專利名稱：2′－支鏈核苷的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有保護(hù)的氧取代基的糖類似化合物的制備方法，特別是關(guān)于2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的羥基)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖和2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的羥基)-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯的制備方法。本發(fā)明還包括制備核苷的方法，特別是通過(guò)任選使用按照在此提出的方法制備的糖來(lái)制備3′，5′-(獨(dú)立任選保護(hù)的羥基)-2′-C-甲基-β-D-胞苷的方法，特別的，是關(guān)于藥物化合物前體的合成。更具體地，本發(fā)明描述了用作抗病毒核苷和核苷類似物衍生化合物給藥的前藥的合成，特別的，是2′-C-甲基-β-D-胞苷的′-O-纈氨酸酯的合成。
背景技術(shù)：
在用于核苷和維生素合成中的糖類似物的制備中，一種關(guān)鍵的中間體為2-C-甲基-D-核糖酸-內(nèi)酯。早在1880，Scheibler就介紹了制備內(nèi)酯的方法(JohnSowden，″The Saccharinic Acids″in Adv.Carbohydrate Chem.1243-46(1957)，引用C.Scheibler，Berichte 132212(1880))。然而，產(chǎn)物的產(chǎn)率卻只有大約10％(Id.)。大約在同一時(shí)間，H.Kiliani利用氫氧化鈣處理D-果糖，合成了2-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯(H.Kiliani，Berichte，152953(1882)，在F.J.Lopez-Herrera etal.，J Carbohydrate Chemistry，13(5)767-775(1994)中被引用)。然而，該方法需要數(shù)月的時(shí)間來(lái)完成，且產(chǎn)率僅有10％(Id.at 768)。但是，Kiliani的方法使他能夠確定重要的官能基在化合物上的位置(John Sowden，″The Saccharinic Acids″in Adv.Carbohydrate Chem.1243-46(1957)，引用H.Kiliani，Ann.，213361(1883))。
在20世紀(jì)60年代早期，Whistler和BeMiller嘗試過(guò)改進(jìn)Kiliani的合成(RoyL.Whistler and J.N.BeMiller，″a-D-Glucosaccharino-1，4-lactone″in Methods inCarbohydrate Chemistry，2484-485(1963))。Whistler和BeMiller向D-果糖中加入沸水和氫氧化鈣，向該體系中通入氮?dú)猓貜?fù)相同的過(guò)程。兩周后；再將混合物放置6-8周，再用CO2和二水合草酸處理，壓力下過(guò)濾。重復(fù)洗滌殘?jiān)敝磷優(yōu)榫鶆虻臐{液狀，合并濾液，減壓下蒸餾溶劑，使所得產(chǎn)物冷卻下結(jié)晶(Id.)。最終產(chǎn)率仍僅為約10％(Id.at 485)。
在提高產(chǎn)率的嘗試中，Lopez-Aparicio等報(bào)道了由2，3-O-異亞丙基-D-甘油醛合成2-C-甲基-D-核糖酸-1，4-內(nèi)酯來(lái)替代Kiliani合成(Lopez-Aparicio et al.，Carbohydrate Res.，12999(1984)，在F.J.Lopez-Herrera et al.，J.CarbohydrateChemistry，13(5)767-775(1994)第768-769頁(yè)中被引用)。Lopez-Aparicio的方法包括使2，3-O-異亞丙基-D-甘油醛與(1-甲氧基-羰基-乙縮醛)三苯基正膦縮合，產(chǎn)生甲基E-(S)-4，5-二羥基-4，5-O-異亞丙基-2-甲基-2-戊烯酸酯；水和(在HCl中)并且將戊烯酸酯進(jìn)行光化學(xué)異構(gòu)化；對(duì)戊烯酸酯產(chǎn)物進(jìn)行內(nèi)酯化，產(chǎn)生丁烯酸內(nèi)酯；通過(guò)與三苯甲基氯和吡啶的反應(yīng)，在C-5對(duì)丁烯酸內(nèi)酯進(jìn)行三苯甲基化，然后用高錳酸鉀和二氯甲烷在冠醚存在下進(jìn)行順式羥基化作用。通過(guò)與TFA(三氟乙酸)(Id.at 768)的反應(yīng)，最終得以除去三苯甲基。據(jù)Lopez-Aparicio等報(bào)道，核糖酸內(nèi)酯的產(chǎn)率約為80％，但是其他人根據(jù)在他們發(fā)表的實(shí)驗(yàn)部分中給出的材料的質(zhì)量(克)，卻不能得到上述數(shù)據(jù)。相反，經(jīng)計(jì)算表明核糖酸內(nèi)酯的百分產(chǎn)率約為36％。并且，Lopez-Aparicio等的方法比起Kiliani合成而言要復(fù)雜得多，需要使用如高錳酸鉀這樣的有毒試劑和專門(mén)的設(shè)備用于輻射以獲得光化學(xué)異構(gòu)化，且最少需要60小時(shí)的反應(yīng)時(shí)間(Id.at 768，770-772)。
Walton等報(bào)道了由2-C-甲基-D-核糖酸-內(nèi)酯合成2′-C-甲基腺苷(Walton etal.，J.Am.Chem.Soc.，88(19)4524-5(1966))。在這里，內(nèi)酯被轉(zhuǎn)換成其2，3，5-三-O-苯甲酰衍生物，然后用二(3-甲基-2-丁基)硼烷還原，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-呋喃核糖(Id.)的端基異構(gòu)混合物。在酸洗氧化鋁和硅膠上試圖分離端基異構(gòu)混合物時(shí)，導(dǎo)致重排為1，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-α-D-呋喃核糖(Id)。為了避免重排，需要增加用苯甲酰氯在吡啶中處理混合的端基異構(gòu)體以獲得1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-(α)/(β)-D-呋喃核糖的步驟，以及用色譜分離最終產(chǎn)物的步驟(Id.)。此后，Walton等報(bào)道了通過(guò)Hilbert-Johnson反應(yīng)合成了2′-C-甲基-5-氟胞苷、2′-C-甲基-5-氟尿苷和2′-和3′-C-甲基胞苷(Walton et al.，AntiviralNucleosides 12306-309(1969))。然而，出乎意料的是，在由N-乙酰胞嘧啶-汞合成2′-C-甲基胞苷時(shí)，產(chǎn)生了大量的O-配醣，而汞本身是有毒試劑，希望避免使用(Id.)。在Walton等報(bào)道的兩種合成方法中，最終產(chǎn)物的產(chǎn)率均只有約11％。
在1997年，Harry-O′Kuru等報(bào)道了制備′-C-支鏈核糖核苷的合成路線(Harry-O′Kuru et al.，J Org.Chem.，621754-9(1997))。可從商業(yè)上獲得的1，3，5-三-O-苯甲酰-α-D-呋喃核糖被用作起始原料，其是由D-核糖或D-樹(shù)膠醛醣(D-阿拉伯吡喃糖)制得。1，3，5-三-O-苯甲酰-α-D-呋喃核糖在自由的2-OH和Dess-Martin periodinane試劑作用下被氧化，產(chǎn)生1，3，5-三-O-苯甲酰-2-酮-呋喃核糖以及其相應(yīng)的水合物。期望的產(chǎn)物以及水合物與過(guò)量的MgSO4攪拌，并放置過(guò)夜。然后過(guò)濾混合物并濃縮產(chǎn)生大量純的酮類產(chǎn)物。用MeMgBr/TiCl4(或者也可用MeTiCl3、CH2＝CHMgBr/CeCl3、或TMSC＝CLi/CeCl3)處理得到的2-酮糖，以接近5∶3的期望產(chǎn)物和異構(gòu)形式(Id.at 1755)的比例，產(chǎn)生期望的1，3，5-三-O-苯甲酰-2-取代的烷基、鏈烯基或炔基核糖呋喃糖苷(ribofuranoside)和其酯交換反應(yīng)了的異構(gòu)體的端基異構(gòu)混合物，以及α-和β-2，3，5-三-O-苯甲酰-2-取代的烷基、鏈烯基或炔基核糖呋喃糖苷(Id.at 1755)。然后，通過(guò)苯甲酰氯、DMAP和三乙胺處理，以大約70％的產(chǎn)率和4∶1的β/α的比率(Id.)，將2-烷基化的核糖呋喃糖苷轉(zhuǎn)化為單獨(dú)的期望產(chǎn)物1，2，3，5-四苯甲酰-2-烷基核糖呋喃糖苷。
Beigelman等報(bào)道了由D-葡萄糖和D-核糖合成2′-C-甲基-核苷(Beigelman etal.，Carbohydrate Research，166219-232(1987))。使用D-葡萄糖作為起始原料時(shí)，制備了1，2，5，6-二-O-異亞丙基-3-C-甲基-α-D-allofuranose，通過(guò)5，6-O-二丁基stannylidene衍生物選擇性地的插入p-甲基苯甲?；M(jìn)行轉(zhuǎn)化(Id.)。然后，用90％的三氟乙酸處理和進(jìn)行高碘酸鹽氧化作用，除去化合物上的甲酸基，進(jìn)行乙酰化(Id.)。最終產(chǎn)率約為77％(Id.)。使用D-核糖作為起始原料時(shí)，使5-位保護(hù)的2，3-二甲基-異亞丙基衍生物與甲醛進(jìn)行醇醛縮合，然后用過(guò)量的甲苯p-磺酰氯在吡啶中處理(Id.)。接著，按照文獻(xiàn)中已知的條件，例如，Kuhn甲基化、用LiAlH4在THF中還原、酸催化水解，以及在吡啶中過(guò)量的Ac2O中沸騰進(jìn)行乙?；饔?Id.)，用該化合物形成各種產(chǎn)物。
Novak和Sorm詳細(xì)報(bào)道了通過(guò)硼氫化鈉還原，由2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯制備結(jié)晶2-C-甲基-D-核糖及其衍生化合物(J.J.K.Novak&F.Sorm，CollectionCzechoslov.Chem.Commun.，34857-866(1969))。他們描述了在2-C-甲基-核糖呋喃糖苷的2-位的羥基的性質(zhì)，特別是與位于相應(yīng)的內(nèi)酯的類似位置的羥基進(jìn)行了比較(Id.)。雖然內(nèi)酯上的羥基容易在本領(lǐng)域已知的條件下被乙?；a(chǎn)生2，3，5-三-O-乙?；?，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯，但在類似的條件下，由2-C-甲基-核糖呋喃糖苷只產(chǎn)生3，5-二-O-乙?；?和3，5-二-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯(Id.)。
此后，Novak描述了2-C-甲基-1，4-內(nèi)酯的手性-光活特性，2-C-甲基-1，4-內(nèi)酯是由D-lyxose和D-木糖通過(guò)次碘酸鹽氧化制得，且在內(nèi)酯的C3和C5上有p-甲苯酰保護(hù)基(J.J.K.Novak，Collection Czechoslov.Chem.Commun.，39869-882(1974))。特別是，由3，5-p-甲苯酰-2-Br，2-CH3-核糖酸-1，4-內(nèi)酯，通過(guò)水解合成了2-CH3-核糖酸-1，4-內(nèi)酯(Id.)。然而，Novak提到了在分離保護(hù)的內(nèi)酯時(shí)有難度，并且在嘗試通過(guò)堿的醇解來(lái)切斷內(nèi)酯時(shí)生成了漿狀的產(chǎn)物(Id.at 871)。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.(JP 61-212592)和BASF Aktiendgesellschaft(EP 0 288847)都報(bào)道了由D-樹(shù)膠醛醣，一種常用的生產(chǎn)核糖的起始原料來(lái)制備未保護(hù)的D-核糖的方法。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.，教導(dǎo)了含水D-樹(shù)膠醛醣在有機(jī)溶劑中，優(yōu)選在鉬(VI)酸和硼酸化合物的存在下的差向異構(gòu)，通過(guò)2-或3-價(jià)的陽(yáng)離子交換材料(優(yōu)選轉(zhuǎn)變?yōu)镃a-型的多苯乙烯磺酸型強(qiáng)酸性離子交換樹(shù)脂)收集和通過(guò)反應(yīng)液，用水洗提分離未保護(hù)的核糖，以及收集核糖化合物(JP 61-212592，摘要)。
BASF教導(dǎo)了D-樹(shù)膠醛醣的水/醇溶液在有負(fù)載了鉬(VI)化合物的堿性離子交換器的存在下，在溶劑中加熱的連續(xù)工藝。洗出液被收集和干燥，向干燥的洗出液中加入甲醇或乙醇，將混合物冷卻至約0℃，使未保護(hù)的D-樹(shù)膠醛醣結(jié)晶，然后再對(duì)其分離和回收。根據(jù)本領(lǐng)域公知道方法，通過(guò)強(qiáng)酸性離子交換器以Ca2+的形式濃縮和純化剩余的濾出液，而在結(jié)晶階段，任何與產(chǎn)物脫離的樹(shù)膠醛醣/核糖都循環(huán)到樹(shù)膠醛醣中(EP 0288847)。
Tokyo Tanabe Co.，Ltd.和BASF的方法均要求復(fù)雜和昂貴的設(shè)備和試劑，且得到的產(chǎn)物化合物仍需要添加保護(hù)基。
日本Tobacco，Inc.，通過(guò)保護(hù)位于γ-核糖酸內(nèi)酯上的5-OH，制得了3-DPA-內(nèi)酯，其中，用到了鹽酸或酸酐以及叔胺使得3-OH發(fā)生β-消除，在碳2和3之間形成雙鍵，同時(shí)使2-OH發(fā)生乙?；罱K對(duì)C-2和C-3之間的雙鍵進(jìn)行催化加氫，并除去保護(hù)基，生成5-OH。參見(jiàn)EP O 526,655A1，EP O 553,358 A1和EP O 553,358B1，以及它們的美國(guó)同族專利U.S.5,322,955和U.S.5,391,769。
關(guān)于合成帶有保護(hù)的取代基的核糖酸內(nèi)酯以及糖類似物合成的其他相關(guān)工作還包括以下Li et al.，Organic Letters，3(7)1025-28(2001)由1，3，5-三-O-苯甲酰-α-D-呋喃核糖合成了′-C-β-三氟甲基嘧啶核苷，然后將其轉(zhuǎn)化成3，5-二-O-苯甲酰-2-C-β-三氟甲基-α-D-1-呋喃核糖溴化物。該溴化衍生化合物被發(fā)現(xiàn)是在形成核苷時(shí)的有效反應(yīng)中間體。
Beigelman et al.，Bioorg Khim.，12(10)1359-65(1986)，通過(guò)1，2，5，6-二-O-異亞丙基-3-C-甲基-α-D-allofuranose的芐基化合成了2-C-甲基-D-核糖衍生化合物，形成第一中間體；水解并選擇性乙?；摰谝恢虚g體，形成3-O-卞基-1，2-O-異亞丙基-3-C-甲基-6-O-甲苯酰-c-D-allofuranose；繼續(xù)脫除異亞丙基，氧化(用高碘酸)，脫甲?；?，乙酰化，脫卞基化，再次乙?；?，從而得到最終產(chǎn)品1，2，3-三-O-乙酰-2-C-甲基-5-O-甲苯酰-β-D-核糖呋喃糖。
Feast et al.，Acta Chemica Scandinavica 191127-34(1965)，報(bào)道了α-D-葡糖酸的制備，其為2-C-甲基-D-核糖-戊酸，是通過(guò)1，4-內(nèi)酯中間體，經(jīng)堿處理D-果糖或1-O-取代的D-果糖得到的。
Kohn et al.，J.Am.Chem.Soc.，87(23)5475-80(1965)描述了獲得醛醣的呋喃糖衍生物的簡(jiǎn)短的路徑，其是采用disiamyl硼烷作為還原劑，將四環(huán)己氧基-γ-內(nèi)酯還原成其相應(yīng)的四?；禾沁秽恰Ｔ摲磻?yīng)對(duì)于在合成C-1′呋喃基核苷中的中間體的形成尤為重要。
Kempe et al.，Nucleic Acids Res.，10(21)6695-6714(1982)報(bào)道了在保護(hù)的核糖核苷的順2′，3′-二醇的選擇性的2′-苯甲酰化，以及將2′-苯甲酸酯異構(gòu)化為3′-苯甲酸酯。這些保護(hù)的核苷被用于在固體硅膠支撐物上合成低聚核糖核苷，然后進(jìn)行脫保護(hù)，這樣的好處是內(nèi)部核苷分解最少。
Schmidt等的美國(guó)專利U.S.4,294,766詳細(xì)介紹了由核糖酸內(nèi)酯和阿拉伯酸內(nèi)酯的混合物合成純的核糖酸內(nèi)酯。核糖酸內(nèi)酯是在形成核黃素(riboflavin(維生素B2))時(shí)的中間體。阿拉伯酸鉀和核糖酸鉀的混合物被“內(nèi)酯化”，得到的約70％為核糖酸內(nèi)酯的內(nèi)酯混合物用二噁烷或乙二醇單甲醚通過(guò)分級(jí)結(jié)晶進(jìn)行分離。采用已知道方法進(jìn)行內(nèi)酯化，例如，通過(guò)使用離子交換器，或在H2SO4或K2SO4下濃縮內(nèi)酯，并過(guò)濾掉沉淀物。
核苷偶聯(lián)Walton描述了支鏈核苷的合成，其是通過(guò)使2，3，5-三-O-?；?2-(或3)-C-烷基核糖呋喃糖鹵化物和氯汞嘌呤或嘧啶化合物反應(yīng)而制備(U.S.3,480,613)。3-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖鹵化物中間體是以1，2-O-異亞丙基-5-O-?；?α-D-赤-戊呋喃-3-酮糖作為起始原料，通過(guò)使該化合物與格氏試劑反應(yīng)而在C3引入低級(jí)烷基而得到。然后，按兩條途徑進(jìn)行在第一條途徑中，5-O-?；?1，2-O-異亞丙基-3-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖被進(jìn)行酸性醇解，形成烷基5-O-酰基-3-低級(jí)烷基D-核糖呋喃糖苷；其又被?；癁橥榛?，3，5-三-O-?；?3-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖苷；所得到核糖呋喃糖苷然后通過(guò)進(jìn)行堿性溶劑分解以及進(jìn)一步在強(qiáng)酸溶液介質(zhì)中水解，而被轉(zhuǎn)化為自由糖，或者通過(guò)在合適當(dāng)溶劑中進(jìn)行鹵素取代反應(yīng)而轉(zhuǎn)變?yōu)辂u代糖。在第二條途徑中，5-O-?；?1，2-O-異亞丙基-3-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖在堿性條件(吡啶)下的惰性溶劑中被?；?，形成3，5-二-O-?；?1，2-O-異亞丙基-3-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖，其再在強(qiáng)酸中被水解，進(jìn)而?；玫侥繕?biāo)中間體。然后，通過(guò)使2，3，5-三-O-?；?D-核糖呋喃糖鹵化物和氯汞2，6-二取代嘌呤在100℃到140℃的甲苯或二甲苯等溶劑中反應(yīng)，制備在糖部分的2位或3位具有支鏈的2-取代、6-取代或2，6-二取代的嘌呤核苷。通過(guò)與2，4-二烷氧基-嘧啶反應(yīng)形成1-(2，3，5-三-O-酰基-2(或3)-C-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖)-4-烷氧基-2(1H)-嘧啶酮，由2，3，5-三-O-?；?2(或3)-C-低級(jí)烷基-D-核糖呋喃糖鹵化物衍生得到了具有期望嘧啶酮堿基的核苷，其再與氨或伯胺或仲胺反應(yīng)得到在嘧啶酮的C-4有氨基取代的化合物，或者在酸性或堿性條件下水解，得到在C-4具有羥基的嘧啶酮堿。然而，Walton的合成包含多個(gè)步驟、特殊的條件以及多種有毒試劑。
如圖5所示，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)了在乙腈中使用BSA，使1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)和N4-苯甲酰胞嘧啶偶聯(lián)。反應(yīng)混合物被加熱回流約30分鐘，然后加入路易斯酸SnCl4，溶液再次加熱并回流約3.5小時(shí)，得到4-NH-苯甲酰-2′，3′，5′-三-O-苯甲酰-β-D-2′-C-甲基-胞苷(5a)。通過(guò)用乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌并進(jìn)行充分色譜純化而得到化合物(5a)。用氨預(yù)飽的甲醇溶液對(duì)(5a)進(jìn)行過(guò)夜處理以除去苯甲酰保護(hù)基，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。
前藥藥學(xué)上的活性化合物有時(shí)以酯化的前藥形式給藥。其中以羧酸酯最為常用，而膦酸酯和磷酸酯由于不能夠在體內(nèi)水解而可能產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物，因而較少使用。(參見(jiàn)Erion等的美國(guó)專利U.S.6,312,662)。酰氧基烷基酯有時(shí)被用作膦酸酯和磷酸酯化合物，如環(huán)狀膦酸酯和芳香酯特別是苯基和卞基酯的前藥(Farquhar et al.，J.Pharm.Sci.，(1983)，72(3)324；Erion等的美國(guó)專利U.S.6,312,662)。如同核苷一樣，膦酸例如膦甲酸和PMEA(Adefovir；9-(2-膦酰甲氧基-乙基)腺嘌呤)與核苷的羧酸或醚脂質(zhì)前藥一樣，均顯示出抗病毒活性(Gosselin等的美國(guó)專利U.S.6,458,773)。
長(zhǎng)久以來(lái)，典型的前藥的合成和設(shè)計(jì)均包括核苷或核苷類似物的5′位。上述Gosselin等報(bào)道的核苷中，5′-OH的H被以下任何一種基團(tuán)取代酰基，包括其中的酯基的非羰基部分選自直鏈、支鏈或環(huán)狀的C1-C20烷基，苯基或卞基；天然和非天然的氨基酸；5′-醚脂質(zhì)或5′-磷酸醚脂質(zhì)；烷氧基烷基，包括甲氧基甲基；芳烷基，包括卞基；芳氧基烷基，如，苯氧基甲基；芳基，包括苯基，任選以鹵素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代；二羧酸，如琥珀酸；磺酸酯，如，磺酸烷基酯或磺酸芳烷基酯，包括磺酸甲酯；或單-、二-或三磷酸酯。
