聯(lián)用抗腫瘤效力的吉西他濱劑量。測量了4個吉西他濱組(140、100、50和25mg/kg)和鹽水對照組在整個劑量試驗過程(第0-42天)中的平均腫瘤重量(±平均值的標準誤(SEM))。植入時腫瘤種植率(take rate)＞98％，選擇其大小接近內(nèi)的56只小鼠開始治療試驗。與鹽水對照組相比，吉西他濱140mg/kg(P＝0.001)、100mg/kg(P＝0.0002)、50mg/kg(P＝0.008)和25mg/kg(P＝0.006)組第42天時出現(xiàn)腫瘤生長的顯著抑制。這些劑量組中抑制初次出現(xiàn)于第11-14天。因此，在植入預(yù)先-建立的WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤的無胸腺裸鼠中，所試驗的全部吉西他濱劑量(140、100、50和25mg/kg)都顯著(P≤0.01)抑制了腫瘤生長。
在單獨用藥試驗中，對50、25、12.5和6.25mg/kg吉西他濱的效果進行了測定。植入時腫瘤種植率為100％，選擇大小接近的180只小鼠啟動治療。與鹽水對照組相比，吉西他濱140mg/kg(P＝0.001)、100mg/kg(P＝0.0002)、50mg/kg(P＝0.008)和25mg/kg(P＝0.006)組第41天(試驗結(jié)束)時出現(xiàn)對腫瘤生長的顯著抑制。這些組到第10天時抑制明顯。12.5mg/kg組在第41天時未見顯著抑制。吉西他濱50mg/kg組第17-28天以及吉西他濱25mg/kg組第21-28天，％T/C降至42％以下。除這些時間點外，對單獨施用吉西他濱的反應(yīng)沒有超過國立癌癥研究院(NCI)活性標準(測試組/對照組百分比[％T/C]等于或小于42)，因此可以認定按照NCI指標，第41天(試驗結(jié)束)時受試的全部吉西他濱治療都無活性?？傊?，測定發(fā)現(xiàn)第41天第二個試驗結(jié)束時，按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，50mg/kg-6.25mg/kg劑量的吉西他濱在WiDr模型中無活性。與鹽水對照組相比，吉西他濱50mg/kg(P＜0.001)、25mg/kg(P＜0.001)和6.25mg/kg(P＜0.05)組第41天(試驗結(jié)束)時出現(xiàn)對腫瘤生長的顯著抑制。
在平行實驗中，對huCBE11在WiDr人結(jié)腸直腸腺癌異種移植模型中的活性進行了測定。對施用遞增劑量(5、50和100μg)吉西他濱的3個組以及鹽水對照組的抗腫瘤活性進行了測試。與載體對照組相比，huCBE1150μg和100μg組中在第41天時腫瘤生長(P＜0.001)顯著減小。到第14天時這種減小開始明顯。用huCBE11 5μg治療未顯著抑制腫瘤生長。huCBE11 100μg組第41天時％T/C降至40.0％，50μg組第41天時％T/C降至43.5％。因此，按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，huCBE11100μg在WiDr模型中有活性。
另外，還對huCBE11與吉西他濱在WiDr人結(jié)腸直腸腺癌異種移植模型中的聯(lián)合抗腫瘤效力進行了測定。在第41天時，huCBE11 100μg與吉西他濱25mg/kg(圖2)或12.5mg/kg的聯(lián)用治療與單獨施用huCBE11相比出現(xiàn)了對無胸腺裸鼠中腫瘤生長的顯著抑制。與單獨施用huCBE11相比，huCBE11 50μg與吉西他濱25mg/kg或12.5mg/kg聯(lián)合治療了對腫瘤生長的顯著抑制(分別為P＜0.01和P＜0.05)。在第17天給藥兩劑量huCBE11后以及全部劑量都已經(jīng)施用后，所有組中的抑制都一樣明顯。該效果一直延續(xù)貫穿整個試驗過程。這些huCBE11加吉西他濱聯(lián)合用藥組的％T/C在第17或21-41天全都小于42％。％T/C的最小值出現(xiàn)在第41天(劑量組范圍20.1-26.8％)。
此外，在試驗結(jié)束時，huCBE11加吉西他濱為88μg/50mg/kg(p＜0.05)、44μg/25mg/kg(p＜0.05)、22μg/12.5mg/kg(p＜0.01)、11μg/6.25mg/kg(P＝0.01)的劑量組出現(xiàn)了腫瘤生長的顯著抑制。這種抑制在第14-17天變得明顯。huCBE11 88μg加吉西他濱50mg/kg組(最低點為19.6％)和huCBE11 44μg加吉西他濱25mg/kg組(最低點為24.5％)的％T/C在第14或17-41天降至42％以下。huCBE11 22μg加吉西他濱12.5mg/kg組在28-41天期間的％T/C等于或小于42％(最低點為37.9％)。第41天時huCBE11 11μg加吉西他濱6.25mg/kg組在第41天時的最?。/C為42.6％。除最小劑量組合外，hCBE11加吉西他濱的所有劑量組合在第41天時的％T/C都等于或小于42％(劑量組的范圍20.1％-38.1％)。因此，可以確定的是按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，huCBE11加吉西他濱的聯(lián)合治療在WiDr模型中有活性。
為了測試huCBE11與吉西他濱是否能夠協(xié)同作用，在上述的腫瘤生長模型中，使用植入了WiDr人結(jié)腸腺癌的無胸腺裸鼠進行了超相加試驗。選擇50、25、12.5和6.25mg/kg劑量的吉西他濱以及100、88、50、44、22和11μg劑量的huCBE11，進行這些huCBE11+吉西他濱聯(lián)合用藥試驗。第28天時得到用于計算Fa值的全部腫瘤數(shù)據(jù)。通過比較每一治療組與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。所述腫瘤體積縮小平均值計算為對照組和試驗組腫瘤體積平均值之間的差。腫瘤體積的被抑制分值，即受影響分值(Fa)，是用治療組平均腫瘤體積縮小除以對照組平均腫瘤體積計算得出的。Fa為1.000表明腫瘤被完全抑制。表22顯示了單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。然后，用得到的Fa值評估huCBE11與吉西他濱聯(lián)合治療的協(xié)同效果。
表22吉西他濱與huCBE11單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。