Matulic-Adamic等(U.S.6,248,878)報(bào)道了核苷類似物的合成。該類似物包含呋喃核糖環(huán)，其上在3′位通過(guò)氧原子和取代的嘧啶堿連有含磷基團(tuán)。含磷基團(tuán)包括dithioates或亞磷酰胺，或者可以是低聚核苷的部分。這些前藥化合物進(jìn)一步反應(yīng)而提供最終期望的核苷和核苷類似物。這些化合物通過(guò)多步合成，包括偶聯(lián)作為起始原料的在C-1具有羥基或乙酸基，在C-2-、C-3和C-5具有苯甲酰保護(hù)基的呋喃核糖和4-OSiMe3嘧啶，產(chǎn)生1-(2，3，5-三-O-苯甲酰-核糖-呋喃糖)-嘧啶-4-酮；然后，向第一反應(yīng)的產(chǎn)物中加入含有氨的甲醇，以除去苯甲酰保護(hù)基；然后，DMT-Cl/Pyr與未保護(hù)的化合物反應(yīng)，在呋喃核糖的5′-O位加成DMT；接著，用TBDMS-Cl、AgNO3和Pyr/THF與5′-O-DMT取代的呋喃核糖反應(yīng)；最后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的亞磷酸化(phosphitylation)，在3′-O產(chǎn)生含磷基團(tuán)。各合成包括至少4～7步。
Chu等描述的前藥是疊氮化物衍生物和組合物，包括核苷以及磷酸化的核苷類似物(U.S.6,271,212)。這種疊氮化物前藥的優(yōu)點(diǎn)是能夠通過(guò)血-腦屏障，提供更長(zhǎng)的半衰期和更高的生物利用度，以及增加藥物活性形式的穩(wěn)定性。然而，Chu等報(bào)道了為制備他們的疊氮化物前藥需要長(zhǎng)期和多步的合成。
Borretzen等描述的抗病毒前藥是核苷及核苷類似物。他們報(bào)道了抗病毒核苷及核苷類似物的某些脂肪酸酯，其中某些一元不飽和C18或C20脂肪酸通過(guò)?；^(guò)程而連接在核苷及核苷類似物的5′-位(U.S.6,153,594)。該過(guò)程在催化劑存在下進(jìn)行24-60小時(shí)。經(jīng)有機(jī)溶劑萃取完成產(chǎn)物分離，通過(guò)選擇適當(dāng)溶劑進(jìn)行色譜和/或重結(jié)晶進(jìn)行純化。產(chǎn)物的百分產(chǎn)率在15-82％之間變化。但是，Borretzen等沒(méi)有使用術(shù)語(yǔ)“前藥”。
1999年，McCormick等描述了使用未保護(hù)的核糖作為起始原料，在鳥(niǎo)苷的3′-OH形成碳酸酯。(McCormick et al.，J Am.Chem.Soc.1999，121(24)5661-5)。McCormick通過(guò)連續(xù)、逐步地引入O-和N-配醣聯(lián)接、利用某些保護(hù)基、磺化以及最后脫保護(hù)，完成了合成。作為他們的方法中的步驟之一，McCormick等使未保護(hù)的鳥(niǎo)苷與BOC-酐、DMAP、Et3N和DMSO在室溫下反應(yīng)4小時(shí)，直接獲得鳥(niǎo)苷的3′-OH的碳酸酯。
同樣在1999年，Tang等公開(kāi)了制備′-C-β-甲基-胞苷核糖核苷的亞磷酰胺前藥的方法。(Tang et al.，J.Org.Chem.，1999，64747-754)。與他們的許多同行一樣，Tang等將1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D呋喃核糖與經(jīng)全硅烷化去活的4-N-苯甲酰胞嘧啶在路易斯酸和SnCl4的存在下反應(yīng)，以其作為合成中的第一個(gè)步驟。(Id.at 748，SchemeIa)。
2000年，Novirio Pharmaceuticals(現(xiàn)在為Idenix)發(fā)現(xiàn)了通過(guò)施用抗病毒核苷的氨基酸酯形式，抗病毒核苷的穩(wěn)定性及生物利用度得以提高(U.S.序列號(hào)No.09/864,078，審查中；U.S.序列號(hào)No.10/261,327，審查中；WO01/90121；及U.S.臨時(shí)申請(qǐng)60/377,983和60/392,351)。制備這些核苷和核苷類似物的氨基酸酯的方法首先是以適當(dāng)?shù)目杀贿m當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基如甲硅烷基選擇性保護(hù)的支鏈β-D或β-L核苷開(kāi)始，然后，采用公知的方法進(jìn)行脫保護(hù)(Zhang et al.，Tetrahedron Letters，1992，331177-80；Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley&Sons，2ndEdition(1991)；Kerr et al.，J.Pharmaceutical Sciences，1994，83582-6；Tang et al.，J.Org.Chem.，1999，64(3)747-754；及Cavelier et al.，TetrahedronLetters，1996，375131-4)。然后，被選擇性保護(hù)的支鏈核苷與合適的?；w，如酰氯和/或酰酐或活性酸偶聯(lián)，偶聯(lián)在合適的質(zhì)子溶劑或非質(zhì)子溶劑中在合適的反應(yīng)溫度下進(jìn)行，得到1′，2′，3′或4′支鏈β-D或β-L核苷的2′或3′前藥，任選在適當(dāng)?shù)呐悸?lián)劑存在下進(jìn)行(參見(jiàn)Synthetic Communications，1978，8(5)327-33；J.Am.Chem.Soc.，1999，121(24)5661-5；Bryant et al.，Antimicrob.Agents Chemother.，2001，45，229-235；Standring et al.，Antiviral Chem.&Chemother.，2001，12(Suppl.1)，119-129；Benzaria et al.，Antiviral Res.，2001，50，A79；Pierra et al.，Antiviral Res.，2001，50，A79；以及Cretton-Scott et al.，Antiviral Res.，2001，50，A44)。可用的偶聯(lián)試劑是那些能夠?qū)⒒衔锖推渲幸徊糠诌B接到其他部分之上的物質(zhì)，包括但不限于各種碳二酰亞胺，CDI，BOP和羰基二酰亞胺。例如，對(duì)于2′-支鏈核苷的3′-前藥，核苷優(yōu)選被保護(hù)，但是通過(guò)碳二酰亞胺偶聯(lián)劑，直接偶聯(lián)到烷醇酸或氨基酸殘基上。
圖5中所示的現(xiàn)有技術(shù)的方法包括按以下順序反應(yīng)來(lái)制備胞苷的3′-纈氨酸酯核苷前藥將1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)加入到乙腈中的BSA和N4-苯甲酰胞嘧啶的混合物中，加熱至回流約30分鐘，然后，向溶液中加入路易斯酸SnCl4，溶液再次加熱至回流約3.5小時(shí)，產(chǎn)生4-NH-苯甲酰-2′，3′，5′-三-O-苯甲酰-β-D-2′-C-甲基-胞苷(5a)?；衔?5a)通過(guò)用乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌并進(jìn)行充分色譜純化而得到。用氨預(yù)飽和的甲醇溶液對(duì)(5a)進(jìn)行過(guò)夜處理以除去苯甲酰保護(hù)基，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)?；衔?6)的DMF溶液與N，N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛在室溫下反應(yīng)約1.5小時(shí)，得到在C4有保護(hù)的氨基的胞苷N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-β-D-2′-C-甲基-胞苷(7)；然后，氨基酸-保護(hù)的胞苷(7)的干吡啶溶液與咪唑和TBDPSCl在室溫下反應(yīng)約6小時(shí)，得到5′-O甲硅烷基保護(hù)的胞苷(8)；然后，在DEC、DMAP以及THF/DMF的存在下，將N-Boc-L-纈氨酸在室溫下加入到4-和5′-保護(hù)的β-D-2′-C-甲基胞苷(8)，約兩天后，得到4-和5′-保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷3′-O-L-N-BOC-纈氨酸酯(9)；在4-和5′-保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-O-L-N-BOC-纈氨酸酯(9)的干甲醇溶液中加入氟化胺，然后混合物回流以除去5′-甲硅烷基和4-氨基保護(hù)基，生成β-D-2′-C-甲基胞苷的3′-O-L-N-(叔-丁氧基羰基)纈氨酸酯(10)，其通過(guò)色譜柱提純；最后，向β-D-2′-C-甲基胞苷的3′-O-L-N-(叔-丁氧基羰基)纈氨酸酯(10)的干乙酸乙酯溶液中，加入20％的HCl/乙酸乙酯溶液，將混合物攪拌約2小時(shí)，除去BOC-保護(hù)基，生成最終產(chǎn)物β-D-2′-C-甲基胞苷的′-O-纈氨酸酯的鹽酸鹽(11)。圖6中表示的現(xiàn)有技術(shù)的合成使用了尿嘧啶代替苯甲酰胞嘧啶來(lái)制備化合物(11)β-D-2′-C-甲基胞苷。
綜上所述，若能夠有一種有效的方法制備核苷或核苷類似物將會(huì)是有利的。這樣的核苷或核苷類似物例如是2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-纈氨酸-核苷，它們的中間體，包括2-C-甲基-核糖酸內(nèi)酯和2-C-甲基-D-呋喃核糖，以及它們的鹽和/或前藥。
本發(fā)明的另一目的是提供在核苷的3′-OH選擇性加成的方法，以衍生出前藥化合物。
本發(fā)明的再一目的是提供一種有效的制備保護(hù)的糖類似化合物的方法，該方法包含最少數(shù)目的步驟，并使用廉價(jià)的起始原料。
本發(fā)明的又一目的是與合成類似產(chǎn)物相比，大幅減少制備保護(hù)的糖中間體的時(shí)間。
另外，本發(fā)明的目的之一是提供一種方法，其在數(shù)小時(shí)內(nèi)即能完成，并且以高產(chǎn)率和高純度提供最終產(chǎn)物。
本發(fā)明的另一目的是提供一種方法，該方法采用了易于使用的無(wú)毒的試劑，且其最終產(chǎn)品易于通過(guò)常規(guī)技術(shù)被分離，且容易擴(kuò)大規(guī)模。
本發(fā)明的又一目的是以超過(guò)至少90或95％的高產(chǎn)率和高純度獲得最終產(chǎn)物。
本發(fā)明的再一目的是使用無(wú)毒、易于操作的試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明公開(kāi)了一種新的改改進(jìn)的用于制備核苷及核苷類似物，如β-D和β-L2′-C-甲基-核苷及2′-C-甲基-3′-O-酯核苷以及它們的鹽和/或前藥的方法，該方法通過(guò)在更短的時(shí)間內(nèi)使用一種或多種用量更少的試劑，通過(guò)更為簡(jiǎn)單的純化步驟，得到比現(xiàn)有技術(shù)更高的產(chǎn)率。此外，本發(fā)明的方法在滿足工業(yè)生產(chǎn)的要求上非常有利。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，特別包括含有以下步驟的方法(a)將D-果糖與CaO反應(yīng)，獲得2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯；和/或(b)使任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯與合適的還原劑如Red-Al，任選在溶劑如乙醇中反應(yīng)，獲得任選保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖；和/或(c)將任選保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖與未保護(hù)的堿基進(jìn)行偶聯(lián)，偶聯(lián)如是與胞嘧啶在活化劑如甲硅烷化試劑(例如BSA)存在下，任選在路易斯酸如SnCl4存在下進(jìn)行的，得到任選保護(hù)的2′-C-甲基-核苷，例如，2′-C-甲基-胞苷；和/或(d)在優(yōu)化的試劑、反應(yīng)條件(溶劑、反應(yīng)時(shí)間等)和提取/純化技術(shù)下，得到2′-C-甲基-核苷，例如2′-C-甲基-胞苷的3′-酯。在本發(fā)明的一個(gè)具體的實(shí)施方式中，反應(yīng)過(guò)程示于圖1和4中。
還提供一種有效的可擴(kuò)大規(guī)模的、以高產(chǎn)率制備核苷前藥的方法，這種核苷在核苷的3′-位有可裂開(kāi)的部分。
進(jìn)一步提供節(jié)約成本的采用無(wú)毒試劑來(lái)制備核苷、核苷類似物、其鹽及前藥的方法。比較示于圖4的本發(fā)明的方法和示于圖5的現(xiàn)有技術(shù)的方法，可以看出，在改進(jìn)的方法中經(jīng)濟(jì)效益有所增加。比較示于圖4中的本發(fā)明的方法，以及示于圖5中的現(xiàn)有技術(shù)的方法，可以證明在改進(jìn)的方法中提高了過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性。
另外，再提供一種有效的、可擴(kuò)大規(guī)模的制備2-C-甲基糖中間體，如獨(dú)立的2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內(nèi)酯)和獨(dú)立的1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖的合成方法。比起現(xiàn)有技術(shù)的方法而言，該方法采用了一種或多種便宜的試劑，所需時(shí)間更短，純化方法更為簡(jiǎn)便，產(chǎn)率更高。
本發(fā)明與眾不同的一方面在于使用了特定組合的試劑，從而省去了合成步驟中的分離、離析和/或純化。特定試劑的選擇使得絕大多數(shù)的起始原料被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，并降低了外消旋化作用，能夠容易地從最終產(chǎn)物中除去，從而提供了比以往的方法更為有效的合成方法。總的結(jié)果是得到最終前藥產(chǎn)品的時(shí)間縮短，并且期望產(chǎn)品的百分產(chǎn)率提高。
此外，需要更少的時(shí)間以及更少的試劑提高了整體成本效率和工業(yè)上可擴(kuò)大規(guī)模和安全的方法。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法是一種核苷的制備，其在2′-C上發(fā)生雙取代，如2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-纈氨酸-核苷，其中間體，例如2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內(nèi)酯)以及1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖，和其鹽和/或前藥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)或未保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)或未保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-氨基酸酯(包括但不限于纈氨酰酯)或其優(yōu)選的鹽酸鹽形式。由本發(fā)明制備的核苷、核苷類似物、鹽或酯前藥可用作制備各種其他核苷類似物的中間體，或者直接用作抗病毒和/或抗腫瘤試劑。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的改進(jìn)的方法包括使胞嘧啶與活化劑，如BSA，任選在路易斯酸如SnCl4存在下，以及1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)或未保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖反應(yīng)，生成4-氨基-1-(3，4-(獨(dú)立任選保護(hù)的-羥基)-5-O-保護(hù)-羥基亞甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(見(jiàn)圖4) 其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲?；?；然后，如果需要，則選擇性地將前步反應(yīng)中的4-氨基-1-(3，4-(獨(dú)立任選保護(hù)的-羥基)-5-(任選O-保護(hù)-羥基亞甲基)-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮脫去保護(hù)，形成4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(6)。
例如，如果中間體(V)的P1、P2和P3是苯甲?；瑒t該化合物可以與NaOMe/MeOH反應(yīng)，得到4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)，其也被稱為β-D-2′-C-甲基-胞苷，可任選從乙醇等中重結(jié)晶，獲得β-D-2′-C-甲基-胞苷的純化形式。該化合物可根據(jù)需要用作抗病毒制劑，或者進(jìn)一步進(jìn)行衍生成為前藥。
然后，中間體(VI)可選擇地被任選保護(hù)，如在3′-位被酯化，使用已知的方法進(jìn)行任選脫保護(hù)，獲得β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯前藥，例如，β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，或者其優(yōu)選的鹽酸鹽形式。
作為本發(fā)明的一個(gè)非限制性的實(shí)例，如果3′-纈氨酸酯是優(yōu)選的，則酯化反應(yīng)可包括圖4中所表示出的步驟，即，使β-D-2′-C-甲基-胞苷與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應(yīng)，形成(7)，N[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲酰胺，其是(VI)的氨基-保護(hù)的形式；使(7)與TBDPSCl和咪唑在DCM中反應(yīng)，生成(7)的5′-甲硅烷基-保護(hù)的形式，N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲酰胺(8)；使(8)與N-Boc-L-纈氨酸、EDC、和DMAP在DCM中反應(yīng)，形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(9)；使(9)與NH4F在MeOH中反應(yīng)，并加入乙酸乙酯(為防止析出的氨切斷3′-O-纈氨酸酯)，以除去甲硅烷基和氨基保護(hù)基，并回流混合物，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(10)，其通過(guò)簡(jiǎn)單的結(jié)晶而純化；最后，使(10)與HCl在EtOH中反應(yīng)，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽(11)作為最終產(chǎn)品。
使用胞嘧啶代替現(xiàn)有技術(shù)中使用的苯甲酰胞嘧啶或其他保護(hù)的胞嘧啶，改善了經(jīng)濟(jì)性并簡(jiǎn)化了純化過(guò)程。
本發(fā)明的方法與類似的現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)勢(shì)在于，其使用的試劑可減少到約50％。即便是使用更少的試劑，與最接近的現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的方法的總產(chǎn)率卻得到提高，比如在一例中，產(chǎn)率由12％提高到38％。進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在減短了完成前藥合成的周期。與現(xiàn)有技術(shù)的合成相比較，本發(fā)明的改善的方法將周期簡(jiǎn)短了約80％。這主要是出于以下四個(gè)原因i)隨著負(fù)荷的增加，減少了所需反應(yīng)的批次；ii)百分產(chǎn)率的提高；iii)使用易于處理的溶劑和試劑；以及iv)避免了耗費(fèi)工時(shí)的色譜純化步驟。
本發(fā)明與眾不同的一個(gè)方面在于使用了特定組合的試劑，從而省去了合成步驟中的分離、離析和/或純化。特定試劑的選擇使得絕大多數(shù)的起始原料被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，并降低了外消旋化作用，能夠容易地從最終產(chǎn)物中除去，從而提供了比以往的方法更為有效的合成方法?？偟慕Y(jié)果是得到最終前藥產(chǎn)品的時(shí)間縮短，并且期望產(chǎn)品的百分產(chǎn)率提高。此外，需要更少的時(shí)間以及更少的試劑提高了整體成本效率和工業(yè)上可升級(jí)的和安全的方法。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，通過(guò)使2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯與還原劑如二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑如乙醇中反應(yīng)，得到了1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲?；蝗缓?，如果需要，則選擇性地保護(hù)(例如苯甲酰化)前步反應(yīng)中的呋喃核糖衍生化合物，形成1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲酰基。
使用Red-Al作為本發(fā)明的還原劑，出乎意料地提供了具有特定立體化學(xué)的產(chǎn)物，這就實(shí)現(xiàn)了有效分離。從而簡(jiǎn)化了最終期望產(chǎn)品的分離。
在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯通過(guò)使D-果糖與CaO反應(yīng)得到；
然后，如需要，則任選保護(hù)內(nèi)酯，例如，用苯甲酰氯(或其他合適當(dāng)酰氯)，形成2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯； 其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲?；?。
另外，為了分離純的單一的端基異構(gòu)產(chǎn)物(例如，實(shí)質(zhì)純的形式指的是至少95％)，可根據(jù)需要增加純化步驟。
本發(fā)明的方法采用了廉價(jià)的D-果糖作為起始原料，因此為生產(chǎn)者節(jié)省了大量的成本。這一點(diǎn)對(duì)于需要和預(yù)計(jì)擴(kuò)大工業(yè)應(yīng)用時(shí)尤其重要。
除了使用D-果糖作為起始原料帶來(lái)的重大的經(jīng)濟(jì)效益外，本發(fā)明與眾不同的一方面還在于使用氧化鈣(CaO)作為方法的第一步中的試劑。CaO被加入到D-果糖的水溶液中，制備2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯。這一步本身很快就完成，比起現(xiàn)有技術(shù)中的類似步驟提高了產(chǎn)率30-40％。此外，CaO無(wú)毒，易于使用，并與果糖和水混合良好。
可利用沉淀劑來(lái)從溶液中除去鈣。在一個(gè)實(shí)施方式中，向反應(yīng)混合物中加入CO2和比核糖酸強(qiáng)的酸，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，加入的是有機(jī)酸，形成碳酸鈣。適合的有機(jī)酸包括但不限于草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、馬來(lái)酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸。
此外，圖1和圖4結(jié)合起來(lái)的總過(guò)程的優(yōu)勢(shì)在于，與現(xiàn)有技術(shù)方法相比，其使用的試劑可減少到約50％。即便是使用更少的試劑，與最接近的現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的方法的總產(chǎn)率卻得到提高，比如在一例中，產(chǎn)率由12％提高到38％。進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在縮短了完成前藥合成的周期。與現(xiàn)有技術(shù)的合成相比較，本發(fā)明的改善的方法將周期簡(jiǎn)短了約80％。這主要是出于以下四個(gè)原因i)隨著負(fù)荷的增加，減少了所需反應(yīng)的批次；ii)百分產(chǎn)率的提高；iii)使用易于處理的溶劑和試劑；以及iv)避免了耗費(fèi)工時(shí)的色譜純化步驟。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，提供了由D-果糖制備2′-C-甲基-D-胞苷的方法，其包括以下步驟(a)使D-果糖CaO反應(yīng)，得到2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯； (b)如需要，則任選保護(hù)內(nèi)酯，例如，用苯甲酰氯(或其他合適當(dāng)酰氯)，形成2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯； 其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲?；?；(c)使2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯與還原劑如二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑如乙醇中反應(yīng)；
其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲?；?d)如果需要，則選擇性地保護(hù)(例如苯甲?；?前步反應(yīng)中的呋喃核糖衍生化合物，形成1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，?；?，優(yōu)選為苯甲酰基，(e)使1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶和活化劑，如BSA，任選在路易斯酸如SnCl4存在下反應(yīng)，生成4-氨基-1-(3，4-(獨(dú)立任選保護(hù)的-羥基)-5-O-保護(hù)-羥基-亞甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮 其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基，例如，酰基，優(yōu)選為苯甲酰基；然后，(f)如果需要，則選擇性地將前步反應(yīng)中的4-氨基-1-(3，4-(獨(dú)立任選保護(hù)的-羥基)-5-O-保護(hù)-羥基亞甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮脫去保護(hù)，形成4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)，
(g)如果需要，任選保護(hù)/脫保護(hù)，然后對(duì)4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(VI)的3′-位用L-纈氨酸等進(jìn)行酯化，得到β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，任選以鹽的形式存在。


圖1是制備1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖和2，3，5-三-O-保護(hù)-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯的優(yōu)選方法的示意圖。
圖2是制備2-C-甲基-β-D-核糖酸內(nèi)酯的選擇性方法的示意圖。
圖3是制備1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的供選方法的示意圖。
圖4是本發(fā)明的優(yōu)選的制備核苷、核苷類似物或其鹽或前藥的方法的示意圖。
圖5是制備β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-O-纈氨酸酯的藥學(xué)上可接受到的鹽的供選方法。
圖6示出了現(xiàn)有技術(shù)中已知道制備β-D-2′-C-甲基-胞苷的供選路徑。
具體實(shí)施例方式
提供了一種制備核苷和核苷類似物，如2′-C-甲基-核苷和2′-C-甲基-3′-O-纈氨酸核苷以及它們的鹽和/或前藥的方法，產(chǎn)物包括了所有的立體化學(xué)和互變異構(gòu)的形式。與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法使用更少的試劑，在更短時(shí)間內(nèi)獲得了更高的產(chǎn)率。并且，省去了耗時(shí)耗力的色譜純化步驟，并將不期望的外消旋化抑制到可接受到水平。該改良的方法包括形成期望的核苷作為前藥合成中的中間體，并且有望擴(kuò)大規(guī)模為符合工業(yè)生產(chǎn)的要求。
另外，還提供了一種有效的可擴(kuò)大規(guī)模制備2-C-甲基糖中間體，如2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內(nèi)酯)和1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖的合成方法。比起現(xiàn)有技術(shù)的方法而言，該方法采用了便宜的試劑，所需時(shí)間更短，純化方法更為簡(jiǎn)便，產(chǎn)率更高。
在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法是一種核苷的制備，其在2′-C上發(fā)生雙取代，如2′-甲基-核苷或2′-甲基-3′-O-纈氨酸-核苷，其中間體，例如2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(也稱作2-C-甲基-核糖酸內(nèi)酯)以及1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)和未保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖，和其鹽和/或前藥。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)或未保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)或未保護(hù)的2-C-甲基-D-呋喃核糖。在又一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明被用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯或其優(yōu)選的鹽酸鹽形式。由本發(fā)明制備的核苷、核苷類似物、鹽或酯前藥可用作制備各種其他核苷類似物的中間體，或者直接用作抗病毒和/或抗腫瘤試劑。
在第一實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法使用D-果糖作為起始原料，以簡(jiǎn)短的合成路徑制得了1，2，3，5-(獨(dú)立任選保護(hù)的)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
在第二實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法是一種核苷、核苷類似物以及其鹽或前藥的制備，它們?cè)?′-C上發(fā)生雙取代。
在第三實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法被用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮)。
在第四實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法被用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，或其優(yōu)選的鹽酸鹽形式。
由本發(fā)明制備的核苷、核苷類似物、鹽或酯前藥可用作制備各種其他核苷類似物的中間體，或者直接用作抗病毒和/或抗腫瘤試劑。
本發(fā)明的方法與類似的現(xiàn)有技術(shù)相比的優(yōu)勢(shì)在于，其使用的試劑比現(xiàn)有技術(shù)的少50％。即便是這樣，與最接近的現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的方法的總產(chǎn)率卻由12％提高到38％。進(jìn)一步的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在縮短了完成前藥合成的周期。再一優(yōu)勢(shì)在于該新方法的安全性和易升級(jí)性，有望成為符合工業(yè)生產(chǎn)的要求的方法。
本發(fā)明與眾不同的一個(gè)方面在于使用了特定組合的試劑，從而省去了合成步驟中中間體的分離、離析和/或純化。特定試劑的選擇使得絕大多數(shù)的起始原料被轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，并降低了氨基酸前藥部分的外消旋化作用，從而能夠容易地從最終產(chǎn)物中除去，從而提供了比以往的方法更為有效的合成方法。總的結(jié)果是得到最終前藥產(chǎn)品的時(shí)間縮短，并且期望產(chǎn)品的百分產(chǎn)率提高。此外，由于需要更少的時(shí)間以及更少的試劑，總的來(lái)說(shuō)，從節(jié)約成本考慮是有利的。成本效率和工業(yè)上可升級(jí)的和安全的方法。
本發(fā)明改進(jìn)方法的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在圖1中，使用D-果糖作為廉價(jià)的起始原料，以及使用CaO，其減少了反應(yīng)時(shí)間并增加了內(nèi)酯生產(chǎn)的百分產(chǎn)率；采用Red-Al/乙醇進(jìn)行還原，提供了端基異構(gòu)產(chǎn)物化合物的區(qū)域選擇混合物，能夠采用已知的方法容易地從該混合物中將最終產(chǎn)物1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖分離出；圖4中，采用胞嘧啶作為起始原料，而不是采用現(xiàn)有技術(shù)中的苯甲酰-胞嘧啶(圖5)或尿嘧啶(圖6)作為起始原料，這樣由于應(yīng)用了更為簡(jiǎn)單及分子量更低的較廉價(jià)的化合物，提高了過(guò)程的“原子效益(atom economy)”；與現(xiàn)有方法中類似步驟相比，本發(fā)明中需要更少當(dāng)量的胞嘧啶、SnCl4和BSA；由于反應(yīng)物和試劑均少于以往的當(dāng)量，帶給反應(yīng)雙重的好處，即，反應(yīng)用3到4小時(shí)即完成，且圖4中的中間體(2)的純度如此之高，而無(wú)需進(jìn)一步的色譜分離和純化步驟。
圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式的示意圖。在該改進(jìn)的方法中，由D-果糖形成核糖酸內(nèi)酯(化合物1)的時(shí)間大約為40小時(shí)或少于兩天，產(chǎn)品產(chǎn)率約為13.6％，其比最接近的現(xiàn)有技術(shù)的高30-40％。相比之，Kiliani和Scheibler的核糖酸內(nèi)酯合成各需要兩個(gè)月或更長(zhǎng)時(shí)間完成，且產(chǎn)品產(chǎn)率大約為10％(Lopez-Herrera et al.，J Carbohydrate Chemistry 1994，13(5)767-775 at 768)。
出乎意料的是，氧化鈣(CaO)和水能夠與廉價(jià)的起始原料D-果糖反應(yīng)，制備1，2，3，5-四-O-保護(hù)-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖，產(chǎn)率為比以前獲得到高30-40％。該方法能夠大量制備具有被保護(hù)的羥基的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖，其是在合成生物活性核苷以及某些維他命化合物中的重要的中間體。由此發(fā)現(xiàn)帶來(lái)的又一好處是節(jié)約產(chǎn)品的制備成本，這在大規(guī)模工業(yè)化合成中是特別重要的。例如，1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖通常是由D-核糖，通過(guò)使用D-樹(shù)膠醛醣作為起始原料制備的。從D-樹(shù)膠醛醣的合成需要至少5步和色譜純化。并且，每公斤D-樹(shù)膠醛醣的成本是D-果糖的約250倍！通過(guò)使用本發(fā)明的改進(jìn)的方法，只需要4步和廉價(jià)的試劑就可以制備出在1、2、3和5位有保護(hù)基的2-C-甲基-核糖。因此，無(wú)需進(jìn)行色譜純化即可以較低的成本有效地制得期望的產(chǎn)品。
同樣令人吃驚的是，當(dāng)使用CaO作為起始試劑時(shí)，顯著減少了形成2-C-甲基-β-D-核糖酸內(nèi)酯所需的時(shí)間。與Kiliani和Scheibler早期的使用Ca(OH)2作為反應(yīng)試劑的工作相比，這就顯著減少了合成所需的總的時(shí)間。
另外還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用Red-Al(任選其乙醇溶液)作為還原劑，產(chǎn)生的2，3，5-三-O-苯甲酰-1-羥基-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖被酰化時(shí)，產(chǎn)生大量的單一端基異構(gòu)產(chǎn)物，更容易實(shí)現(xiàn)有效分離。這就簡(jiǎn)化了對(duì)期望的最終產(chǎn)物的分離。
本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在如下方面選擇D-果糖作為廉價(jià)的起始原料對(duì)于制備最終的保護(hù)的糖類似物而言在經(jīng)濟(jì)上具有優(yōu)勢(shì)；使用CaO提高了產(chǎn)物產(chǎn)率、降低了內(nèi)酯產(chǎn)生的反應(yīng)時(shí)間；用Red-Al還原提供了端基異構(gòu)產(chǎn)物的區(qū)域選擇混合物，最終產(chǎn)物能夠容易地從其中通過(guò)通用方法得以分離。其他方面的優(yōu)勢(shì)包括，除使用廉價(jià)的起始試劑外，還使用了廉價(jià)的反應(yīng)試劑、在整個(gè)過(guò)程中處理中間體所需的步驟最少、只需使用本領(lǐng)域公知的通常的方法和設(shè)備，而避免了復(fù)雜的步驟和昂貴的裝置。
圖4是本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式的示意圖。該改進(jìn)方法的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在如下方面。采用胞嘧啶作為起始原料，而不是采用現(xiàn)有技術(shù)中的苯甲酰-胞嘧啶(圖5)或尿嘧啶(圖6)作為起始原料，這樣由于應(yīng)用了更為簡(jiǎn)單及分子量更低的較廉價(jià)的化合物，提高了過(guò)程的“原子效益”。此外，與現(xiàn)有方法中類似步驟相比，本發(fā)明中需要更少當(dāng)量的胞嘧啶、SnCl4和BSA；由于反應(yīng)物和試劑均少于以往的當(dāng)量，帶給反應(yīng)雙重的好處，即，反應(yīng)用3到4小時(shí)即完成，且圖4中的中間體(2)的純度如此之高，而無(wú)需進(jìn)一步的色譜分離和純化步驟。
令人吃驚的發(fā)現(xiàn)是，在本發(fā)明的脫保護(hù)步驟中(圖4，(5)→(6)，脫去苯甲酰保護(hù)基)，使用溶于MeOH的NaOMe帶來(lái)了比現(xiàn)有方法中使用氨(圖5，(5a)→(6))更為經(jīng)濟(jì)、安全、易用于工業(yè)升級(jí)的合成。另外的好處是出自更短的反應(yīng)時(shí)間使用甲醇鈉完成反應(yīng)需要約1小時(shí)，而同樣的反應(yīng)，使用氨則需要1-2天。此外，在本發(fā)明中，通過(guò)簡(jiǎn)單的甲醇或乙醇(優(yōu)選乙醇)處理，得到了高純度的(6)，從而免去了在現(xiàn)有方法中甚為關(guān)鍵但耗時(shí)耗力的色譜純化步驟(見(jiàn)圖5，(5a)→(6))。
除了更為簡(jiǎn)單、成本更低、使用的反應(yīng)物和試劑的安全性更高外，本發(fā)明方法的頭兩步的總的產(chǎn)品產(chǎn)率為85％，而圖5所示的現(xiàn)有方法中的為24％。在產(chǎn)生(7)的敏感的甲脒-保護(hù)步驟(圖4，(6)→(7))中，即使反應(yīng)負(fù)荷(reaction loading)從現(xiàn)有技術(shù)的5％增加到本發(fā)明的13％，產(chǎn)物產(chǎn)率仍維持在約80+％左右。
在現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)上的一個(gè)簡(jiǎn)單的改進(jìn)對(duì)接下來(lái)的兩步，甲硅烷-保護(hù)和BOC-酯偶聯(lián)，產(chǎn)生了正面的影響，生成了如(8)和(9)。首先，在現(xiàn)有技術(shù)中作為反應(yīng)溶劑的較貴且難除去的吡啶(圖5，(7)→(8))被二氯甲烷代替(圖4，(7)→(8))。在二氯甲烷中的甲硅烷化產(chǎn)生了更少的不期望的3′，5′-二甲硅烷基衍生物，因而能夠更好地控制甲硅烷基副產(chǎn)物地形成，且從(7)轉(zhuǎn)化為(8)的轉(zhuǎn)化率超過(guò)99％。并且由于二氯甲烷也被用作與BOC-Val-OH偶聯(lián)的溶劑，因此無(wú)需在(8)與BOC-Val-OH偶聯(lián)獲得(9)之前進(jìn)行分離。在(8)與BOC-Val-OH偶聯(lián)獲得(9)之前，只需要簡(jiǎn)單的萃取進(jìn)行收集即可(比較圖4，(8)→(9)與現(xiàn)有技術(shù)圖5中的相同步驟)。
進(jìn)而，現(xiàn)有技術(shù)方法采用了N，N-二甲基甲酰胺和乙腈作為BOC-Val-OH偶聯(lián)溶劑(圖5，(8)→(9a))。這些試劑均很貴，使得反應(yīng)的負(fù)荷率較低，僅約3％，并且，特別是N，N-二甲基甲酰胺沸點(diǎn)高，難從反應(yīng)混合物中除去。此外，大致需要兩天和過(guò)量的BOC-Val-OH、EDC和二甲基氨基吡啶(DMAP)來(lái)完成反應(yīng)。一方面需要這些過(guò)量的試劑來(lái)完成反應(yīng)，但另一方面它們的存在又使得后面的產(chǎn)物純化變得復(fù)雜。此外，使用過(guò)量的DMAP誘發(fā)了L-纈氨酸衍生物的氨基酸部分的外消旋化。
與現(xiàn)有技術(shù)的方法不同的是，在本發(fā)明中使用二氯甲烷作為偶聯(lián)反應(yīng)的溶劑(圖4，(8)→(9)使得負(fù)荷率約為11％，而僅用了現(xiàn)有技術(shù)中約一半量的試劑，且反應(yīng)在約4-6小時(shí)即完成。反應(yīng)時(shí)間上的減少和用于本發(fā)明的控制用量的DMAP將L-纈氨酸衍生物的氨基酸部分的外消旋化降低至少于0.2％，而這在現(xiàn)有技術(shù)中約為6％。像0.2％這樣如此低的外消旋水平進(jìn)一步處于藥學(xué)上可接受的范圍，因?yàn)檫@意味著一種對(duì)映體相對(duì)于另一對(duì)映體而言，具有更強(qiáng)的活性。
隨后的對(duì)酯化的β-D-2′-C-甲基-胞苷的脫保護(hù)可使用溶于甲醇的氟化胺(NH4F)。溶于甲醇的氟化胺(NH4F)是在由(9)反應(yīng)得到(10)中，用于化合物脫保護(hù)(即除去甲硅烷基和二甲基甲酰胺基)而選擇的試劑(圖4)。現(xiàn)有技術(shù)的方法(圖5，(9a)→(10))采用了相同的試劑，但用了10當(dāng)量的氟化胺，約3％的負(fù)荷率，需要色譜分離獲得(10)，相比而言，本發(fā)明使用4當(dāng)量的氟化胺，約10％的負(fù)荷率，不需要色譜分離。在改進(jìn)的方法的此步中，使用更少的氟化胺及大約10摩爾當(dāng)量的乙酸乙酯所帶來(lái)的好處是，BOC-酯(10)水解為β-D-2′-C-甲基-胞嘧啶，也確定為4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃2-基)-lH-嘧啶-2-酮(6)被降低到最小。因此，本發(fā)明的方法在其有效的試劑使用和提高負(fù)荷率上具有優(yōu)勢(shì)。