使用獲自這些聯(lián)合治療試驗的腫瘤重量數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)比較來測定huCBE11加吉西他濱聯(lián)合用藥的作用方式是否為協(xié)同性的。由于單用Camptosar治療荷WiDr腫瘤小鼠產(chǎn)生了劑量-反應(yīng)型抗腫瘤效力，所以可以通過計算聯(lián)用指數(shù)(CI)來對huCBE11+Camptosar聯(lián)用的協(xié)同效果進行正式評估(Chou，1984)。協(xié)同作用的正式評估采用對聯(lián)用指數(shù)(C.I.)的計算，所述計算使用CalcuSyn V1.1(Biosoft，CamβRidge，UK)軟件，該軟件可用于基于windows的劑量-效果分析。如上所述，聯(lián)合用藥治療時，C.I.＝1表示相加的藥效。C.I.＜1代表協(xié)同作用。C.I.＞1代表拮抗作用。本發(fā)明試驗中用于評估協(xié)同性藥物作用的那些數(shù)據(jù)是在固定比例0.568∶1(mg/kg吉西他濱∶μg huCBE11)的情況下得到的。這一比例是以先前初步試驗中測得的兩種藥劑中值效果劑量之比為基礎(chǔ)的。協(xié)同作用的正式評估采用對聯(lián)用指數(shù)(CI)進行的計算，所述使用CalcuSyn V1.1(Biosoft CamβRidge，UK)軟件，該軟件可用于基于windows的劑量-效果分析。對于聯(lián)合用藥治療，CI＝1代表相加的藥效。CI＜1表示協(xié)同作用。CI＞1表明為拮抗作用。CI計算中使用的量效關(guān)系見表23。
表23huCBE11與吉西他濱的用于協(xié)同作用計算的量效關(guān)系

吉西他濱與huCBE11分別及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)關(guān)系的藥效(Potency)及形狀分別顯示于表24和25。對該試驗中使用的具體水平試驗劑量計算得出的CI列于表26。
因為本發(fā)明試驗使用了被認為具有完全獨立模式作用的藥物，所以能夠應(yīng)用非各自獨有的CI值。使用6.25mg/kg吉西他濱+11.0μg huCBE11、12.5mg/kg吉西他濱+22.0μg huCBE11、25mg/kg吉西他濱+44μghuCBE11和50mg/kg吉西他濱+88μg huCBE11的聯(lián)合用藥劑量顯示了協(xié)同效果。聯(lián)合用藥劑量水平范圍內(nèi)的CI模擬顯示于表27，CI表示的協(xié)同或拮抗作用程度的總體解釋見表3。從0.005mg/kg吉西他濱+0.008μghuCBE11(腫瘤體積的2％被抑制)至85mg/kg吉西他濱+150μg huCBE11(腫瘤體積的85％被抑制)范圍內(nèi)的聯(lián)合用藥劑量表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)。因此，吉西他濱∶huCBE11以0.568∶1的固定比例聯(lián)合治療顯示出了協(xié)同性的抗腫瘤效力。作為受影響分值函數(shù)的CI顯示于圖11。
表24huCBE11與吉西他濱協(xié)同作用的測定huCBE11與吉西他濱協(xié)同作用的中值效果劑量

表25協(xié)同作用的測定單獨及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)曲線的特征

表26協(xié)同作用的測定對于huCBE11+吉西他濱治療獲得的試驗值所計算的聯(lián)用指數(shù)

表27協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CI)模擬

本發(fā)明試驗中用于評估藥物加強作用的那些數(shù)據(jù)不限于固定比例的組合。統(tǒng)計學(xué)顯著加強作用的檢驗需要計算每只動物的Fa。使用個體腫瘤體積(表43)計算每只動物的腫瘤體積的被抑制分值(Fa)(表44)。用下列公式計算出Fa(對照組平均腫瘤體積-個體動物腫瘤體積)÷對照組平均腫瘤體積。聯(lián)合用藥的預(yù)期相加Fa是單獨接受所述聯(lián)合用藥其中一種藥物各組的平均Fa相加得出的。如果治療是簡單相加，也計算了聯(lián)合治療的實際療效與預(yù)期療效之間的差(表44)。使用雙尾單樣本t-檢驗測定所述聯(lián)合治療是否產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于預(yù)期相加值的平均Fa(表44)。
因為本發(fā)明試驗使用被認為具有完全獨立模式作用的藥物，所以能夠應(yīng)用非各自獨有的C.I.值。使用6.25mg/kg吉西他濱+11μg huCBE11、12.5mg/kg吉西他濱+22μg huCBE11、25mg/kg吉西他濱+44μg huCBE11和50mg/kg吉西他濱+88μg huCBE11的聯(lián)合用藥劑量顯示出協(xié)同效果。從0.005mg/kg吉西他濱+0.008μg huCBE11(腫瘤體積2％被抑制)至85mg/kg吉西他濱+150μg huCBE11(腫瘤體積85％被抑制)范圍內(nèi)的聯(lián)合用藥劑量表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)。C.I.表示的協(xié)同或拮抗作用程度的總體解釋見表15。當與50或100μg劑量huCBE11聯(lián)用時，12.5或25mg/kg劑量的吉西他濱產(chǎn)生的效果在統(tǒng)計學(xué)上顯著小于相加作用(表44)。
表43個體腫瘤體積