另外，(10)通過(guò)簡(jiǎn)單的EtOAc/TBME/H2O處理而純化，再次免去了色譜分離和純化，從而再次避免了耗時(shí)耗力的色譜純化步驟。在甲硅烷化、偶聯(lián)及脫保護(hù)這3步后的純的(10)的百分產(chǎn)率大約為60％-99％。
在改進(jìn)方法的最后一步，(圖4，(10)→(11))，用乙醇作為溶劑進(jìn)行從β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯衍生物脫除BOC-保護(hù)基，負(fù)荷率從現(xiàn)有技術(shù)的2％增加到本方法的12％。在改進(jìn)的方法中使用乙醇代替現(xiàn)有技術(shù)中的乙酸乙酯作為溶劑(圖5，(10)→(11))，這一改變使得負(fù)荷增加。選擇乙醇作為溶劑增加負(fù)荷率，進(jìn)而使反應(yīng)產(chǎn)率從現(xiàn)有技術(shù)的約80％提高到本發(fā)明的約95％，并避免了由乙酸乙酯產(chǎn)生的乙酸帶來(lái)的污染。獲得的最終產(chǎn)物(11)的＞98％的純的形式，且L-纈氨酸外消旋化被抑制到少于0.2％。
因此，本發(fā)明從整體上改進(jìn)的β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯)的原型化合物′-O-纈氨酸酯或其二鹽酸鹽的合成，使得總百分產(chǎn)率提高了約26％，周期降低了約80％。周期的減短主要?dú)w功于耗時(shí)耗力且耗費(fèi)大的色譜分離和純化步驟地避免。其他的因素包括負(fù)荷的增加，從而只需要進(jìn)行更少的批次，以及使用易于處理的溶劑和試劑。使用更安全更便宜的溶劑和試劑給本發(fā)明帶來(lái)了額外的好處。然而，如果產(chǎn)品的百分產(chǎn)率低于現(xiàn)有技術(shù)方法提供的產(chǎn)率，則這些好處可被忽視。本發(fā)明的方法提供了大約26％的產(chǎn)率的增加，因此非常有用。
定義和可選試劑在此使用的術(shù)語(yǔ)″基本上無(wú)端基異構(gòu)體″或″基本上沒(méi)有端基異構(gòu)體存在″是指包括至少95％～98％(重量)，更優(yōu)選為99％～100％(重量)的核苷的指定的端基異構(gòu)體的核苷組合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的方法和化合物中基本上無(wú)端基異構(gòu)體。
類似的，術(shù)語(yǔ)“被分離的”指的是包括至少85％或90％(重量)，優(yōu)選95％～98％(重量)，更優(yōu)選99％～100％(重量)核苷的核苷組合物，剩余部分含有其他化學(xué)物質(zhì)或端基異構(gòu)體。
術(shù)語(yǔ)″核糖酸-γ-內(nèi)酯″和″核糖酸內(nèi)酯″在本文中可互換使用，是指圖1中的化合物1或其氧保護(hù)的衍生物。
此處使用的術(shù)語(yǔ)“保護(hù)的”除非特別指明，是指加到氧、氮或磷原子上的基團(tuán)，以防止這些基團(tuán)進(jìn)一步反應(yīng)或出于其他目的。大量已知的各種氧、氮或磷的保護(hù)基在有機(jī)合成中被人們所熟知。
適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基的例子包括但不限于苯甲酰基；取代或未取代的烷基、取代或未取代的酰基、取代或未取代的甲硅烷基；取代或未取代的芳族或脂肪族酯、例如，芳基如苯甲?；?、甲苯?；?例如對(duì)甲苯?；?、硝基苯甲?；?、氯苯甲酰基；醚基如-C-O-芳烷基、-C-O-烷基、或-C-O-芳基；脂肪族基如?；蛞阴；?、包括任何取代或未取代的芳香族或脂肪族?；?、-(C＝O)-芳烷基、-(C＝O)-烷基、或-(C＝O)-芳基；其中，?；姆枷悴糠只蛑静糠挚梢詾橹辨溁蛑ф湥凰械木梢赃M(jìn)一步被不受含有改進(jìn)的合成的反應(yīng)影響的基團(tuán)所取代(見(jiàn)Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，2ndEdition(1991))。例如，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，保護(hù)基被不受選用的還原劑(優(yōu)選Red-Al)影響的基團(tuán)取代。對(duì)于使用醚作為保護(hù)基而言，引用Saischek等的U.S.6,229,008作為參考，其中報(bào)道了使用醚作為保護(hù)基對(duì)試劑的穩(wěn)定和過(guò)程的條件帶來(lái)明顯的好處，特別是在戊呋喃糖苷的5′位。這就最終為分離、離析及純化最終產(chǎn)物提供了便利，因此，提高了產(chǎn)物的百分產(chǎn)率。
糖羥基保護(hù)基的非限制性例子包括，甲硅烷基、苯甲?；?、對(duì)甲苯?；?、對(duì)硝基苯甲?；?、對(duì)氯苯甲?；?、酰基、乙?；?(C＝O)-烷基、和-(C＝O)-芳基，這些取代基都可以是未取代的或被一個(gè)或多個(gè)不受所選還原劑影響的基團(tuán)所取代。在一個(gè)實(shí)施方式中，糖羥基保護(hù)基是苯甲?；０被Ｗo(hù)基優(yōu)選為BOC(丁氧羰基)，-(C＝O)-芳烷基，-(C＝O)-烷基或-(C＝O)-芳基。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，氨基酸保護(hù)基是BOC(丁氧羰基)。
在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)″取代的″指由一個(gè)或多個(gè)指定的取代基進(jìn)行的單一或多重取代。在公開(kāi)或要求保護(hù)單一取代時(shí)，化合物可被取代基取代一次或多于一次。在公開(kāi)或要求保護(hù)多重取代時(shí)，被取代的化合物可獨(dú)立地被一個(gè)或多個(gè)公開(kāi)的或要求保護(hù)的取代部分單次或多次取代。
這里使用的術(shù)語(yǔ)″烷基″除非特別指明，是指典型的C1到C10的飽和的直鏈、支鏈或環(huán)狀的、一級(jí)、二級(jí)或三級(jí)烴，具體包括甲基、三氟甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、環(huán)戊基、異戊基、新戊基、己基、異己基、環(huán)己基、環(huán)己基甲基、甲基戊基和二甲基丁基。該術(shù)語(yǔ)包括取代和未取代的烷基?？稍谝粋€(gè)或多個(gè)位置取代烷基的部分選自由鹵素(包括氟、氯、溴或碘)、羥基(例如CH2OH)、氨基(例如，CH2NH2、CH2NHCH3或CH2N(CH3)2)、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、疊氮基(如CH2N3)、氰基(CH2CN)、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根)組成的組，如果需要，上述組中的任何一個(gè)或者所有的可以是未保護(hù)的或可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)而進(jìn)一步被保護(hù)，例如，在Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，2ndEdition(1991)中所教導(dǎo)的那樣。
術(shù)語(yǔ)″烷基氨基″和″芳基氨基″分別包括具有一個(gè)或多個(gè)烷基或芳基取代基的氨基。
術(shù)語(yǔ)″烷芳基″和″烷基芳基″包括具有芳基取代基的烷基。術(shù)語(yǔ)″芳烷基″和″芳基烷基″包括具有烷基取代基的芳基。
術(shù)語(yǔ)“鹵素”包括氯、溴、碘和氟。
這里使用的術(shù)語(yǔ)″芳基″，除非特別指明，是指苯基、聯(lián)苯基或萘基。該術(shù)語(yǔ)包括取代或未取代的部分。
芳基可被一個(gè)或多個(gè)部分取代，其包括但不限于羥基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸根、磷酸、磷酸根或膦酸根，如果需要，上述任何一個(gè)或者所有的可以是未保護(hù)的或可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)而進(jìn)一步被保護(hù)，例如，在Greene et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，JohnWiley and Sons，2ndEdition(1991)中所教導(dǎo)的那樣。
術(shù)語(yǔ)″酰基″包括-C(＝O)-R，其中的非羰基部分R是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀烷基或低級(jí)烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括卞基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基，包括任選被鹵素取代的苯基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基、磺酸根，如磺酸烷基根或磺酸芳烷基根，包括甲基磺?；?、單-、二-或三-磷酸根、三苯甲游基或單甲氧基三苯甲游基、取代的卞基、三烷基甲硅烷基，如二甲基-叔丁基甲硅烷基)、或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最好包含苯基。術(shù)語(yǔ)″低級(jí)酰基″指其非羰基部分是低級(jí)烷基的?；?br> 術(shù)語(yǔ)″羧酸″和″羧酸酯″分別包括結(jié)構(gòu)RC(＝O)OH和RC(＝O)O-R′。這里的非羰基部分，無(wú)論是R或R′，例如可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀烷基或低級(jí)烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括卞基)、芳氧基烷基如苯氧基甲基、芳基，包括任選被鹵素取代的苯基、C1～C4的烷基或C1～C4的烷氧基。磺酸根，如磺酸烷基根或磺酸芳烷基根，包括甲基磺?；?、二-或三-磷酸根、三苯甲游基或單甲氧基三苯甲游基、取代的卞基、三烷基甲硅烷基，如二甲基-叔丁基甲硅烷基)、或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最好包含苯基。在所有的情況下，R和R′可以是相同或不同的取代基。
術(shù)語(yǔ)氨基酸包括天然的和合成的α、β、γ和δ氨基酸，包括但不限于蛋白質(zhì)中的氨基酸、如甘氨酸、丙胺酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺酸、谷酰胺、天門(mén)冬胺酸酯、谷氨酸酯、賴氨酸、精氨酸和組氨酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，氨基酸是L-構(gòu)型。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，氨基酸是L-纈氨酸。另外，氨基酸也可以是丙氨酰、纈氨酰、亮氨酰、異亮氨酰、脯氨酰、苯基丙氨酰、色氨酰、蛋氨酰、甘氨酰、絲氨酰、蘇氨酰、半胱氨酰、酪氨酰、天冬酰胺酰、谷氨酰、aspartoyl酰、glutaroyl酰、賴氨酰、精氨酰、組氨酰、β-丙胺酰、β-纈氨酰、β-亮氨酰、β-異亮氨酰、β-脯氨酰、β-苯基丙氨酰、β-色氨酰、β-蛋氨酰、β-甘氨酰、β-絲氨酰、β-蘇氨酰、β-半胱氨酰、β-酪氨酰、β-天冬酰胺酰、β-谷氨酰、β-aspartoyl酰、β-glutaroyl酰、β-賴氨酰、β-精氨酰、β-組氨酰的衍生物。
術(shù)語(yǔ)“非天然氨基酸”指具有氨基端基但不存在于天然的羧酸。該術(shù)語(yǔ)還包括D-和L-氨基酸，以及它們的任何一種互變異構(gòu)或立體異構(gòu)形式。
術(shù)語(yǔ)核苷堿基，包括嘌呤或嘧啶堿基。嘌呤或嘧啶堿基的例子包括但不限于腺嘌呤、N6-烷基嘌呤、N6-酰基嘌呤(其中，?；荂(O)(烷基、芳基、烷芳基或芳烷基)、N6-卞基嘌呤、N6-鹵代嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙烯基嘌呤、N6-乙炔基嘌呤、N6-酰基嘌呤、N6-羥基烷基嘌呤、N6-硫代烷基嘌呤、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、6-氮嘧啶，包括6-氮胞嘧啶、2-和/或4-巰基嘧啶、尿嘧啶、5-鹵代尿嘧啶，包括5-氟尿嘧啶、C5-烷基嘧啶、C5-卞基嘧啶、C5-鹵代嘧啶、C5-乙烯基嘧啶、C5-乙炔基嘧啶、C5-?；奏?、C5-羥基烷基嘌呤、C5-氨基嘧啶、C5-氰基嘧啶、C5-硝基嘧啶、C5-氨基嘧啶、N2-烷基嘌呤、N2-烷基-6-硫代嘌呤、5-氮胞苷基、5-氮尿嘧啶基、疊氮基吡啶基、咪唑吡啶基、吡咯嘧啶基和吡唑-嘧啶基。嘌呤堿基包括但不限于鳥(niǎo)嘌呤、腺嘌呤、次黃嘌呤、2，6-二氨基嘌呤和6-氯嘌呤。堿基上的功能性氧和氮基團(tuán)如果需要可被保護(hù)。適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，包括三甲基甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲游基、烷基和酰基，如乙?；捅；谆酋；蛯?duì)甲苯磺酸。另外，嘌呤或嘧啶堿基也可以任選被取代，形成可行的前藥，能在體內(nèi)分裂。合適的取代基的例子包括?；糠?，胺或環(huán)丙基(例如，2-氨基，2，6-二氨基或環(huán)丙基鳥(niǎo)苷)。
用于本發(fā)明的方法或現(xiàn)有技術(shù)中的其他試劑的定義如下BSA(二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺)，TMSCl是氯代三甲基硅烷；TFAA是三氟乙酸酐；TBDPSCl是叔丁基二苯基甲硅烷基氯；TBDMSCl是叔丁基二甲基甲硅烷基氯；DCM是二氯甲烷。
本發(fā)明的方法不限于使用核苷、保護(hù)的氨基酸酯和示例的試劑。對(duì)本發(fā)明的適合的可選試劑可用于替代上述的試劑。例如，TEA(三乙胺)可被其他適合的胺代替，其包括但不限于二異丙基乙胺、N-乙基嗎啉或其他的三級(jí)脂肪胺；DME(1，2-二甲氧基乙烷)可被任何適合的極性非質(zhì)子溶劑代替，例如THF(四氫呋喃)或其他的醚；Red-Al/EtOH(二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉/乙醇)的甲苯溶液可被NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氫催化劑或LiAl(OtBu)3H(三叔丁氧基氫化鋁鋰)代替，所有的這些都產(chǎn)生了化學(xué)選擇和區(qū)域選擇還原，唯獨(dú)LiAlH4產(chǎn)生了開(kāi)鏈的二醇。在加入MgSO4前后用THF洗產(chǎn)物漿液可以替代為在丙酮中洗。確實(shí)，在規(guī)模擴(kuò)大時(shí)，丙酮是一種優(yōu)選的溶劑。
此外，盡管DMF在容易處理和易于從反應(yīng)混合物中除去上是優(yōu)選的，但DMF(二甲基甲酰胺)可被任何極性溶劑代替，例如，DMSO(二甲亞砜)。EDC(1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基-碳二酰亞胺氯化氫)；也被稱為DEC)可被任何能進(jìn)行偶聯(lián)的試劑代替，其包括但不限于CDI(羰基二咪唑)、BOP試劑(苯并三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)-膦六氟磷酸鹽)，或已知的類似偶聯(lián)試劑。盡管SnCl4是優(yōu)選的，但這里可用路易斯酸代替。路易斯酸包括但不限于SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3、SnCl2及它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，路易斯酸是SnCl4?？捎萌魏蔚挠袡C(jī)溶劑如甲苯等替代乙腈。任何的活化劑，如甲硅烷試劑均可用于使核苷活化進(jìn)行偶聯(lián)。HMDS(六甲基二硅氮烷)、TMSCl或TBDPSCl等均可用于代替BSA(二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺)。氨可用于替代溶于甲醇的甲醇鈉，任何極性溶劑DMSO可代替DMF。多種其他甲硅烷化試劑均可代替TBDPSCl，任何氟鹽均可代替NH4F，并且其他的酸如TFA可用于代替HCl。
制備方法步驟的詳細(xì)描述核糖酸內(nèi)酯的制備 核糖酸內(nèi)酯可通過(guò)任何發(fā)表的或未發(fā)表的方法，包括標(biāo)準(zhǔn)的氧化和取代技術(shù)制備。本發(fā)明的合成核糖酸內(nèi)酯的一個(gè)實(shí)施方式是通過(guò)D-果糖，按照以下的步驟進(jìn)行。
核糖酸內(nèi)酯可通過(guò)D-果糖與氧化鈣(CaO)的反應(yīng)制得。D-果糖可與CaO以任意摩爾比例進(jìn)行反應(yīng)，條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而無(wú)過(guò)多的副產(chǎn)物，對(duì)D-果糖，優(yōu)選的摩爾比率是5∶1，更優(yōu)選的摩爾比率是3∶1，最優(yōu)選的摩爾比率是2.3∶1.3。CaO可以任何速率加入，條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的熱或過(guò)多的副產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，CaO在室溫下5分鐘內(nèi)遞增加入。反應(yīng)可一直進(jìn)行到D-果糖幾乎被消耗完，例如進(jìn)行6～22小時(shí)，其間，反應(yīng)進(jìn)程可被監(jiān)控，例如定期取出一定量用于TLC分析。
反應(yīng)可在任何溫度下進(jìn)行，條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)促使分解或過(guò)量的副產(chǎn)物的產(chǎn)生。優(yōu)選的溫度是從室溫到約23～40℃。
可利用沉淀劑來(lái)從溶液中除去鈣。在一個(gè)實(shí)施方式中，向反應(yīng)混合物中加入CO2和比核糖酸強(qiáng)的酸，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，加入的是有機(jī)酸，形成碳酸鈣。適合的有機(jī)酸包括但不限于草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、馬來(lái)酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸。
因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，在反應(yīng)結(jié)束階段，可在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)向混合物中鼓入CO2，例如，2～3小時(shí)，以將pH從堿性降低到中性水平。任何在中和步驟中形成的CaCO3均可被除去，例如通過(guò)真空過(guò)濾除去。
然后，水層可用酸處理，所用的酸例如為比核酸強(qiáng)的有機(jī)酸，例如，草酸，其摩爾比率可以為任意比例，條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，添加的酸(例如草酸)與D-果糖的摩爾比率為1∶2。
反應(yīng)可進(jìn)行到幾乎所有的鈣都發(fā)生沉積的程度，這里包括在任何溫度下，以可接受的速度從溶液中沉積出，而不會(huì)促使分解或形成過(guò)量的副產(chǎn)物。例如，在室溫或25℃左右攪拌溶液約30分鐘，至出現(xiàn)白色的槳液。然后在約45～50℃攪拌該槳液過(guò)夜。
完成后，可蒸發(fā)溶液，例如在減壓下進(jìn)行，以除去決大部分的水但仍留下液體混合物。產(chǎn)物可用已知方法從液體混合物中分離出。例如，可在室溫下約30分鐘內(nèi)向槳液中加入NaCl和有機(jī)溶劑，如THF。分離形成的各層，向水層中加入THF等新鮮的溶劑，再攪拌約10分鐘。加入溶劑、攪拌和分離所得水層的步驟可根據(jù)需要而重復(fù)多次，例如可重復(fù)3次。最后，可合并有機(jī)溶液，并加入MgSO4等干燥劑后攪拌約30分鐘，然后過(guò)濾，再用溶劑如THF洗。濾液可蒸發(fā)，例如在40℃下減壓蒸發(fā)，然后可收集粗產(chǎn)物，其為深橙色的半固體物質(zhì)。
另外，為純化產(chǎn)物，也可向粗產(chǎn)物中加入丙酮等第二種溶劑，混合物在20℃攪拌3小時(shí)?？赏ㄟ^(guò)真空過(guò)濾收集白色結(jié)晶的核糖酸內(nèi)酯產(chǎn)物，并用如丙酮之類的第二種溶劑洗，并真空干燥(見(jiàn)圖1，化合物1)。
該反應(yīng)的產(chǎn)品產(chǎn)率可達(dá)到約13.6％，比現(xiàn)有技術(shù)的大約提高了4％。
核糖酸內(nèi)酯的自由羥基可繼續(xù)被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基選擇性地保護(hù)，優(yōu)選的保護(hù)基是酰基或甲硅烷基，保護(hù)方法可采用本領(lǐng)域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教導(dǎo)的方法。例如，可在室溫下使氯代叔丁基二苯基硅烷與核糖酸內(nèi)酯在無(wú)水吡啶中反應(yīng)。也可以用酰氯，如苯甲酰氯與核糖酸內(nèi)酯優(yōu)選在堿存在下在DME中回流的條件下反應(yīng)。
例如，核糖酸內(nèi)酯產(chǎn)物可與如DMAP等堿以任意摩爾比率混合，條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方式中，核糖酸內(nèi)酯∶堿(例如DMAP)的摩爾比率約為5∶1。任選通過(guò)使用額外的堿來(lái)促進(jìn)反應(yīng)，例如，以任意的比率使用TEA，但條件是反應(yīng)以能夠接受到速的率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用過(guò)量的額外的堿(例如TEA)。在足夠長(zhǎng)的時(shí)間后，以任意的摩爾比率加入苯甲酰氯等酰氯，使得反應(yīng)以可接受的速率進(jìn)行，而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的副產(chǎn)物。與核糖酸內(nèi)酯的摩爾比率大約為5∶1。