表44個體的腫瘤體積的被抑制分值

總之，用LTβ受體-活化型mAb huCBE11與化療劑吉西他濱對經(jīng)皮下植入了WiDr人結(jié)腸直腸腺癌的無胸腺裸鼠的聯(lián)用治療中，出現(xiàn)了huCBE11與吉西他濱聯(lián)合治療的效果，經(jīng)測定在huCBE11和吉西他濱低濃度情況下該效果為協(xié)同性的。
使用KM-20L2小鼠模型測定huCBE11與吉西他濱聯(lián)合用藥的抗腫瘤效力此外，還使用了其它的人結(jié)腸直腸腺癌小鼠模型系統(tǒng)如KM-20L2模型，來測定核苷類似物化療劑例如吉西他濱與huCBE11聯(lián)合用藥是否具有超-相加的抗腫瘤活性，例如，協(xié)同的或加強的抗腫瘤活性。
首先進行劑量范圍試驗，測定出適于研究吉西他濱與huCBE11聯(lián)合抗腫瘤效力的吉西他濱與huCBE11的劑量。將從25mg/kg至140mg/kg遞增劑量的吉西他濱施用給經(jīng)皮下植入KM-20L2腫瘤細胞的無胸腺裸鼠(第0天)。植入時腫瘤種植率為100％，選擇大小接近的110只小鼠啟動治療試驗。與鹽水對照組相比，吉西他濱140mg/kg(P＜0.05第10天；P＜0.001第14-41天)、100mg/kg(P＜0.05第10天；P＜0.001第14-41天)、50mg/kg(P＜0.001第10-41天)和25mg/kg(P＜0.01第19和41天；P＜0.001第14-37天)組在試驗第10天至最后一天即第41天期間中被觀察到腫瘤生長顯著抑制。吉西他濱140mg/kg、100mg/kg和50mg/kg組的％T/C在第14或17天時等于或小于42％，并且一直保持到試驗結(jié)束。吉西他濱25mg/kg組的％T/C第17天時等于或小于42％，并且一直保持到第31天。單獨用藥試驗中，測定了5、10和20mg/kg劑量吉西他濱在KM-20L2人腺癌異種移植模型中的抗腫瘤活性。植入時腫瘤種植率為100％，選擇大小接近的129只小鼠啟動治療試驗。試驗發(fā)現(xiàn)使用這種模型的這個實驗室中，載體對照組中的腫瘤生長恰好在這種常規(guī)劑量范圍內(nèi)。與載體對照組相比，吉西他濱20mg/kg組在第13-55天(P＜0.001第13-47天；P＜0.01第50-55天)、10mg/kg組在第16-55天(P＜0.01第16-50天；P＜0.05第55天)和5mg/kg組在第13-43天(P＜0.01第20-23天，P＜0.05第13-16天和第27-43天)出現(xiàn)對腫瘤生長的顯著抑制。吉西他濱20mg/kg組的％T/C第16天時等于或小于42％，并且一直保持到第34天。因此，根據(jù)NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，可以確定吉西他濱具有抗KM-20L2腫瘤模型的活性。
在平行劑量范圍試驗中，檢測了huCBE11在KM-20L2人腺癌異種移植模型中的活性。施用0.2、2、4和20mg/kg的huCBE11。植入時腫瘤種植率為99.5％，選擇大小接近的110只小鼠啟動治療試驗。與載體對照組相比，huCBE11 2mg/kg劑量組(第28-33天)和4mg/kg劑量組(第21-28天)中的腫瘤生長顯著縮小。這些劑量組中觀察到的％T/C的最小值＞42％。單獨用藥試驗中，向KM-20L2模型小鼠施用0.2、2和4mg/kg劑量的吉西他濱。就這些小鼠而言，與載體對照組相比，huCBE11 4mg/kg組(P＜0.01第20-23天；P＜0.001第27-55天)和2mg/kg組(P＜0.01第20-23天；P＜0.001第27-55天)在第20-55天期間腫瘤生長顯著降低。hCBE11 4mg/kg組在第50和55天，2mg/kg組在第41-55天，％T/C等于或小于42％。因此，根據(jù)NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，可以確定huCBE11具有抗KM-20L2腫瘤模型的活性。
另外還對huCBE11與吉西他濱聯(lián)用效果進行了測定。用下列物質(zhì)處理動物群對照用鹽水(0.9％滅菌鹽水)；遞減量的吉西他濱(20、10和5mg/kg)；遞減量的huCBE11(4、2和0.2mg/kg)；huCBE11加吉西他濱劑量組合(4mg/kg huCBE11+20mg/kg吉西他濱、4mg/kg huCBE11+10mg/kg吉西他濱、0.2mg/kg huCBE11+20mg/kg吉西他濱、0.2mg/kghuCBE11+10mg/kg吉西他濱、4mg/kg huCBE11+5mg/kg吉西他濱、8mg/kg huCBE11+10mg/kg吉西他濱和20mg/kg huCBE11+25mg/kg吉西他濱)，從第7天開始使用與單試劑相同的方案。當腫瘤達到5毫米(mm)長×5mm寬的平均體積時，開始所有治療。第10-55天，huCBE11 4mg/kg與吉西他濱20mg/kg聯(lián)合治療與單用huCBE11 4mg/kg相比對腫瘤生長顯示顯著抑制(p＜0.01第10天；p＜0.001第13-55天)(圖12)。該劑量組的％T/C在第16-55天等于或小于42％，在第37天降至最小值為13.6％。第13--55天，huCBE11 4mg/kg與吉西他濱10mg/kg聯(lián)合治療與單用huCBE11 4mg/kg相比對腫瘤生長顯示明顯抑制(p＜0.001第16-50天，p＜0.01第13和第55天)。該劑量組的％T/C在第20-55天等于或小于42％，其中的最小值為15.8％。第27-55天，huCBE11 0.2mg/kg與吉西他濱20mg/kg聯(lián)合治療與單用吉西他濱20mg/kg相比對腫瘤生長顯示顯著抑制(p＜0.05第27、37和43天；p＜0.01第30-34、41、47-55天)。該劑量組的％T/C在第16-55天等于或小于42％，在第30天降至最小值19.8％。huCBE11 0.2mg/kg與吉西他濱10mg/kg聯(lián)合治療與單用吉西他濱10mg/kg對腫瘤生長顯示顯著抑制，實驗任何時候都中未出現(xiàn)％T/C等于或小于42％。第9-43和第55天，huCBE114mg/kg與吉西他濱5mg/kg聯(lián)合治療與單用huCBE11 4mg/1g相比對腫瘤生長顯示顯著抑制(p＜0.05第9、41、43和55天；p＜0.01第13、20、27、34和37天；p＜0.001第16、23和30天)。該劑量組的％T/C在第20-55天等于或小于42％，第37天降至最小值為25.6％。盡管無法對hCBE11 8mg/kg加吉西他濱10mg/kg組與hCBE11 8mg/kg，或者對hCBE11 20mg/kg加吉西他濱25mg/kg組與hCBE11 20mg/kg的腫瘤生長抑制情況進行比較，但是在第16-55天觀察到這些組的％T/C等于或小于42％?？傊?，可以確定的是按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，上述6組huCBE11加吉西他濱聯(lián)合治療在KM-20L2腫瘤模型中有活性。這6組huCBE11+吉西他濱聯(lián)合治療的每一組都出現(xiàn)了對腫瘤生長的明顯抑制。
使用獲自這些聯(lián)合治療試驗的腫瘤重量數(shù)據(jù)，進行統(tǒng)計學(xué)比較來測定huCBE11加吉西他濱聯(lián)合用藥的作用方式是否為協(xié)同性的。由于單用吉西他濱或huCBE11治療荷KM-20L2腫瘤小鼠產(chǎn)生了劑量-反應(yīng)型抗腫瘤效力，所以可以通過計算聯(lián)用指數(shù)(CI)對huCBE11+吉西他濱聯(lián)用的協(xié)同效果進行正式評估(Chou，1984)。
為了確保對聯(lián)合施用huCBE11與吉西他濱時是否產(chǎn)生超-相加效果的評估，首先通過比較每一治療組的腫瘤體積與對照組的腫瘤體積對抗腫瘤效力進行了測定。對照組和治療組腫瘤體積平均值之間的差。腫瘤體積的被抑制分值，即受影響分值(Fa)，可以通過治療組平均腫瘤體積縮小除以對照組平均腫瘤體積計算得出。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。本發(fā)明試驗中用于評估協(xié)同性藥物作用的那些數(shù)據(jù)是在固定比例4∶5(mg/kg西他濱∶mg/kg huCBE11)的情況下得到的。這一比例是以這兩種藥劑的中值效果劑量之比為基礎(chǔ)的。表28顯示了單獨及聯(lián)合治療時的量效關(guān)系。
表28huCBE11與吉西他濱(吉西他濱)平均腫瘤大小，計算出的治療導(dǎo)致的被抑制分值，吉西他濱與huCBE11分別及聯(lián)合治療的天數(shù)

表28huCBE11與吉西他濱(吉西他濱)平均腫瘤大小，計算出的治療導(dǎo)致的被抑制分值，吉西他濱與huCBE11分別及聯(lián)合治療的天數(shù)(續(xù))

表28huCBE11與吉西他濱(吉西他濱)平均腫瘤大小，計算出的治療導(dǎo)致的抑制分值，吉西他濱與huCBE11分別及聯(lián)合治療的天數(shù)(續(xù))

表28huCBE11與吉西他濱(吉西他濱)平均腫瘤大小，計算出的治療導(dǎo)致的抑制分值，吉西他濱與huCBE11分別及聯(lián)合治療的天數(shù)(續(xù))

表28中列出的huCBE11+吉西他濱固定比例聯(lián)合治療的數(shù)據(jù)使得能夠通過計算CI完成使用CalcuSyn V1.1(Biosoft，CamβRidge，UK)軟件對協(xié)同作用的評估，該軟件可用于基于windows的劑量-效果分析。對于給定的聯(lián)合用藥治療，CI＝1代表相加的藥效。CI＜1表示協(xié)同作用。CI大于1表明為拮抗作用。CI計算中使用的量效關(guān)系見表29。
表29用干協(xié)同作用計算的huCBE11與吉西他濱的量效關(guān)系

huCBE11與吉西他濱分別及聯(lián)合治療的中值效果劑量列于表30。吉西他濱與huCBE11分別及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)關(guān)系的藥效(Potency)及形狀分別顯示于表31和32。對于該試驗中使用的確切水平試驗劑量計算得出的CI列于表32。
因為本發(fā)明試驗使用了被認為具有完全獨立模式作用的藥物，所以能夠應(yīng)用非各自獨有的的CI值(參見表3和32-34)。使用4mg/kg huCBE11+5mg/kg吉西他濱、8mg/kg huCBE11+10mg/kg吉西他濱和20mg/kghuCBE11+25mg/kg吉西他濱(即按4∶5的固定比例)的聯(lián)合劑量在第34-37天出現(xiàn)協(xié)同效果。這些兩藥物較低劑量聯(lián)用在治療期的大部分時間表現(xiàn)出了協(xié)同作用(表32)。聯(lián)合用藥劑量水平范圍內(nèi)的CI模擬顯示于表33和34，CI表示的協(xié)同或拮抗作用程度的總體解釋見表3。協(xié)同效應(yīng)遍及整個治療期間。作為腫瘤抑制百分比函數(shù)的CI顯示于圖13。大多數(shù)情況下，協(xié)同作用在60％以下的腫瘤抑制水平最為顯著。聯(lián)合用藥的協(xié)同效應(yīng)峰值在第34天觀察到。圖14給出了發(fā)生效力協(xié)同效應(yīng)的劑量范圍。產(chǎn)生20％至80％腫瘤抑制的劑量范圍聯(lián)用了劑量水平為0.1-10mg/kg的兩種藥物(圖14)。該試驗的結(jié)果表明使用固定比例(4∶5)huCBE11+吉西他濱治療顯現(xiàn)出了協(xié)同的抗腫瘤效力。
表30協(xié)同作用的測定huCBE11與吉西他濱協(xié)同作用的中值效果劑量(mg/kg；藥效)