核糖酸內(nèi)酯可在任意的溶劑中制備，只要該溶劑滿足溫度和反應(yīng)試劑的溶解度的要求即可。溶劑可由任意的非質(zhì)子溶劑構(gòu)成，其包括但不限于烷基溶劑，如己烷和環(huán)己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF、二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、DME、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或其任意組合，但優(yōu)選使用DME。
反應(yīng)可在任意溫度下以能夠接受的速率完成，但條件是不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。優(yōu)選的溫度范圍是從室溫到約5℃。
然后，可向反應(yīng)混合物中加入冰水，其后收集粗產(chǎn)物，在叔丁基甲醚等合適的溶劑中攪拌、過(guò)濾、洗滌，并通過(guò)真空等進(jìn)行干燥。
為了進(jìn)行比較，圖2中給出了現(xiàn)有技術(shù)中Kiliani的制備核糖酸內(nèi)酯的方法。Kiliani方法的詳細(xì)描述在Sowden的Adv.In Carbohydrate Chem.1957，1243中給出，其中教導(dǎo)到，加入Ca(OH)2后14天再次加入，然后混合物放置1～2個(gè)月，期間偶爾搖動(dòng)搖動(dòng)。然后，過(guò)濾混合物，濾液用CO2飽和。接著，通過(guò)加入完全等當(dāng)量的草酸，使鈣離子沉淀，過(guò)濾溶液，濃縮成槳液，再在低溫條件下待該槳液結(jié)晶幾天。最后，將母液從結(jié)晶體中分離，再用水溶解結(jié)晶體并進(jìn)行重結(jié)晶。
保護(hù)的核糖酸內(nèi)酯的還原 由前述步驟得到的任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯可用任何適當(dāng)?shù)倪€原劑進(jìn)行還原，所用還原劑的摩爾比率任選，但條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)倪€原劑包括但不限于Red-Al/EtOH(二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉/乙醇)、NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氫催化劑或LiAl(OtBu)3H(三叔丁氧基氫化鋁鋰)代替，所有的這些都產(chǎn)生了化學(xué)選擇和區(qū)域選擇還原。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，還原劑是Red-Al/乙醇。例如，Red-Al溶液可被加入到任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯溶液中，其中，Red-Al與2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯的摩爾比率約為2∶1。
有趣的是，發(fā)現(xiàn)了某些試劑并不理想，在用于本發(fā)明方法的過(guò)程中產(chǎn)生了期望的和不期望的產(chǎn)物的混合物。例如，當(dāng)用LiAI(Ot-Bu)3H代替Red-Al的乙醇溶液時(shí)，LiAI(Ot-Bu)3H使得反應(yīng)變慢，并形成了多種不期望的產(chǎn)物。類似的，9-硼二環(huán)-[3.3.1]-壬烷、9-BBN和二異丁基氫氧化鋁、DIBALH不發(fā)生反應(yīng)，或者只產(chǎn)生非常少量的期望的產(chǎn)品。
反應(yīng)可在任何溫度下完成，但條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。優(yōu)選的溫度是從約0℃～5℃。
呋喃核糖可在任何滿足溫度和試劑溶解性要求的溶劑中制備。溶劑可包括任意的有機(jī)溶劑，包括但不限于烷基溶劑，如戊烷、己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、DME、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺、醇類溶劑，如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇、戊醇和辛醇，或它們的組合，但優(yōu)選的是無(wú)水甲苯和無(wú)水乙醇溶液。
可用合適的質(zhì)子源，如丙酮、水和1NHCl使反應(yīng)結(jié)束?；旌衔锟捎糜袡C(jī)溶劑如乙酸乙酯萃取，用鹽水洗、干燥、在減壓約40℃下除去溶劑。
然后，呋喃核糖的自由羥基可用合適的保護(hù)基進(jìn)行選擇性保護(hù)，優(yōu)選的保護(hù)基是?；蚣坠柰榛Ｗo(hù)方法可采用本領(lǐng)域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教導(dǎo)的方法。例如可在室溫下使氯代叔丁基二苯基硅烷與呋喃核糖在無(wú)水吡啶中反應(yīng)。也可以用酰氯，如苯甲酰氯與呋喃核糖優(yōu)選在堿存在下在DME中回流的條件下反應(yīng)。
圖3是Harry-O′kuru et al，J.Org.Chem.，(1997)，62(6)1754-59中提供的可替換方法。該方法缺少內(nèi)酯中間體，但用于獲得與本發(fā)明相同的產(chǎn)物。Harry-O′kuru的方法利用了除C2位外的所有的羥基均在形成酮之前被保護(hù)了的D-樹(shù)膠醛醣或D-核糖(圖3)。被保護(hù)了的糖與Dess-Martin periodinane試劑在CH2Cl2和MgSO4中反應(yīng)，得到2，4-二-O-苯甲酰-5-甲基-O-苯甲酰-二氫呋喃-3-酮，然后再用MeTiCl3，MeMgBr/TiCl4(或RCeCl2，其中，R將是核糖C2上的取代基)進(jìn)行還原。化合物(3)和4(4a)與BzCl/DMAP/Et3N的反應(yīng)產(chǎn)生了最終產(chǎn)物(4b)，1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-R-核糖呋喃糖苷。需要注意的是，在第一步中，目標(biāo)產(chǎn)物的水合物大量產(chǎn)生，需要與過(guò)量的MgSO4反應(yīng)以制備基本上完全干燥的酮產(chǎn)物。并且，已觀察到，在關(guān)鍵中間體2-酮與有機(jī)鈦試劑反應(yīng)中，產(chǎn)生了期望的1，3，5-苯甲酰-保護(hù)的-2-烷基核糖呋喃糖苷和其酯交換的2，3，5-苯甲酰-保護(hù)的核糖呋喃糖苷的α-和β異構(gòu)體的混合物。由于三種產(chǎn)物對(duì)于該作者均有用，所以這對(duì)他們而言無(wú)關(guān)緊要。這樣的合成就需要額外的分離步驟來(lái)獲得單一定異構(gòu)體(J.Org.Chem.，1997，62(6)1754-9，at 1755)。無(wú)論是D-樹(shù)膠醛醣或D-核糖均可用作此目的的起始原料，但使用D-樹(shù)膠醛醣時(shí)不得不考慮到其經(jīng)濟(jì)性，其費(fèi)用大約為使用D-果糖的250倍！圖3中的現(xiàn)有技術(shù)的方法與本發(fā)明的區(qū)別在于，除C2位外，D-樹(shù)膠醛醣或D-核糖的所有的羥基均在形成酮之前被保護(hù)。然后，通過(guò)與Dess-Martinperiodinane(見(jiàn)圖3，化合物3)試劑反應(yīng)，在起始化合物的C2上形成了酮，接著被MeTiCl3或RCeCl2還原，其中的R是將要取代核糖C2上的第二取代基。(見(jiàn)圖3，化合物3和4)。最終產(chǎn)物1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-烷基-核糖呋喃糖苷的產(chǎn)率約為79％。
相比而言，本發(fā)明的方法更為有效，其提供的內(nèi)酯形成于呋喃核糖的C1，對(duì)C2，C3和C5進(jìn)行羥基保護(hù)，優(yōu)選用Red-Al在乙醇內(nèi)還原內(nèi)酯，產(chǎn)生區(qū)域選擇的易于分離的端基異構(gòu)產(chǎn)物，然后對(duì)位于呋喃核糖的C1的單獨(dú)的剩余自由羥基進(jìn)行保護(hù)。
呋喃核糖與活化的胞嘧啶的縮合反應(yīng) 由前步得到的或由其他已知方法得到的任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸呋喃糖可用任何公知的方法與核苷堿偶聯(lián)，這些方法包括采用活化堿的標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)技術(shù)。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括按照以下步驟進(jìn)行的合成β-D-2′-C-甲基-胞苷的方法。
β-D-2′-C-甲基-胞苷可通過(guò)使2-C-甲基-D-核糖酸呋喃糖與活化的未保護(hù)的(如未苯甲?；?胞嘧啶反應(yīng)而得到，這樣的胞嘧啶可以是如用活化劑活化的胞嘧啶，例如甲硅烷化試劑，其包括但不限于BSA((N，O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺)、HMDS、TMSCl或TBDPSCl。在一個(gè)實(shí)施方式中，甲硅烷化試劑是BSA。
反應(yīng)可任選在如SnCl4這樣的路易斯酸存在下進(jìn)行，所用路易斯酸的摩爾比率任選，但條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的副產(chǎn)物。合適當(dāng)路易斯酸包括但不限于SnCl4、BF3、AlCl3，TiCl2，TiCl4，F(xiàn)eCl3，SnCl2及它們的混合物。在一個(gè)實(shí)施方式中，路易斯酸是SnCl4。
β-D-2′-C-甲基-胞苷可在任何滿足溫度和試劑溶解性要求的溶劑中制備。溶劑可包括任意的非質(zhì)子溶劑，包括但不限于烷基溶劑，如己烷和環(huán)己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它們的組合，但優(yōu)選的是乙腈。
該反應(yīng)可在任何溫度下完成，但條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)促使分解或過(guò)多的副產(chǎn)物。優(yōu)選的溫度是約20℃～80℃。
然后，核苷可用已知道方法進(jìn)行脫保護(hù)，脫保護(hù)的方法可采用本領(lǐng)域公知的方法，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley andSons，Second Edition，1991中教導(dǎo)的方法。例如，苯甲酰保護(hù)的羥基部分可用NaOMe的MeOH溶液在約室溫下脫去保護(hù)。
圖5中表示的現(xiàn)有技術(shù)的方法包括使苯甲酰胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈與1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反應(yīng)，形成4-苯甲酰氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(5a)；使(5a)與NH3在甲醇中反應(yīng)并用色譜分離產(chǎn)物，4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(6)，也稱為β-D-2′-C-甲基-胞苷；使(6)與Me2NCH(OMe)2在DMF中室溫下反應(yīng)1.5小時(shí)，形成N[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(7)，使(7)與TBDPSCl和吡啶在室溫下反應(yīng)6小時(shí)形成N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(8)；使(8)與N-Boc-L-纈氨酸、DEC和DMAP在THF/DMF中于室溫下反應(yīng)2天，并將由該反應(yīng)得到的產(chǎn)物通過(guò)HPLC獲得2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(9a)；將(9a)與NH4F在MeOH中回流約3小時(shí)，以除去甲硅烷基和氨基保護(hù)基，并將產(chǎn)物進(jìn)行色譜純化，得到2-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸-5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥基甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(10)；最后，使(10)與HCl在EtOAc中于室溫下反應(yīng)得到2-氨基-3-甲基-丁酸-5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥基甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽(11)作為最終產(chǎn)物。÷圖6在這里是作為現(xiàn)有技術(shù)中用于制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)的另一供選方法。該現(xiàn)有技術(shù)方法利用了尿嘧啶作為起始原料，并包含使尿嘧啶與BSA在乙腈中與1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反應(yīng)約30分鐘，在乙腈種加入路易斯酸SnCl4，將所得溶液回流約4小時(shí)，色譜分離產(chǎn)物1-(3，4-二卞氧基-5-卞氧基-甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(12)；使(12)與NaOMe在甲醇種反應(yīng)約4.5小時(shí)，以除去苯甲酰保護(hù)基，然后分離和結(jié)晶產(chǎn)物1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2，4-二酮(13)，也被稱為β-D-2′-C-甲基-尿苷；最有，使(13)順次與TMSCl和N-甲基吡咯烷在CH3CN中反應(yīng)約3.5小時(shí)，冷卻并在約30分鐘內(nèi)加入三氟乙酸酐(TFAA)，在0℃加入4-硝基苯酚，攪拌約3小時(shí)，加入NH4OH的二噁烷并加熱到50℃，過(guò)夜后，通過(guò)色譜方法和結(jié)晶分離最終產(chǎn)β-D-2′-C-甲基-胞苷(6)。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的酯化由前述步驟或任何已知方法獲得的任選保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷可通過(guò)已知道任何方法進(jìn)行酯化。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括合成β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯的方法，特別是以下的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯的方法。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-酯可通過(guò)采用任何已知的方法任選保護(hù)β-D-2′-C-甲基-胞苷的氨基而制得。例如在Greene，et al.，Protective Groups in OrganicSynthesis，John Wiley and Sons，Second Edition，1991中教導(dǎo)的方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，β-D-2′-C-甲基-胞苷可與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應(yīng)，產(chǎn)生N[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒。
在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，化合物可進(jìn)一步用TBDPSCl和咪唑進(jìn)行保護(hù)，提供5′-甲硅烷基-保護(hù)的化合物，N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲脒，反應(yīng)可在任意溶劑中進(jìn)行，條件是其與溫度和試劑的溶解性相適合。溶劑可包括任何非質(zhì)子溶劑，包括但不限烷基溶劑，如己烷和環(huán)己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它們的任意組合，但優(yōu)選DCM。
然后，任選保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷可與任何適合的結(jié)構(gòu)偶聯(lián)得到藥學(xué)上可接受的β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-前藥，偶聯(lián)可使用已知的任何方法進(jìn)行，包括標(biāo)準(zhǔn)縮合反應(yīng)。被偶聯(lián)的部分可以是磷酸根(包括單-、二-或三-磷酸根以及穩(wěn)定的磷酸根)；直鏈的、支鏈的或環(huán)狀烷基(包括低級(jí)烷基)；酰基(包括低級(jí)?；?；CO-烷基、CO-酰基、CO-烷氧基烷基、CO-烷氧基烷基、CO-取代的芳基、磺酸酯(包括磺酸烷基酯或磺酸芳烷基酯，包括甲基磺酰基)；卞基，其中的苯基被一個(gè)或多個(gè)在芳基定義中描述的取代基任選取代；烷基磺酰基、芳基磺酰基、芳烷基磺?；?、脂質(zhì)(包括磷脂)；氨基酸；碳水化合物；肽；膽固醇或藥學(xué)上可接受的離去基團(tuán)，當(dāng)體內(nèi)施用時(shí)，其能提供自由羥基(或磷酸根)。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，期望的3′-前藥是β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯，可通過(guò)以下步驟制備。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯可通過(guò)使任選保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷(例如5′-和N-保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷)與N-Boc-L-纈氨酸優(yōu)選在偶聯(lián)劑，如EDC及堿如DMAP存在下反應(yīng)，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基-甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯而制備。
β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯可在任何滿足溫度和試劑溶解性要求的溶劑中制備。溶劑可包括任意的非質(zhì)子溶劑，包括但不限于烷基溶劑，如己烷和環(huán)己烷、甲苯、丙酮、乙酸乙酯、二噻烷、THF，二噁烷、乙腈、二氯甲烷(DCM)、二氯乙烷、二乙醚、吡啶、二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)、二甲基乙酰胺或它們的任意組合，但優(yōu)選的是DCM。
該反應(yīng)可在任何溫度下完成，但條件是反應(yīng)以能夠接受的速率進(jìn)行而不會(huì)促使分解或過(guò)多的副產(chǎn)物。優(yōu)選的溫度是在室溫附近。
然后，β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯可用已知的方法脫去保護(hù)，例如在Greene，et al.，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley and Sons，SecondEdition，1991中教導(dǎo)的方法。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式
中，叔丁基二苯基甲硅烷基保護(hù)的5′-OH和N Boc-保護(hù)的L-纈氨酸可用NH4F在MeOH中，在大約10摩爾當(dāng)量的乙酸乙酯存在下(為防止析出的氨切斷′-O-纈氨酸酯)，回流混合物得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，從而脫去保護(hù)。
3′-纈氨酸酯可用已知的方法轉(zhuǎn)化為鹽，這些方法包括使β-D-2′-C-甲基-胞苷的3′-纈氨酸酯與HCl在EtOH中反應(yīng)，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽，作為最終產(chǎn)物。
優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選定實(shí)施方式在圖1中示出，其包括使D-果糖在CaO/水存在下于23-40℃反應(yīng)6-22小時(shí)，然后向反應(yīng)混合物中加入CO2和草酸，使反應(yīng)進(jìn)行8-12小時(shí)，形成2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(1)；使2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(1)與4-二甲基氨基吡啶(DMAP)與三乙胺(TEA)在1，2-二甲氧基乙烷(DME)中于5-25℃反應(yīng)約30分鐘，冷卻混合物至約5℃。加入苯甲酰氯，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(2)；使2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯(2)與Red-Al/乙醇在甲苯中于-5～0℃下反應(yīng)約40分鐘，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(3)，最后在DMAP和DME存在下，向2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(3)的冷溶液中，加入苯甲酰氯/TEA，在約5～50℃下使反應(yīng)進(jìn)行約4小時(shí)到約12小時(shí)，得到最終產(chǎn)物(4)，2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