表31協(xié)同作用的測定huCBE11與吉西他濱聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)曲線特征

表32協(xié)同作用的測定試驗值的聯(lián)用指數(shù)(CIs)

++++強協(xié)同作用+++協(xié)同作用++中等協(xié)同作用+輕度協(xié)同作用±近乎相加-輕度拮抗作用--中等拮抗作用--拮抗作用----強拮抗作用表33協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CIs)的模擬各自獨有的作用方式

表33協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CI)的模擬各自獨有的作用方式(續(xù))

表33協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CI)的模擬各自獨有的作用方式(續(xù))

表34協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CI)的模擬互相非獨有的(完全獨立的)作用方式

表34協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CI)的模擬互相非獨有的(完全獨立的)作用方式(續(xù))

表34協(xié)同作用的測定聯(lián)用指數(shù)(CI)的模擬互相非獨有的(完全獨立的)作用方式(續(xù))

總之，LTβ受體-活化mAb huCBE11與化療劑吉西他濱對皮下植入了KM-20L2人結(jié)腸直腸腺癌的無胸腺裸鼠的聯(lián)合治療表現(xiàn)出了huCBE11與吉西他濱聯(lián)合治療的效果，經(jīng)測定該效果是協(xié)同性的。
實施例5LTβR激動劑與植物堿化療劑聯(lián)合用藥的抗腫瘤效力huCBE11與紅豆杉醇聯(lián)用的抗腫瘤改力為了測定植物堿化療劑例如紅豆杉醇與LTβ受體-活化mAb huCBE11的聯(lián)合用藥在治療癌癥方面是否有超-相加效果，對抗體/化療聯(lián)合在WiDr異種移植模型上的潛在協(xié)同的及加強性抗腫瘤活性進行了檢測。
首先進行劑量范圍試驗，測定適于研究聯(lián)合抗腫瘤效力的紅豆杉醇和huCBE11的劑量。另外，單藥劑試驗還檢測了每一藥劑單獨施用時抑制腫瘤生長的抗腫瘤效力。用鹽水(對照)、huCBE11(5μg、50μg、100μg或500μg)或紅豆杉醇(劑量范圍為3.13mg/kg-25mg/kg)對荷有人工建立的(established)WiDr腫瘤的無胸腺裸鼠進行治療(鹽水對照組n＝30；試驗組n＝10/劑量)。第3天時測定腫瘤大小，此后定期進行直至分期日(staging day)。
單獨施用紅豆杉醇的試驗組中腫瘤生長受到了抑制。第50天時，在25mg/kg(P＜0.0001)這一劑量，紅豆杉醇具有對生長于裸鼠的WiDr人結(jié)腸直腸腫瘤生長產(chǎn)生顯著抑制。25mg/kg組在第21-25天期間的％T/C小于42％。12.5mg/kg、6.25mg/kg和3.13mg/kg紅豆杉醇劑量組的腫瘤生長與載體對照組無顯著差別，這些劑量組在整個試驗過程中的％T/C都＞82％。此外，25mg/kg(P＜0.0001)、18.75mg/kg(P＜0.001)和6.25mg/kg(P＜0.05)劑量組的紅豆杉醇在第39天，12.5mg/kg組(P＜0.05)在第13-32天，顯現(xiàn)了對腫瘤生長的顯著抑制。25mg/kg組第13-39天以及18.75mg/kg組第21-34天的％T/C小于42％。
huCBE11試驗組中的腫瘤生長也受到了抑制。第45天時，500μg(P＜0.001)、100μg(P＜0.001)、50μg(P＜0.001)和5μg(P＜0.05)劑量的huCBE11對腫瘤生長產(chǎn)生了顯著的抑制。類似的結(jié)果出現(xiàn)于第39天；經(jīng)500μg(P＜0.001)和50μg(P＜0.01)huCBE11治療后的腫瘤重量顯著小于載體治療的腫瘤重量。500μg組第31-45天期間的％T/C小于42％。
為了測定紅豆杉醇與huCBE11聯(lián)合用藥是否能有效抑制腫瘤生長，按照上述方法對荷有人工建立的(established)WiDr腫瘤細胞的無胸腺裸鼠進行聯(lián)合用藥試驗。測定發(fā)現(xiàn)按照NCI活性標準(％T/C等于或小于42)，huCBE11與紅豆杉醇的聯(lián)用在WiDr模型中是有活性的。第39天時，與單獨施用huCBE11(500μg)相比，huCBE11 500μg與紅豆杉醇12.5mg/kg聯(lián)用對WiDr腫瘤生長產(chǎn)生了顯著較大的抑制(P＜0.05)。huCBE11 500μg加紅豆杉醇12.5mg/kg組第24-39天期間的％T/C，huCBE11 75μg加紅豆杉醇25mg/kg組第13-39天期間的％T/C，huCBE11 56.25μg加紅豆杉醇18.75mg/kg組第18-34天期間的％T/C，以及huCBE11 37.5μg加紅豆杉醇12.5mg/kg組第27、34和39天時的％T/C，都小于42％(圖3)。
聯(lián)合用藥試驗的結(jié)果(顯示于表35-39以及圖3和15)表明huCBE11與紅豆杉醇聯(lián)用使得被治療小鼠的腫瘤體積顯著縮小。通過比較每一治療組的腫瘤體積與對照組的腫瘤體積，測定抗腫瘤效力。Fa為1.000表示腫瘤被完全抑制。表35顯示了第34天時huCBE11與紅豆杉醇分別及聯(lián)合治療的量效關(guān)系。
表35huCBE11與紅豆杉醇之間的量效關(guān)系