具體而言，D-果糖的水溶液在室溫下調(diào)制，加入到其中的CaO的優(yōu)選摩爾比率為5∶1，更優(yōu)選為3∶1，最優(yōu)選為2.3∶1.3，加入方式為5分鐘內(nèi)漸增加入。反應(yīng)于23～40℃下進(jìn)行6～22小時(shí)，定期取出反應(yīng)液進(jìn)行TLC分析。
在反應(yīng)周期結(jié)束之際，可在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間內(nèi)向混合物中鼓入CO2約2～3小時(shí)，以將pH從堿性降低到中性水平。任何在中和步驟中形成的CaCO3均可被除去，例如通過(guò)真空過(guò)濾除去。合并水層，并用草酸(或其他有機(jī)酸)和D-果糖以1∶2的摩爾比率處理，在25℃攪拌約30分鐘直到出現(xiàn)白色漿液。然后，于45-50℃攪拌該漿液過(guò)夜，減壓下蒸餾除去絕大部分的水，得到仍為液體狀態(tài)的混合物。室溫下向漿液中加入NaCl和THF，攪拌約30分鐘。分離所得的層，將水層加入到新鮮的THF中，另攪拌10分鐘。加入THF、攪拌和分離所得液體層的過(guò)程重復(fù)3次。最后，合并所有的THF溶液，與無(wú)水MgSO4一同攪拌30分鐘，過(guò)濾混合物，用THF洗MgSO4濾餅。濾液在約40℃下減壓蒸餾，收集粗產(chǎn)物，為深橙色半固體狀。
然后，向粗產(chǎn)物中加入丙酮，混合物在20℃下攪拌3小時(shí)。真空過(guò)濾收集白色結(jié)晶的核糖酸內(nèi)酯產(chǎn)物，用丙酮洗并真空干燥(見(jiàn)圖1，化合物1，流程1)。該反應(yīng)的產(chǎn)物產(chǎn)率約為13.6％，與現(xiàn)有技術(shù)相比較而言，提高了近4％。
然后，獲得的核糖酸內(nèi)酯產(chǎn)物與DMAP以摩爾比率約5∶1(核糖酸內(nèi)酯∶DMAP)、過(guò)量的TEA和DME混合，室溫下攪拌約30分鐘。所得的懸浮液冷卻到5℃，以與核糖酸內(nèi)酯約5∶1的比率加入苯甲酰氯。室溫下攪拌混合物約4小時(shí)，直到通過(guò)TLC確認(rèn)起始原料已消耗完。然后，向反應(yīng)混合物中加入冰水并攪拌約30分鐘，接著，收集粗產(chǎn)物，與叔丁基甲基醚攪拌、過(guò)濾、洗滌并真空干燥。收集到的白色固體是2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯，產(chǎn)率為83.4％，純度接近98％(見(jiàn)圖1，化合物2)。
由先前步驟獲得的2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯被冷卻到約-5℃，向其中加入事先在0℃混合的Red-Al的無(wú)水甲苯和無(wú)水乙醇的溶液。Red-Al與2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯的摩爾比率約為2∶1?；旌衔锉３衷?5℃攪拌約40分鐘。從混合物取出樣液用于TLC和/或HPLC分析，以確認(rèn)起始原料是否消耗完，然后用丙酮、水和1N HCl使反應(yīng)結(jié)束，恢復(fù)至室溫。最后，混合物用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗、干燥，在約40℃下減壓除去溶劑。所得產(chǎn)物2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-呋喃核糖的產(chǎn)率是以在該步驟開(kāi)始時(shí)使用的2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-γ內(nèi)酯的量為基準(zhǔn)的定量產(chǎn)率。(見(jiàn)圖1，化合物3)。
呋喃核糖C-1的保護(hù)基緊接著在下一步形成。苯甲酰氯以大約2∶1的摩爾比率加入到5℃的2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-呋喃核糖的溶液中，同時(shí)加入的還有溶于無(wú)水DME的DMAP和TEA。攪拌反應(yīng)并過(guò)夜，然后，用冰水和碳酸鈉水溶液使反應(yīng)結(jié)束。然后，除去THF，混合物用乙酸乙酯萃取。洗滌、干燥和去除溶劑后產(chǎn)生稠的油狀產(chǎn)物。向其中加入叔丁基甲醚、庚烷和水，在約20℃攪拌約2小時(shí)。洗滌和真空干燥后，最終產(chǎn)物1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的產(chǎn)率為52％，純度大于98％(見(jiàn)圖1，化合物4，流程1)。
本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式示于圖4，包括使胞嘧啶、BSA和SnCl4/乙腈與本發(fā)明第一實(shí)施方式中的1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(4)反應(yīng)，得到4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(5)；使(5)與NaOMe/MeOH反應(yīng)，得到(4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-C-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(6)，也被稱為β-D-2′-C-甲基-胞苷。使用胞嘧啶作為起始原料而不是苯甲酰-胞嘧啶，提高了過(guò)程的“原子效益”，并簡(jiǎn)化了后續(xù)步驟中的純化。
合成可以(6)的形成而終結(jié)，產(chǎn)物通過(guò)已知的方法進(jìn)行分離。另外，還可進(jìn)一步進(jìn)行合成，制備β-D-2′-C-甲基-胞苷(2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-4-C-甲基-2-羥甲基-四氫呋喃-3-基酯)的3′-O-纈氨酸酯，或者其優(yōu)選的鹽酸鹽形式，本發(fā)明的第四優(yōu)選實(shí)施方式。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方式中，化合物(6)與Me2NCH(OMe)2在DMF中反應(yīng)，形成(7)，N-[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒，其是(6)的氨基酸-保護(hù)形式；使(7)與TBDPSCl和咪唑在DCM中反應(yīng)，得到(7)的5′-甲硅烷基-保護(hù)的形式，即N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(8)，其中，使用DCM的好處是對(duì)二甲硅烷副產(chǎn)物的形成有更佳的控制；使(8)與N-Boc-L-纈氨酸、EDC和DMAP在DCM中于室溫下反應(yīng)，形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基-甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(9)；通過(guò)使(9)與NH4F在MeOH中在大約10摩爾當(dāng)量的乙酸乙酯(為防止析出的氨切斷3′-O-纈氨酸酯)存在下反應(yīng)，除去甲硅烷基和氨基-保護(hù)基，并回流混合物，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(10)；最后，使(10)與HCl在EtOH中反應(yīng)，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，二鹽酸鹽(11)作為最終產(chǎn)品。
本發(fā)明進(jìn)一步示例于以下的非限制性實(shí)施例中。這里給出的這些實(shí)例是為了幫助對(duì)發(fā)明的理解。它們對(duì)本發(fā)明方法和產(chǎn)品的描述不應(yīng)理解為對(duì)權(quán)利要求中限定的本發(fā)明構(gòu)成任何限制。在不脫離本發(fā)明精神的前提下，等同物、類似或適合的溶劑、試劑或反應(yīng)條件可被替換為此處描述的那些特定的溶劑、試劑和/或反應(yīng)條件。
實(shí)施例實(shí)施例12-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯在配備了懸掛式攪拌器、攪拌軸、數(shù)字溫度讀出裝置和氬氣通道的250mL的3口圓底燒瓶中，攪拌去離子水(100mL)。鼓入氬氣30分鐘，加入D-果糖(20.0g，0.111mol)，溶液在幾分鐘內(nèi)變得清澈。在5分鐘內(nèi)分批加入氧化鈣(12.5g，0.223mol)，劇烈攪拌混合物。觀察到放熱，從加入氧化鈣起10分鐘后反應(yīng)溫度升至39.6℃。大約15分鐘后，反應(yīng)混合物變?yōu)辄S色，且顏色隨時(shí)間而加深。3小時(shí)后，取出部分反應(yīng)混合物進(jìn)行TLC分析。取出的部分用飽和草酸水溶液酸化到pH 2。所得到白色懸浮液在減壓下蒸餾除去水。向殘液中加入甲苯(2mL)，混合物在減壓下蒸餾(在45-50℃)，除去所有殘留的水。殘余固體再次加入到2mL的1∶1的四氫呋喃∶甲醇混合物中。充分混合后，使懸浮液靜置，用上清液點(diǎn)TLC(硅膠板，用含2％甲醇的乙酸乙酯展開(kāi)，浸在1％堿性高錳酸鉀中染色。然后，使用熱槍加熱板，直到在粉色背景中出現(xiàn)黃色的點(diǎn))。在上述條件下，期望的內(nèi)酯通常出現(xiàn)在Rf值為0.33處。更多的極性副產(chǎn)物和未反應(yīng)的原料在Rf值為0.0～0.2處檢測(cè)到。
盡管3小時(shí)后觀察到產(chǎn)物的形成，反應(yīng)仍繼續(xù)進(jìn)行22小時(shí)。其間，反應(yīng)混合物在25℃攪拌。在該期間最后，混合物的pH是13.06。向反應(yīng)混合物中鼓入二氧化碳?xì)怏w約2.5小時(shí)(pH為7.25)。形成的碳酸鈣固體通過(guò)真空過(guò)濾除去，濾餅用50mL去離子水洗。合并水層并用草酸(5.0g，0.056mol)處理，在25℃下對(duì)混合物劇烈攪拌30分鐘(最初的深色基本上消失，混合物變?yōu)槿榘咨珴{液)。此階段的混合物的pH通常為2-3。漿液混合物在45-50℃下攪拌過(guò)夜。然后，在45-50℃下減壓蒸餾混合物，除去75mL水。向水性漿液(約75mL)中加入氯化鈉(30g)和四氫呋喃(100mL)，在25℃劇烈攪拌混合物30分鐘。分離各層，用75mL的新鮮四氫呋喃攪拌水層10分鐘。該過(guò)程重復(fù)3次，合并四氫呋喃溶液并與10g的無(wú)水硫酸鎂攪拌30分鐘。過(guò)濾混合物，硫酸鎂濾餅用60mL四氫呋喃洗。濾液在40℃下減壓蒸餾，得到10.86g粗產(chǎn)物，其為深橙色半固體。(對(duì)于更大規(guī)模的合成，用丙酮代替四氫呋喃取代蒸餾粗產(chǎn)物至干燥)。在20℃下，將粗產(chǎn)物在丙酮(20mL)中攪拌3小時(shí)。真空過(guò)濾收集產(chǎn)物，用12mL丙酮洗濾餅，得到白色結(jié)晶固體的期望產(chǎn)物1。真空干燥得到2.45g(13.6％產(chǎn)率)。化合物1的熔點(diǎn)158-162℃(文獻(xiàn)報(bào)道熔點(diǎn)160-161℃)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 5.69(s，1H，用D2O交換)，5.41(d，1H，用D2O交換)，5.00(t，1H，用D2O交換)，4.15(m，1H)，3.73(m，2H)，3.52(m，1H)，1.22(s，3H)。13C NMR(DMSO-d6)δppm 176.44，82.95，72.17，72.02，59.63，20.95。(C6H10O5計(jì)算值C，44.45；H，6.22。實(shí)測(cè)值C，44.34；H，6.30)。
實(shí)施例22，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-內(nèi)酯在25℃氬氣氛圍中攪拌丙酮1(3.0g，18.50mmol.)、4-二甲基氨基吡啶(0.45g，3.72mmol.)和三乙胺(25.27g，249.72mmol.)在1，2-二甲氧基乙烷(50mL)中的混合物30分鐘。將該白色懸浮液冷卻到5℃，在15分鐘內(nèi)加入苯甲酰氯(11.7g，83.23mmol.)。在25℃攪拌混合物兩小時(shí)。TLC分析(硅膠，2％甲醇的乙酸乙酯溶液)表明起始原料完全消耗。向反應(yīng)混合物中加入冰水(100g)，繼續(xù)攪拌30分鐘。形成的白色固體通過(guò)真空過(guò)濾收集，用冷水(50mL)洗濾餅。在20℃將該粗產(chǎn)物與叔丁基甲醚(60mL)一同攪拌，然后過(guò)濾，濾餅用叔丁基甲醚(25mL)洗，并真空干燥，得到7.33g化合物2(83.4％產(chǎn)率)，其為白色固體，純度為97.74％(HPLC/AUC)?；衔?的熔點(diǎn)137-140℃(文獻(xiàn)值141-142℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.04(d，2H)，7.92(d，2H)，7.73(d，2H)，7.59(t，1H)，7.45(m，4H)，7.32(t，2H)，7.17(t，2H)，5.51(d，1H)，5.17(m，1H)，4.82-4.66(d of an ABquartet，2H)1.95，(s，3H)。13C NMR(CDCl3)δppm 172.87，166.17，166.08，165.58，134.06，133.91，133.72，130.09，129.85，129.80，129.37，128.78，128.60，128.49，127.96，127.89，79.67，75.49，72.60，63.29，23.80。TOF MS ES+(M+1475)。
實(shí)施例32，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖對(duì)Red-Al(65wt.％溶于甲苯，2.0mL，6.56mmol)在無(wú)水甲苯(2.0mL)中的溶液在0℃氬氣氛圍下攪拌。無(wú)水乙醇(0.38mL，6.56mmol)在無(wú)水甲苯(1.6mL)中的溶液在5分鐘內(nèi)被加入到上述甲苯溶液中。所得混合物在0℃攪拌15分鐘，將該Red-Al/乙醇試劑中的2mL(2.18mmol)在10分鐘內(nèi)加入到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯2(475mg，1.0mmol)的無(wú)水甲苯(10mL)的冷溶液(-5℃)中。TLC分析(硅膠板，35％乙酸乙酯的庚烷溶液)表明起始原料完全消耗。HPLC分析表明僅殘余0.1％的起始原料。用丙酮(0.2mL)，水(15mL)和1NHCl(15mL)在0℃使反應(yīng)結(jié)束，并加熱到室溫。加入1N HCl(5mL)溶解無(wú)機(jī)鹽(pH2-3)。用乙酸乙酯(3×25mL)萃取混合物，用鹽水(25mL)洗有機(jī)溶液，干燥(無(wú)水硫酸鈉，10g)，40℃減壓下除去溶劑，得到期望的產(chǎn)物3，定量產(chǎn)率(480mg)。該材料被用于以下的步驟。
實(shí)施例41，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖向冷的化合物3(480mg，1.0mmol)、3，4-二甲基氨基吡啶(12.3mg，0.1mmol)和三乙胺(506mg，5.0mmol)的無(wú)水四氫呋喃(5mL)溶液中，于5分鐘內(nèi)加入苯甲酰氯(283mg，2.0mmol)。室溫下氬氣氛圍中攪拌反應(yīng)混合物過(guò)夜。HPLC分析表明有0.25％未反應(yīng)的起始物質(zhì)。反應(yīng)通過(guò)加入冰水(10g)和碳酸氫鈉飽和溶液而結(jié)束。減壓下除去四氫呋喃，用乙酸乙酯(50mL)萃取混合物。用水(25mL)、鹽水(25mL)洗有機(jī)溶液，干燥(無(wú)水硫酸鈉，12g)，減壓下除去溶劑，得到650mg稠厚的油狀物。該粗產(chǎn)物與5mL的叔丁基甲醚一同攪拌5分鐘，加入庚烷(5mL)和水(0.1mL)，繼續(xù)在20℃攪拌2小時(shí)。真空過(guò)濾收集固體，濾餅用1∶1的庚烷∶叔丁基甲醚溶液(6mL)和叔丁基甲醚(2mL)洗。真空干燥固體，得到300mg(52％)期望產(chǎn)物4(純度98.43％，由HPLC/AUC純化)，其為白色固體，熔點(diǎn)154-156.3℃(文獻(xiàn)值155-156℃)。1H NMR(CDCl3)δppm 8.13(m，4H)，8.07(d，2H)，7.89(d，2H)，7.63(m，3H)，7.48(m，6H)，7.15(m，3H)，7.06(s，1H)，5.86(dd，1H)，4.79(m，1H)，4.70-4.52(d of an AB quartet，2H)，1.95，(s，3H)。13CNMR(CDCl3)8ppm 166.31，165.83，165.01，164.77，134.01，133.86，133.70，133.17，130.44，130.13，129.97，129.81，129.59，129.39，129.07，128.84，128.76，128.37，98.01，86.87，78.77，76.35，64.05，17.07。(C34H28O9計(jì)算值C，70.34；H，4.86。實(shí)測(cè)值C，70.20；H，4.95)。
實(shí)施例54-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮(化合物2，圖4)在配備了回流冷凝器、懸掛式攪拌器和氬氣入口轉(zhuǎn)接器的12L圓底燒瓶中，將胞嘧啶(89g，0.80mol)懸浮于乙腈(900ml)中。在20℃的氬氣氛圍下攪拌混合物，加入一部分N，O-二(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(537ml，2.2mol)。所得溶液加熱到80℃并在相同溫度下攪拌1小時(shí)。1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(425.0g，0.73mol)被懸浮于乙腈(4000ml)中，并加入到反應(yīng)混合物中。幾分鐘后，反應(yīng)混合物變得清澈，溫度降到ca.50℃。15分鐘內(nèi)加入氯化錫(IV)(154ml，1.31mol)，在80℃繼續(xù)攪拌。1小時(shí)后，加入碳酸氫鈉溶液使部分反應(yīng)混合物結(jié)束反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取液層。用TLC(硅膠，20％乙酸乙酯的庚烷溶液，糖衍生物的Rf0.40)檢測(cè)乙酸乙酯層。TLC分析表明糖衍生物完全消耗。使用10％甲醇的二氯甲烷溶液，由TLC檢測(cè)到期望的產(chǎn)物(Rf0.37)。反應(yīng)也由HPLC進(jìn)行監(jiān)控(方法#2)。反應(yīng)混合物冷卻到20℃，30分鐘內(nèi)加入飽和碳酸氫鈉溶液(3000mL)結(jié)束反應(yīng)(當(dāng)加入最初的幾毫升碳酸氫鈉溶液時(shí)觀察到放熱)。分次加入固體碳酸氫鈉(1350g)以避免發(fā)泡。檢測(cè)混合物以確保其pH≥7。停止攪動(dòng)，使各層分離20分鐘。排除水層，與乙酸乙酯(1500ml)一同攪拌，使混合物分離(30分鐘)。分離有機(jī)層，與乙腈溶液合并。有機(jī)溶液用鹽水(500ml)洗，然后除去溶劑，體積達(dá)到ca.750ml。產(chǎn)物可用于隨后的反應(yīng)。也可進(jìn)一步除去溶劑得到定量產(chǎn)率的白色沫狀固體?；衔?2)的結(jié)構(gòu)由1H NMR分析確認(rèn)。
實(shí)施例64-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-lH-嘧啶-2-酮(化合物3)向化合物(2)(416g，0.73mol)的甲醇(2000ml)溶液中，加入甲醇鈉(13.8g，0.26mol)。反應(yīng)混合物在室溫下攪拌，并由TLC(硅膠，10％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物1的Rf0.53)以及(硅膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物3的Rf0.21)監(jiān)控。30分鐘后，產(chǎn)物開(kāi)始沉淀，TLC表明兩小時(shí)后反應(yīng)完成。反應(yīng)也由HPLC進(jìn)行監(jiān)控(方法#2)。減壓下除去甲醇至體積ca.500ml，再使用乙醇驅(qū)趕(2×500ml)，使體積達(dá)到ca.500ml。殘余的稠厚漿液用750ml乙醇稀釋，混合物在20℃攪拌1小時(shí)。過(guò)濾收集產(chǎn)物，濾餅用乙醇(100ml)和叔丁基甲醚(100ml)洗，干燥后得到168g(兩步的產(chǎn)率為90％)產(chǎn)物(3)，純＞97％(HPLC/AUC)。產(chǎn)物也經(jīng)過(guò)了1H和13C NMR的分析。
實(shí)施例7N-[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基-甲脒(化合物4)向化合物3(19g，0.0738mol)在無(wú)水N，N-二甲基甲酰胺(150ml)的懸浮液中，加入N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(98ml，0.7385mol)，在20-22℃攪拌混合物。一小時(shí)后，TLC(硅膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，化合物3的Rf是0.21，產(chǎn)物4的Rf是0.55)表明反應(yīng)完成。減壓下除去溶劑和試劑(保持溫度在40℃以下)。向得到的油狀殘?jiān)屑尤胍掖?50ml)，減壓下除去溶劑。該過(guò)程重復(fù)兩次，粗產(chǎn)物得以固化。粗產(chǎn)物與190ml乙醇在20℃下一同攪拌1小時(shí)，在5℃保持12小時(shí)。過(guò)濾收集固體，濾餅用30ml的冷乙醇和30ml的冷叔丁基甲基醚洗。減壓干燥固體，得到14.7g(64％)化合物(4)，作為第一產(chǎn)物。TLC(硅膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，產(chǎn)物(4)的Rf是0.55)以及(硅膠，10％甲醇的二氯甲烷溶液，產(chǎn)物(4)的Rf是0.1)只顯示出化合物(4)的一個(gè)點(diǎn)。乙醇提純后的母液被蒸發(fā)干燥，殘?jiān)c乙醇(80ml)在20℃下攪拌1小時(shí)，并在5℃保持12小時(shí)。過(guò)濾收集固體，濾餅用15ml的冷的乙醇和15ml的冷的叔丁基甲醚洗。真空干燥固體后，獲得3.5g(15％)固體，作為第二產(chǎn)物。TLC(硅膠，30％甲醇的二氯甲烷溶液，產(chǎn)物(4)的Rf是0.55)以及(硅膠，10％甲醇的二氯甲烷溶液，產(chǎn)物(4)的Rf是0.1)只顯示出化合物(4)的一個(gè)點(diǎn)；m.p.201-209℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.62(s，1H，N＝CH)，8.17(d，1H，H-6，J5-6＝7.3Hz)，5.91(m，2H，H-1′，H-5)，5.16(t，1H，OH-5′，D2O可交換)，5.06(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，3.8-3.5(m，4H，H-3′，H-4′，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，6H，N(CH3)2)，0.92(s，3H，CH3)；FAB＞0(GT)625(2M+H)+，313(M+H)+，167(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z 419(M+T-H)-，403(M+G-H)-，311(M-H)-，165(B)-。