由于單用紅豆杉醇治療荷WiDr腫瘤小鼠產(chǎn)生了劑量-反應(yīng)的抗腫瘤效力，所以可以通過計算聯(lián)用指數(shù)對huCBE11加紅豆杉醇聯(lián)合用藥的協(xié)同作用進行常規(guī)評估。本試驗中用于評估協(xié)同性藥物作用的那些數(shù)據(jù)是在固定比0.333∶1(mg/kg紅豆杉醇∶mg/kg huCBE11)的情況下得到的。這一比例是以先前初步試驗中測得的兩種藥劑中值效果劑量之比為基礎(chǔ)的。協(xié)同作用的常規(guī)評估采用使用CalcuSyn V1.1(Biosoft CamβRidge，UK)軟件對聯(lián)用指數(shù)(CI)進行計算，該軟件可用于基于windows的劑量-效果分析。對于給定的聯(lián)合用藥治療，CI＝1代表相加的效力。CI＜1表示協(xié)同作用。CI大于1表明為拮抗作用。CI計算中使用的量效關(guān)系見表36。
表36huCBE11的用于協(xié)同作用計算的量效關(guān)系

使用聯(lián)用指數(shù)，用第34天時的腫瘤體積評估協(xié)同作用。紅豆杉醇與huCBE11分別及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)關(guān)系的效力及形狀分別顯示于下列的表37和38。對于該試驗中使用具體水平試驗劑量計算得出的聯(lián)用指數(shù)列于表39。
表37協(xié)同作用的測定huCBE11與紅豆杉醇協(xié)同作用的中值效果劑量

表38分別及聯(lián)合治療的劑量-反應(yīng)曲線的形狀

表39適于試驗劑量的聯(lián)用指數(shù)

++中等協(xié)同作用+++協(xié)同作用因為本發(fā)明試驗使用了被認為具有完全獨立作用模式的藥物，所以可使用非各自獨有的的CI值。使用6.25mg/kg紅豆杉醇+18.75μg huCBE11，12.5mg/kg紅豆杉醇+37.5μg huCBE11以及25mg/kg紅豆杉醇+75μg huCBE11的聯(lián)合用藥劑量顯示除了協(xié)同效果。聯(lián)合用藥劑量水平范圍內(nèi)的CI模擬(Simulations)顯示于表40。從4.9mg/kg紅豆杉醇+14.7μg huCBE11(腫瘤體積40％被抑制)至57mg/kg紅豆杉醇+170μg huCBE11(腫瘤體積95％被抑制)范圍內(nèi)的聯(lián)合用藥劑量表現(xiàn)出了協(xié)同效應(yīng)。作為效果分值函數(shù)的聯(lián)用指數(shù)顯示于圖12。
表40聯(lián)合指數(shù)(CI)模擬



本發(fā)明試驗中用于評估藥物加強作用的那些數(shù)據(jù)不限于固定比例的組合。統(tǒng)計學(xué)顯著加強作用的檢驗需要計算每只動物的Fa。使用個體腫瘤體積(表45)計算每只動物的腫瘤體積的被抑制分值(Fa)(表46)。用下列公式計算出Fa(對照組平均腫瘤體積-個體動物腫瘤體積)÷對照組平均腫瘤體積。聯(lián)合用藥的預(yù)期相加Fa是單獨接受所述聯(lián)合用藥中的一種藥物的兩個組的平均Fa之和。如果治療是簡單相加，也計算了聯(lián)合治療的實際療效與預(yù)期療效之間的差(表46)。使用雙尾單樣本t-檢驗測定所述聯(lián)合治療是否產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上顯著不同于預(yù)期相加值的平均Fa(表46)。
表45個體腫瘤體積

表46個體的腫瘤體積被抑制分值

綜上所述，使用紅豆杉醇加huCBE11的固定-比例聯(lián)合治療(0.333∶1)對WiDr人結(jié)腸直腸腺癌顯現(xiàn)出了協(xié)同的抗腫瘤效力。
等同技術(shù)方案本發(fā)明提供了包括LT-β-R激動劑的聯(lián)合治療。盡管本發(fā)明中已經(jīng)對具體的實施方案進行了討論，但是上述具體技術(shù)方案是為了說明而非限制本發(fā)明。在這些具體實施方案的基礎(chǔ)上得到本發(fā)明的許多不同形式，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。本發(fā)明的完整范圍應(yīng)該根據(jù)所附權(quán)利要求確定，其中包括等同方案的完整范圍以及具體實施方案及其變體。
本申請中提到的所有出版物及專利，包括下列那些對象在內(nèi)，在此全文引入作為參考，如同每一單個出版物或?qū)＠麑ｉT且單獨地指明在此引入作為參考。如有抵觸，包括本申請中的任一定義，以本申請為準。
序列表<110>比奧根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc.)<120>淋巴毒素β受體藥劑與化療劑的聯(lián)合用藥<130>BINA171PC<150>60/435185<151>2002-12-20<160>14<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>2094<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuCBE11/huBHAIO雙特異性-1抗體的重鏈<400>1gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccaggcc 120ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac 240ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagctgtgt attactgcgc aagagaggag 300aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660aaatcttgtg acaagactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgatgag 1080ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320cagaagagcc tctccctgtc tcccggggga gggggtggat caggaggtgg cggctcccag 1380gtccaactgg tgcagtctgg agctgaggtg aagaagcctg ggtcctcagt gaaggtgtcc 1440tgcaaggctt ctggctacac tttcacaacc tactatttgc actgggtgag gcaggcccct 1500ggacagggac ttgagtggat gggatggatt tatcctggaa atgttcatgc tcagtacaat 1560gagaagttca agggcagggt cacaatcact gcagacaaat ccaccagcac agcctacatg 1620gagctcagca gcctgaggtc tgaagatact gcggtctatt actgtgcaag atcctgggaa 1680ggttttcctt actggggcca agggaccacg gtcaccgtct cctcaggtgg gggcggatct 1740gggggcggcg gatccggtgg tggtggtagt gacattcaga tgacccagtc tcctagctcc 1800ctgtccgcct cagtaggaga cagggtcacc atcacctgca aggccagtca gaatgtgggt 1860attaatgtag cctggtatca acagaaacca gggaaggctc ctaaatcact gatttcctcg 1920gcctcctacc ggtacagtgg agtcccttcc agattcagcg gcagtggatc tgggacagat 1980ttcactctca ccatcagcag cctccagcct gaagacttcg caacctattt ctgtcagcaa 2040tatgacacct atccattcac gttcggccag ggtaccaagg tggagatcaa atga 2094
<210>2<211>697<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HuCBE11/huBHAIO的重鏈<400>2Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr LVs Asn Gln Val Ser Leu355 360 365Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro435 440 445Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val450 455 460Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser465 470 475 480Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Leu His Trp Val485 490 495Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Tyr pro500 505 510Gly Asn Val His Ala Gln Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr515 520 525Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser530 535 540Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Trp Glu545 550 555 560Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly565 570 575Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile580 585 590Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg595 600 605Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Ile Asn Val Ala610 615 620Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile Ser Ser625 630 635 640Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly645 650 655Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp660 665 670Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Tyr Pro Phe Thr Phe675 680 685Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys690 695<210>3<211>645<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>HuCBE11/huBHAIO雙特異性-1抗體的輕鏈<400>3gatatccaga tgacccagtc tccatcatcc ttgtctgcat cggtgggaga cagggtcact 60atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120gggaaagcgc ctaagcttct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180agattcagtg gcagtggatc tggtacagat tatactctaa ccatcagcag cctgcagcct 240gaggatttcg caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300ggcaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645<210>4
<211>194<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>HucBE11/huBHAIO雙特異性-1抗體的輕鏈<400>4Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly180 185 190Glu Cys<210>5<211>2196<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>成熟的huCBE11/huBHAIO雙特異性-2抗體的輕鏈<400>5gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaggctc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccaggcc 120ccgggaaagg ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa cagcctctac 240ctgcagatga gcagcctgag ggctgaggac acagctgtgt attactgcgc aagagaggag 300aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctct 360gggggcgggg ggtccggggg aggcgggtcg ggaggtggcg gaagtgatat ccagatgacc 420cagtctccat catccttgtc tgcatcggtg ggagacaggg tcactatcac ttgcaaggcg 480ggtcaggaca ttaaaagcta tttaagctgg taccagcaga aaccagggaa agcgcctaag 540cttctgatct attatgcaac aaggttggca gatggggtcc catcaagatt cagtggcagt 600ggatctggta cagattatac tctaaccatc agcagcctgc agcctgagga tttcgcaact 660tattactgtc tacagcatgg tgagagcccg tggacgttcg gtggaggcac caagctggag 720atcaaagggg gtggtggttc aggaggtgga ggatccgagc ccaaatctag tgacaagact 780
cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc 840cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg 900gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag 960gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc 1020agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1080tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1140cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgcgatg agctgaccaa gaaccaggtc 1200agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1260aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgttggactc cgacggctCC 1320ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc 1380tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg 1440tctcccgggg gagggggtgg atcaggaggt ggcggctccc aggtccaact ggtgcagtct 1500ggagctgagg tgaagaagcc tgggtcctca gtgaaggtgt cctgcaaggc ttctggctac 1560actttcacaa cctactattt gcactgggtg aggcaggccc ctggacaggg acttgagtgg 1620atgggatgga tttatcctgg aaatgttcat gctcagtaca atgagaagtt caagggcagg 1680gtcacaatca ctgcagacaa atccaccagc acagcctaca tggagctcag cagcctgagg 1740tctgaagata ctgcggtcta ttactgtgca agatcctggg aaggttttcc ttactggggc 1800caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt gggggcggat ctgggggcgg cggatccggt 1860ggtggtggta gtgacattca gatgacccag tctcctagct ccctgtccgc ctcagtagga 1920gacagggtca ccatcacctg caaggccagt cagaatgtgg gtattaatgt agcctggtat 1980caacagaaac cagggaaggc tcctaaatca ctgatttcct cggcctccta ccggtacagt 2040ggagtccctt ccagattcag cggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 2100agcctccagc ctgaagactt cgcaacctat ttctgtcagc aatatgacac ctatccattc 2160acgttcggcc agggtaccaa ggtggagatc aaatga 2196<210>6<211>731<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>成熟的huCBE11/huBHAIO雙特異性-2抗體<400>6Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser130 135 140Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala145 150 155 160Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly165 170 175Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly180 185 190Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu195 200 205Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu
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<223>hucBE11單特異性-1抗體