實(shí)施例8N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒(化合物5)化合物(4)(42.9g，0.137mol)通過(guò)懸掛式攪拌器攪拌30分鐘而分散到無(wú)水二氯甲烷(200ml)中。然后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將混合物蒸發(fā)至干燥，在ca.30℃)。將該干燥的化合物(4)、咪唑(37.4g，0.55mol)和無(wú)水二氯甲烷(800ml)在氬氣氛圍下加入到2L的4-口圓底燒瓶中，叔丁基二苯基氯硅烷(43.1g，0.156mol，分為若干次加入)被轉(zhuǎn)移到連接于反應(yīng)燒瓶的附加通道中。反應(yīng)混合物冷卻到10℃，在20分鐘內(nèi)從附加通道加入叔丁基二苯基氯硅烷(13.74g，0.05mol)，邊攪拌邊維持反應(yīng)溫度在10～12℃。反應(yīng)通過(guò)HPLC監(jiān)控(方法#2)。1.5小時(shí)后，在20分鐘內(nèi)加入第二部分的叔丁基二苯基氯硅烷(14.76g，0.053mol)，邊攪拌邊維持反應(yīng)溫度在10～12℃。再過(guò)1小時(shí)候，在20分鐘內(nèi)加入剩余的叔丁基二苯基氯硅烷(14.8g，0.053mol)，邊攪拌邊維持反應(yīng)溫度在10～12℃。然后，在12-15℃再攪拌1.5小時(shí)。HPLC表明有95.40％的產(chǎn)物，3.00％的二-甲硅烷基衍生物以及未反應(yīng)的原料。加入飽和碳酸氫鈉溶液(150ml)結(jié)束反應(yīng)，并在15℃攪拌15分鐘(pH在8附近)。分離水層和二氯甲烷層。用水(2×150ml)和鹽水(1×200ml)洗二氯甲烷層，用無(wú)水硫酸鈉干燥(60.0g，30分鐘)。然后，減壓下過(guò)濾除去溶劑。殘余的沫狀固體用于下步的反應(yīng)。
實(shí)施例92-叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5[-4(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(化合物6)25℃下氬氣氛圍中攪拌化合物(5)(58g，0.1053mol)的二氯甲烷(500ml)溶液。加入N-(叔丁氧基羰基)-L-纈氨酸(29.7g，0.1367mol)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二酰亞胺氯化氫(26.2g，0.1367mol)和4-(二甲基氨基)吡啶(1.3g，0.0106mol)，25℃下攪拌反應(yīng)混合物，通過(guò)HPLC監(jiān)控(方法#2)。4小時(shí)后，HPLC表明含7.9％的起始原料。加入N-(叔丁氧基羰基)-L-纈氨酸(4.57g，0.0210mol)和1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二酰亞胺氯化氫(4.03g，0.0210mol)，持續(xù)在25℃再攪拌2小時(shí)。然后，經(jīng)HPLC檢測(cè)到0.7％的起始原料。向反應(yīng)混合物中加入甲醇(60ml)，減壓蒸發(fā)除去溶劑(溫度保持在40℃以下)，得到化合物(6)，為稠厚的油。該材料(93％純度，HPLC/AUC)被用于下步的反應(yīng)。
實(shí)施例10叔丁氧基羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H 嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(化合物7)將化合物(6)(0.3mol)、MeOH(1650ml)和EtOAc(265g，3.0mol)加入到3L的5-口圓底燒瓶中，攪拌混合物使化合物(6)溶解。加入氟化胺(45.0g，1.21mol)，回流下使溫度達(dá)到64.5℃，攪拌4小時(shí)。HPLC(方法#2)表明反應(yīng)在4小時(shí)后完成。然后，減壓下于40-45℃除去溶劑，并用EtOAc(300ml)驅(qū)趕。殘余泡沫與EtOAc(400ml)、水(600ml)和叔丁基甲醚(300ml)合并，室溫下粉碎混合物2.5小時(shí)。過(guò)濾收集分離的白色固體，用水(200ml)、1∶1的EtOAc/叔丁基甲醚(120ml)和叔丁基甲醚(120ml)洗。然后，真空干燥固體超過(guò)20小時(shí)，得到化合物(7)，為白色固體。產(chǎn)率為71.54g，三步為52％。化合物(7)的純度是99.08％(HPLC，方法#3)。1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.99(d，1H，H-6，J6-5＝7.42Hz)，7.3-7.1(m，3H，CH和NH2，D2O可交換)，5.9(s，1H，H-1′)，5.75(d，1H，H-5，J6-5＝7.43Hz)，5.43(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，5.24(t，1H，OH-5′)，5.04(d，1H，H-3′，J3′-4′＝9.1Hz)，4.1-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.4(2m，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.0(m，1H，CB)，1.40(s，9H，(CH3)3C)，1.0(s，3H，CH3)，0.9-0.8(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B)-；FAB＞0(GT)913(2M+H)+，457(M+H)+，112(B+2H)+，57(CH3)3C)+；FAB＜0(GT)911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocVal)-，110(B)-。
實(shí)施例112-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(二鹽酸鹽)(化合物8)在配備了懸掛式攪拌器、溫度探頭、氬氣通道和氯化氫鼓泡器的圓底燒瓶中，攪拌化合物(7)(21.0g，0.046mol)的乙醇(168ml)溶液。向澄清的溶液中鼓入氯化氫氣體(22g)1小時(shí)。用冰水浴使反應(yīng)溫度保持在30℃以下。通入氯化氫氣體后幾分鐘開(kāi)始有固體形成。4小時(shí)后，HPLC(方法#3)表明只有0.8％的起始原料。過(guò)濾收集固體，濾餅用乙醇(20ml)和二乙醚(100ml)洗。減壓干燥產(chǎn)物16小時(shí)后，得到19.06g(96.5％)產(chǎn)物(8)，純度為97.26％(HPLC，方法#3)；m.p.210℃(變?yōu)楹稚?，248-250℃(熔融)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.0(s，1H，1/2NH2，D2O可交換)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交換)，8.42(d，1H，H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′＝8.8Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m，1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+，357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+Cl)-，391(M+Cl)-，355(M-H)-，116(Val)-，110(B)-，35(Cl)-。
實(shí)施例12HPLC測(cè)試方法上述所有的方法均使用反向色譜柱；Waters部分編號(hào)#WAT086344；Nova-PakC18，60′孔大小，4μm顆粒大小，3.9×150mm。所有的色譜均使用Waters2695 HPLC和996 PDA監(jiān)測(cè)器獲得。
流動(dòng)相HPLC級(jí)乙腈和水從JT Baker購(gòu)得，1M的醋酸三乙胺溶液從Fluka購(gòu)得。
方法#1用于測(cè)試化合物4，圖4流速1.00ml/min。乙腈/水的線性梯度如下。
每次測(cè)試前系統(tǒng)都平衡5分鐘。
波長(zhǎng)254nm。
化合物4的保留時(shí)間＝12.8分鐘。

方法#2用于測(cè)試化合物2、4、5、6和7，圖4流速1.00ml/min。乙腈/20mM醋酸三乙胺緩沖液的線性梯度如下。
每次測(cè)試前系統(tǒng)都平衡5分鐘。
波長(zhǎng)320和272nm。

對(duì)比表化合物與保留時(shí)間，方法#2


方法#3用于測(cè)試化合物3、7和8，圖4流速1.00ml/min。乙腈/20mM醋酸三乙胺緩沖液的線性梯度如下。
每次測(cè)試前系統(tǒng)都平衡5分鐘。
波長(zhǎng)272nm。

對(duì)比表化合物與保留時(shí)間，方法#3

現(xiàn)有技術(shù)方法實(shí)施例13N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-β-D 2′-C-甲基-胞苷(4)的制備用N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛(8.2ml，61.73mmol)處理β-D-2′-C-甲基-胞苷(3)(1.65g，6.43mmol)在DMF(32ml)中的溶液，室溫下攪拌約1.5小時(shí)。溶液在減壓下與乙醇共蒸發(fā)。從乙醇/乙醚中結(jié)晶，產(chǎn)生迄今未知的化合物(4)(第一產(chǎn)物，1.21g，60％產(chǎn)率，第二產(chǎn)物，輕微不純，0.46g，23％產(chǎn)率)，為結(jié)晶狀。
以下的物理-化學(xué)特性是由第一產(chǎn)物的結(jié)晶體獲得。F＝201-209℃；1H NMR(DMSO-d6)δppm 8.62(s，1H，N＝CH)，8.17(d，1H，H-6，J5-6＝7.3Hz)，5.91(m，2H，H-1′，H-5)，5.16(t，1H，OH-5′，D2O可交換)，5.06(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，3.8-3.5(m，4H，H-3′，H-4′，H-5′和H-5″)，3.15和3.02(2s，6H，N(CH3)2)，0.92(s，3H，CH3)；FAB＞0(GT)625(2M+H)+，313(M+H)+，167(B+2H)+；FAB＜0，(GT)m/z419(M+T-H)-，403(M+G-H)-，311(M-H)-，165(B)-；室溫下進(jìn)行HPLC 5.96分鐘(從0到50％的CH3N在20mM醋酸三乙胺中的緩沖液，程序?yàn)?0分鐘，流速為1ml/min)，λmax＝316.1nm。
實(shí)施例14N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-5′-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D 2′-C-甲基-胞苷(5)的制備向化合物(4)(1.167g，3.73mmol)在干吡啶(15ml)的溶液中，持續(xù)加入咪唑(760mg，11.19mmol)和叔丁基二苯基氯硅烷(0.66ml，2.53mmol)。室溫下攪拌溶液。4小時(shí)后，反應(yīng)混合物中補(bǔ)入叔丁基二苯基氯硅烷(0.40ml，2.28mmol)并在室溫下攪拌2小時(shí)。接著用碳酸氫鈉萃取，水洗有基層，硫酸鈉干燥，減壓下蒸發(fā)。將粗混合物與干乙腈(30ml)和干二甲基甲酰胺(15ml)混合。
實(shí)施例15N4-[(二甲基氨基)亞甲基]-5′-O-叔丁基二苯基甲硅烷基-β-D 2′-C-甲基-胞苷的3′-O-L-N-(叔丁氧羰基)纈氨酸酯(6)的制備向前步得到的化合物(5)中持續(xù)加入N-(叔丁氧羰基)-L-纈氨酸(Boc-Val-OH，400mg，1.87mmol)，N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二酰亞胺氯化氫(DEC，715mg，3.73mmol)和4-二甲基氨基吡啶(DMAP，68mg，0.56mmol)，室溫下攪拌所得混合物。反應(yīng)過(guò)程由HPLC監(jiān)視。反應(yīng)混合物中補(bǔ)入3次Boc-Val-OH(400mg×3)，DEC(715mg×3)和DMAP(68mg×3)，最后再補(bǔ)入一次Boc-Val-OH(200mg)，DEC(357mg)和DMAP(34mg)。兩天后，起始物質(zhì)全部消耗，減壓下除去DMF。殘余物化合物(6)加入到干乙醇(70ml)中。
實(shí)施例16β-D-2′-C-甲基-胞苷(7)的3′-O-L-N-(叔丁氧羰基)纈氨酸酯(6)的制備向含殘余物化合物(6)的干乙醇(70ml)中加入氟化胺(1.38g，37.30mmol)，回流混合物3小時(shí)。過(guò)濾混合物并減壓除去溶劑。將殘余物加入乙酸乙酯并用水萃取幾次。真空蒸發(fā)有機(jī)相，在硅膠色譜柱上純化(洗提液MeOH(20％)EtOAc(80％))。分離出期望的化合物(7)(1.37g，3步的產(chǎn)率為78％)，為白色泡沫。
物理-化學(xué)數(shù)據(jù)包括1H NMR(DMSO-d6)δppm 7.99(d，1H，H-6，J6-5＝7.42Hz)，7.3-7.1(m，3H，CH和NH2，D2O可交換)，5.9(s，1H，H-1′)，5.75(d，1H，H-5，J6-5＝7.43Hz)，5.43(s，1H，OH-2′，D2O可交換)，5.24(t，1H，OH-5′)，5.04(d，1H，H-3′，J3′-4′＝9.1Hz)，4.1-4.0(m，2H，H-4′，CH)，3.8-3.4(2m，2H，H-5′，H-5″)，2.2-2.0(m，1H，CH)，1.40(s，9H，(CH3)3C)，1.0(s，3H，CH3)，0.9-0.8(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＜0，(GT)m/e 911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B-；FAB＞0(GT)913(2M+H)+，457(M+H)+，112(B+2H)+，57(CH3)3C)+；FAB＜0(GT)911(2M-H)-，455(M-H)-，256(M-BocVal)-，216(BocValOH)-，110(B)-。
實(shí)施例17β-D 2′-C-甲基-胞苷(二鹽酸鹽，(8)的3′-O-L-纈氨酸酯的制備用20％HCl/乙酸乙酯溶液(75ml)處理化合物(7)(1.32g，2.9mmol)在干乙酸乙酯(75ml)中的溶液。室溫下攪拌反應(yīng)混合物2小時(shí)。標(biāo)題化合物(8)從反應(yīng)混合物中沉淀出，過(guò)濾并用Et2O(1.01g，81％產(chǎn)率)洗。物理-化學(xué)數(shù)據(jù)包括F＝210℃(發(fā)褐)，234-241℃(熔融)；1H NMR(DMSO-d6)δppm 10.0(s，1H，1/2NH2，D2O可交換)，8.9-8.6(2 br s，4H，1/2NH2，NH3，D2O可交換)，8.42(d，1H，H-6，J5-6＝7.9Hz)，6.24(d，1H，H-5，J5-6＝7.9Hz)，5.84(s，1H，H-1′)，5.12(d，1H，H-3′，J3′-4′＝8.8Hz)，4.22(d，1H，H-4，J3′-4′＝8.7Hz)，4.0-3.9(m，1H，CH)，3.8-3.5(m，2H，H-5′，H-5″)，2.3-2.1(m，1H，CH)，1.16(s，3H，CH3)，1.0(m，6H，(CH3)2CH)；FAB＞0(GT)713(2M+H)+，449(M+G+H)+，357(M+H)+，246(S)+，112(B+2H)+；FAB＜0(GT)747(2M+Cl)-，483(M+G+Gl)-，391(M+Cl)-，355(M-H)-，116(Val)-，110(B)-，35(Cl)-；HPLC rt＝7.26min(從0到50％的CH3N在20mM醋酸三乙胺中的緩沖液，程序?yàn)?0分鐘，流速為1ml/min)，λmax＝273.5nm；UV(H2O)λmax＝271nm(ε7500)，λmin＝249nm(ε5200)，λs＝234nm(ε6200)。
實(shí)施例18β-D-2′-C-甲基-胞苷的合成(圖6)制備β-D-2′-C-甲基-胞苷的另一合成路線見(jiàn)圖3。在該方法中，加熱尿嘧啶(2.1eq.)和BSA(1.1mL/mmol)在乙腈(7mL/mmol)中的混合物至回流約30分鐘。所得溶液用1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖(1)的乙腈(7mL/mmol)溶液以及SnCl4(3.5eq.)的溶液處理。所得溶液加熱至回流約4小時(shí)。反應(yīng)物的深色混合物用乙酸乙酯(2.5甲苯體積)稀釋，并用與乙酸乙酯等體積的冷NaHCO3飽和溶液在室溫下處理。通過(guò)寅式鹽(celite)過(guò)濾全部的混合物，用乙酸乙酯洗固體材料。從濾液分離出有機(jī)層，用水及鹽水洗，用Na2SO4干燥，減壓下蒸發(fā)。通過(guò)使用50％乙酸乙酯的己烷溶液的硅膠柱色譜得到產(chǎn)率為65％的化合物(9)，β-D-2′-，3′-，5′-苯甲酰-2′-C-甲基-尿苷，為白色固體。
通過(guò)使(9)溶解在以MeONa(3.3eq.)處理的甲醇(12.5ml/mmol)中并在室溫下攪拌所得黃色溶液約4.5小時(shí)，將苯甲酰保護(hù)基從β-D-2′-，3′-，5′-苯甲酰-2′-C-甲基-尿苷(9)上除去。加入預(yù)先用甲醇洗過(guò)的Dowex H+50wX4使溶液中和。過(guò)濾混合物，用熱的甲醇萃取樹(shù)脂幾次。合并濾液并在減壓下蒸發(fā)。殘?jiān)尤胨?，用二氯甲烷?次。水層減壓下蒸發(fā)。從水中結(jié)晶生成(10)，β-D-2′-C-甲基-尿苷，產(chǎn)率87％。
然后，由β-D-2′-C-甲基-尿苷(10)、1-甲基吡咯烷(1ml/mmol)、氯代三甲基硅烷的(3eq.)的乙腈(10ml/mmol)溶液組成的溶液在室溫下攪拌約3.5小時(shí)。將溶液冷卻到0℃，用三氟乙酸酐(3eq.)處理，在相同溫度下攪拌30分鐘。加入4-硝基苯酚(3eq.)，攪拌溶液約3小時(shí)。向溶液中加入水結(jié)束反應(yīng)，減壓下蒸發(fā)溶劑。將殘?jiān)尤攵燃淄?，用飽和NaHCO3溶液和水洗。減壓下蒸發(fā)有機(jī)層。將粗殘?jiān)尤攵f烷(25ml/mmol)，并用28％NH4OH(5ml/mmol)水溶液處理。溶液加熱到50℃過(guò)夜。然后，減壓蒸發(fā)溶劑，使用梯度甲醇(5-20％，在二氯甲烷中)的色譜分離。產(chǎn)生了β-D-2′-C-甲基-胞苷(11)作為期望的產(chǎn)物，產(chǎn)率75％。產(chǎn)物進(jìn)一步在EtOH中結(jié)晶。
實(shí)施例5和6中的試劑來(lái)源包括N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.40271；N，N-二甲基甲酰胺，過(guò)分子篩，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.40248；純乙醇，購(gòu)自Carlo Erba ACS，分析用，編號(hào)No.414607；二乙醚購(gòu)自Merck，編號(hào)No.1.00921.5000；叔丁基二苯基氯硅烷，購(gòu)自Avocado，編號(hào)No.12721；咪唑，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.56750；吡啶，過(guò)分子篩，購(gòu)自Fluka，編號(hào)82704；碳酸氫鈉，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.71628；無(wú)水硫酸鈉，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.71960；乙腈，過(guò)分子篩，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.00695；N，N-二甲基甲酰胺，過(guò)分子篩，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.40248；N-(叔丁氧羰基)-L-纈氨，購(gòu)自Aldrich，編號(hào)No.35,972-6；4-二甲基氨基吡啶，購(gòu)自Aldrich，編號(hào)No.10,770-0；N′-(3-二甲基氨基丙基)-N-乙基碳二酰亞胺氯化氫，購(gòu)自Aldrich，編號(hào)No.16,146-2；氟化胺，購(gòu)自Fluka，編號(hào)No.09742；經(jīng)鈉蒸餾的甲醇；經(jīng)過(guò)五氧化二磷無(wú)水氯化氫蒸餾的乙酸乙酯，購(gòu)自Praxair，編號(hào)No.1741100；以及二乙醚，購(gòu)自Merok，編號(hào)No.1.00921.5000。