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<223>成熟的五聚CBE11的重鏈<400>11gaggtacaac tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt gactattaca tgtattggtt tcgccagact 120ccggaaaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtgatg gtggtagtta cacctactat 180ccagacagtg tgaaggggcg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caacctgtac 240ctgcaaatga gcagtctgaa gtctgaggac acagccatgt attactgtgt aagagaggag 300aatggtaact tttactactt tgactactgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 420ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 480tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 540ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 600tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 660aaatcttgtg acaagactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 720ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 780gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 840tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 900agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 960gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1080ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1140gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1200ttggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1260cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1320cagaagagcc tctccctgtc taccgggaaa cccaccctgt acaacgtgtc cctggtcatg 1380tccgacacag ctggcacctg ctactga 1407<210>12<211>468<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>成熟的五聚CBE11的重鏈<400>12Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr20 25 30Tyr Met Tyr Trp Phe Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val35 40 45Ala Thr Ile Ser Asp Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys85 90 95Val Arg Glu Glu Asn Gly Asn Phe Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val115 120 125Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser145 150 155 160Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val165 170 175Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro180 185 190Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys195 200 205Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp210 215 220Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly225 230 235 240Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile245 250 255Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu260 265 270Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His275 280 285Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg290 295 300Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys305 310 315 320Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu325 330 335Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr340 345 350Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu355 360 365Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp370 375 380Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val385 390 395 400Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp405 410 415Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His420 425 430Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Thr435 440 445Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala450 455 460Gly Thr Cys Tyr465<210>13<211>645<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>成熟的嵌合CBE11的輕鏈<400>13gatattaaga tgacccagtc tccatcctcc atgtatgcat cgctgggaga gagagtcact 60atcacttgca aggcgggtca ggacattaaa agctatttaa gctggtacca gcagaaacca 120tggaaatctc ctaagatcct gatctattat gcaacaaggt tggcagatgg ggtcccatca 180agattcagtg gcagtggatc tgggcaagat tattctctaa ccatcagcag cctggagtct 240gacgatacag caacttatta ctgtctacag catggtgaga gcccgtggac gttcggtgga 300ggcaccaagc tggagatcaa acgaactgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645<210>14<211>214<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>成熟的嵌合CBE11的輕鏈<400>14Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly1 5 10 15Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Gly Gln Asp Ile Lys Ser Tyr20 25 30Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Trp Lys Ser Pro Lys Ile Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ala Thr Arg Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser65 70 75 80Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Gly Glu Ser Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Lau Asr Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210
權(quán)利要求
1.一種用于抑制腫瘤體積的方法，該方法包括施用有效量的淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑和有效量的至少一種化療劑，其中所述的LT-β-R激動劑和化療劑的施用導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。
2.一種用于抑制腫瘤體積方法，該方法包括施用有效量的抗-淋巴毒素-β受體(LT-β-R)抗體和有效量的至少一種化療劑，其中所述的抗-LT-β-R抗體和化療劑的施用導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制。
3.一種藥物組合物，其含有有效量的LT-β-R激動劑、有效量的至少一種化療劑和可藥用的載體，將該藥物組合物施用給受試者導(dǎo)致超-相加的腫瘤抑制效果。
4.有效量的淋巴毒素-β受體(LT-β-R)激動劑和有效量的化療劑在制備用于治療癌癥的藥物中的用途，該藥物施用給受試者時導(dǎo)致對腫瘤的超-相加抑制作用。
5.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述對腫瘤的超-相加抑制作用是協(xié)同性的。
6.權(quán)利要求5所述的方法、用途或組合物，其中所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有小于1.00的聯(lián)用指數(shù)。
7.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述對腫瘤的超-相加抑制作用被加強的。
8.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述對腫瘤的超-相加抑制作用具有小于0.05的P-值。
9.權(quán)利要求1或3-8中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的LT-β-R激動劑是抗LT-β-R抗體。
10.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述抗LT-β-R抗體是單克隆抗體。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的單克隆抗體選自BKA11、CDH10、BCG6、AGH1、BDA8、CBE11或BHA10。
12.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述抗LT-β-R抗體是人源化抗體。
13.權(quán)利要求12所述的方法、用途或組合物，其中所述的人源化抗體選自huCBE11或huBHA10。
14.權(quán)利要求13所述的方法、用途或組合物，其中所述的人源化抗體是huCBE11。
15.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的抗LT-β-R抗體是多價抗LT-β-R抗體。
16.權(quán)利要求15所述的方法、用途或組合物，其中所述的多價抗LT-β-R抗體構(gòu)建體是多特異性的。
17.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的抗體與所述化療劑偶聯(lián)在一起。
18.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的化療劑是干擾DNA合成的藥劑。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的干擾DNA合成的藥劑是核苷類似物化合物。
20.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的核苷類似物化合物是吉西他濱。
21.權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的干擾DNA合成的藥劑是蒽環(huán)類抗生素。
22.權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的蒽環(huán)類抗生素是阿霉素。
23.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的化療劑是拓撲異構(gòu)酶I抑制劑。
24.權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的拓撲異構(gòu)酶I抑制劑是Camptosar。
25.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的化療劑是烷化劑。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述的烷化劑是鉑化合物。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的鉑化合物選自卡鉑和順氯氨鉑組成的組。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的鉑化合物是順氯氨鉑。
29.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的化療劑是植物堿。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的植物堿是紫杉烷。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中所述的紫杉烷是紅豆杉醇。
32.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法、用途或組合物，其中所述的化療劑選自干擾DNA合成的藥劑、拓撲異構(gòu)酶I抑制劑、鉑化合物或紫杉烷。
全文摘要
本發(fā)明涉及聯(lián)合用藥治療，其中包括一種組合物、以及治療方法和篩選方法，其中所述的組合物與一種或多種其它化療劑聯(lián)用能活化淋巴毒素－β受體信號傳導(dǎo)，其中所述篩選方法用于鑒定與淋巴毒素－β受體激動劑聯(lián)用時對腫瘤具有超相加抑制效果的藥劑。
文檔編號C07K16/28GK1753692SQ200380109916
公開日2006年3月29日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月20日
發(fā)明者多琳·萊佩奇, 艾倫·吉爾 申請人:比奧根艾迪克Ma公司