以上僅是對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性說(shuō)明，并不限于公開(kāi)的方法和反應(yīng)條件。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見(jiàn)到各種變化均包括在本發(fā)明權(quán)利要求所定義的范圍和精神之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.制備3′-O-氨基酸酯核苷的方法，包括以下步驟(a)使任選保護(hù)的、任選取代的呋喃核糖與未保護(hù)的核苷堿基和甲硅烷化試劑在路易斯酸存在下偶聯(lián)，形成任選保護(hù)的核苷；(b)如需要，任選使步驟(a)中的保護(hù)的核苷與脫保護(hù)試劑反應(yīng)，提供未保護(hù)的核苷；(c)如果核苷有胺基，任選使保護(hù)的或未保護(hù)的核苷的胺基與胺保護(hù)試劑反應(yīng)；(d)任選使保護(hù)的或未保護(hù)的核苷與甲硅烷化試劑反應(yīng)，得到5′-O-甲硅烷基保護(hù)的核苷；(e)任選使保護(hù)的或未保護(hù)的核苷與保護(hù)的氨基酸衍生物在一種或多種偶聯(lián)劑下反應(yīng)，形成保護(hù)的3′-O-氨基酸酯；(f)如果需要，任選使步驟(e)中的產(chǎn)物與從5′-C除去甲硅烷基保護(hù)基和從核苷胺除去甲脒保護(hù)基的試劑反應(yīng)；和(g)任選使步驟(f)中的產(chǎn)物與從3′-O-氨基酸酯除去保護(hù)基的試劑反應(yīng)，產(chǎn)生取代的或未取代的3′-O-酯-取代的核苷。
2.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(a)中的任選保護(hù)的呋喃核糖在2′-C位包含甲基。
3.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(a)中的路易斯酸選自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl4、FeCl3和SnCl2組成的組。
4.權(quán)利要求3的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
5.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(a)中的甲硅烷化試劑選自由BSA、HMDS、TMSC1和TBDPSC1組成的組。
6.權(quán)利要求5的方法，其中，甲硅烷化試劑是BSA。
7.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(a)中的偶聯(lián)反應(yīng)在乙腈溶劑中進(jìn)行。
8.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(b)中的脫保護(hù)試劑是NaOMe或NH3。
9.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(c)中的胺保護(hù)試劑選自由N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛和N-1，1-二甲基硫代亞甲基胺組成的組。
10.權(quán)利要求9的方法，其中，胺保護(hù)試劑是N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛。
11.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(d)中的甲硅烷化試劑選自由TBDPSC1、TMSC1、和TBDMSC1組成的組。
12.權(quán)利要求11的方法，其中，甲硅烷化試劑是TBDPSC1。
13.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(e)的氨基酸衍生物是纈氨酸衍生物。
14.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(e)的氨基酸保護(hù)基選自BOC、-(C＝O)-芳烷基、-(C＝O)-烷基或-(C＝O)-芳基。
15.權(quán)利要求14的方法，其中，氨基酸保護(hù)基是BOC。
16.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(e)中的偶聯(lián)劑之一是EDC。
17.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(f)中的甲硅烷基-除去試劑是NH4F。
18.權(quán)利要求1的方法，其中，步驟(g)中的3′-O-氨基酸酯保護(hù)基除去試劑是HCl。
19.制備核苷的方法，包括以下步驟(a)使1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶在BSA和SnCl4存在下偶聯(lián)，形成4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基甲基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮；(b)使由步驟(a)中得到4-氨基-1-(3，4-二苯甲酰氧基甲基-5-苯甲酰氧基甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮與甲醇鈉反應(yīng)，除去苯甲酰保護(hù)基，得到4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮；(c)使由步驟(b)中得到的4-氨基-1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-1H-嘧啶-2-酮與N，N-二甲基甲酰胺二甲基乙縮醛反應(yīng)，保護(hù)N4-氨基，產(chǎn)生N-[1-(3，4-二羥基-5-羥甲基-3-甲基-四氫呋喃-2-基)-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基]-N，N-二甲基甲脒；(d)使由步驟b)或c)中得到的核苷與甲硅烷化試劑TBDPSC1反應(yīng)，得到N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基甲脒；(e)使N′-{1-[5-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-3，4-二羥基-3-甲基-四氫呋喃-2-基]-2-氧-1，2-二氫-嘧啶-4-基}-N，N-二甲基-甲脒與N-BOC-L-纈氨酸和EDC在二氯甲烷中反應(yīng)，得到2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯；(f)通過(guò)回流化合物與NH4F，除去步驟(e)中的2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸2-(叔丁基-二苯基-硅烷氧基甲基)-5-[4-(二甲基氨基-亞甲基氨基)-2-氧-2H-嘧啶-1-基]-4-羥基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯的甲硅烷基保護(hù)基和甲脒基；形成2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯，以及(g)通過(guò)使步驟(f)中的2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯與HCl反應(yīng)，從3′-O-纈氨酸酯取代基上除去BOC-保護(hù)基，得到2-氨基-3-甲基-丁酸5-(4-氨基-2-氧-2H-嘧啶-1-基)-4-羥基-2-羥甲基-4-甲基-四氫呋喃-3-基酯(二鹽酸鹽)。
20.制備呋喃糖的方法，包括以下步驟(a)使CaO溶液與環(huán)醚反應(yīng)，該環(huán)醚在與環(huán)上氧原子鄰接的碳上具有羥基和CH2OH，從而形成呋喃基內(nèi)酯；(b)如果需要，用保護(hù)基任選保護(hù)呋喃基內(nèi)酯；(c)使任選保護(hù)的呋喃基內(nèi)酯與還原劑反應(yīng)，將內(nèi)酯還原為羥基，產(chǎn)生呋喃糖產(chǎn)物化合物；以及(d)任選使呋喃糖產(chǎn)物化合物與保護(hù)基反應(yīng)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中，與CaO反應(yīng)的環(huán)醚是D-果糖。
22.權(quán)利要求20的方法，其中，呋喃基內(nèi)酯是2-C-甲基-D-核糖酸-內(nèi)酯。
23.權(quán)利要求20的方法，其中，保護(hù)的呋喃基內(nèi)酯是2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸-內(nèi)酯。
24.權(quán)利要求20的方法，其中，呋喃糖是2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
25.權(quán)利要求20的方法，其中，保護(hù)的呋喃糖是1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
26.權(quán)利要求20的方法，其中，保護(hù)基選自由甲硅烷基、苯甲?；?、p-甲苯?；-硝基苯甲?；?、p-氯苯甲?；Ⅴ；?、乙?；?、-(C＝O)-烷基和-(C＝O)-芳基組成的組，任選被一個(gè)或多個(gè)不受步驟(c)中還原劑影響的基團(tuán)取代。
27.權(quán)利要求26的方法，其中，保護(hù)基是苯甲?；?。
28.權(quán)利要求26的方法，其中，保護(hù)基是-(C＝O)-烷基。
29.權(quán)利要求20的方法，其中，還原劑選自由Red-Al/乙醇、NaHTe、SmI2、H2+Pd-磷化氫催化劑和LiAI(OtBu)3H組成的組。
30.權(quán)利要求29的方法，其中，還原劑是Red-Al/乙醇。
31.權(quán)利要求20的方法，其中，反應(yīng)在溶劑中進(jìn)行，該溶劑選自由TEA、DMAP、DME、甲苯和乙醇組成的組。
32.權(quán)利要求20的方法，其中，對(duì)于第一產(chǎn)物化合物內(nèi)酯，反應(yīng)溫度在約-5℃到約50℃間變動(dòng)。
33.權(quán)利要求20的方法，其中，總的合成時(shí)間是從約5天到約14天。
34.權(quán)利要求33的方法，其中，總的合成時(shí)間是從約5天到約10天。
35.權(quán)利要求33的方法，其中，總的合成時(shí)間是約60小時(shí)。
36.一方法，包括以下步驟(a)使CaO溶液與D-果糖在溫度約23℃到約40℃下反應(yīng)約5小時(shí)到約25小時(shí)；(b)使步驟(a)中的產(chǎn)物與CO2和草酸反應(yīng)約8小時(shí)到約12小時(shí)，形成2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯；(c)使2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯與苯甲酰氯反應(yīng)約3小時(shí)到約6小時(shí)，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯；(d)在約5℃到約0℃下，用Red-Al/乙醇還原2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯約30到約60分鐘，得到2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖；(e)在約0℃到約50℃下，在溶劑中苯甲酰化2，3，5-三-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖約4小時(shí)到約14小時(shí)，形成1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖；以及(f)任選分離1，2，3，5-四-O-苯甲酰-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
37.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(a)中的反應(yīng)時(shí)間是從約6到約22小時(shí)。
38.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(a)中的反應(yīng)溫度是從約23到約40℃。
39.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(c)中的溶劑是DME。
40.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(c)中的反應(yīng)進(jìn)行約4小時(shí)。
41.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(d)中的還原進(jìn)行約40分鐘。
42.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(d)中的溶劑包括甲苯。
43.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(e)中的溶劑包括DME。
44.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(e)中的溫度是從約5到約50℃，反應(yīng)進(jìn)行約4到約12小時(shí)。
45.權(quán)利要求36的方法，其中，步驟(f)中的分離是通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行。
46.權(quán)利要求1的方法，其中，苯甲酰保護(hù)的、任選取代的呋喃核糖是通過(guò)權(quán)利要求20的方法制備的。
47.權(quán)利要求1的方法，其中，苯甲酰保護(hù)的、任選取代的呋喃核糖是通過(guò)權(quán)利要求36的方法制備的。
48.制備呋喃基內(nèi)酯的方法，包括(a)使CaO溶液與環(huán)醚反應(yīng)，該環(huán)醚在與環(huán)上氧原子鄰接的碳上具有羥基和CH2OH，形成呋喃基內(nèi)酯。
49.制備2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯的方法，包括以下步驟(a)在溫度為約23℃到約40℃下，使CaO溶液與D-果糖反應(yīng)約5小時(shí)到約25小時(shí)；(b)使步驟(a)的產(chǎn)物與CO2和草酸反應(yīng)約8小時(shí)到約12小時(shí)，形成2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯。
50.制備任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖化合物的方法，包括(a)用Red-Al/乙醇還原任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯，得到任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖。
51.制備任選保護(hù)的核苷的方法，包括(a)使任選保護(hù)的、任選取代的呋喃核糖與未保護(hù)的核苷堿基和甲硅烷化試劑在路易斯酸存在下偶聯(lián)，形成任選保護(hù)的核苷。
52.制備任選保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷的方法，包括以下步驟(a)使任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶在BSA和SnCl4存在下偶聯(lián)，形成任選保護(hù)的β-D-2′-C-甲基-胞苷。
53.制備2′-C-甲基-胞苷的方法，包括以下步驟(a)使胞嘧啶與活化劑、任選在路易斯酸存在下與任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖反應(yīng)，形成任選保護(hù)的2′-C-甲基-胞苷 其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基；然后，(b)如需要，任選脫去前步反應(yīng)中的的任選保護(hù)的2′-C-甲基-胞苷的保護(hù)，形成2′-C-甲基-胞苷(VI)。
54.權(quán)利要求53的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或?；?。
55.權(quán)利要求53的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或苯甲?；?。
56.權(quán)利要求53的方法，其中，活化劑是甲硅烷化試劑。
57.權(quán)利要求56的方法，其中，甲硅烷化試劑是BSA、HMDS、TMSC1或TBDPSC1。
58.權(quán)利要求56的方法，其中，甲硅烷化試劑是BSA。
59.權(quán)利要求53的方法，其中，反應(yīng)步驟(a)在路易斯酸下完成，路易斯酸選自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3和SnCl2組成的組，或它們的任意混合物。
60.權(quán)利要求53的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
61.權(quán)利要求53的方法，其中，該方法進(jìn)一步包括用酯部分對(duì)2′-C-甲基-胞苷的3′-位進(jìn)行酯化的步驟。
62.權(quán)利要求61的方法，其中，酯部分為氨基酸。
63.權(quán)利要求62的方法，其中，氨基酸是L-纈氨酸。
64.制備任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖的方法，包括以下步驟(a)使任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯與還原劑反應(yīng) 其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基；然后，(b)選擇性地保護(hù)前步反應(yīng)中的呋喃核糖衍生化合物，形成任選保護(hù)的-2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基。
65.權(quán)利要求64的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或酰基。
66.權(quán)利要求64的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或苯甲?；?。
67.權(quán)利要求64的方法，其中，還原劑是二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑中。
68.權(quán)利要求67的方法，其中，溶劑是乙醇。
69.制備任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯的方法，包括以下步驟(a)使D-果糖與CaO反應(yīng)； 然后，(b)任選保護(hù)內(nèi)酯，形成任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯 其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基。
70.權(quán)利要求69的方法，其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或?；?br> 71.權(quán)利要求69的方法，其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或苯甲酰基。
72.權(quán)利要求69的方法，其中，利用沉淀劑來(lái)除去在步驟(a)中產(chǎn)生的鈣。
73.權(quán)利要求72的方法，其中，沉淀劑是比核糖酸強(qiáng)的有機(jī)酸。
74.權(quán)利要求73的方法，其中，有機(jī)酸選自由草酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、壬二酸、馬來(lái)酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丙烯酸、甲基丙烯酸、丁酸、戊酸己酸或己酸組成的組。
75.權(quán)利要求73的方法，其中，有機(jī)酸是草酸。
76.從D-果糖制備任選保護(hù)的2′-C-甲基-D-胞苷的方法，包括以下步驟(a)使D-果糖與CaO反應(yīng)得到2-C-甲基-D-核糖酸-γ-內(nèi)酯； (b)如果需要，任選保護(hù)內(nèi)酯，形成任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯； 其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基；(c)使任選保護(hù)的2-C-甲基-D-核糖酸內(nèi)酯與還原劑反應(yīng)， 其中，各P1、P2和P3獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基；(d)如果需要，任選保護(hù)前步反應(yīng)中的呋喃核糖衍生化合物，形成任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖， 其中，P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基；(e)使任選保護(hù)的2-C-甲基-β-D-呋喃核糖與胞嘧啶和活化劑任選在路易斯酸存在下反應(yīng)，形成任選保護(hù)的2′-C-甲基胞苷 其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或適當(dāng)?shù)难醣Ｗo(hù)基；然后，(f)如果需要，任選脫去任選保護(hù)的2′-C-甲基胞苷的保護(hù)，形成任選保護(hù)的2′-C-甲基胞苷
77.權(quán)利要求76的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或酰基。
78.權(quán)利要求76的方法，其中，各P1、P2、P3和P4獨(dú)立地為氫或苯甲?；?br> 79.權(quán)利要求76的方法，其中，活化劑是甲硅烷化試劑。
80.權(quán)利要求79的方法，其中，甲硅烷化試劑是BSA、HMDS、TMSC1或TBDPSC1。
81.權(quán)利要求79的方法，其中，甲硅烷化試劑是BSA。
82.權(quán)利要求76的方法，其中，反應(yīng)步驟(e)在路易斯酸下完成，路易斯酸選自由SnCl4、BF3、AlCl3、TiCl2、TiCl4、FeCl3和SnCl2組成的組，或它們的任意混合物。
83.權(quán)利要求82的方法，其中，路易斯酸是SnCl4。
84.權(quán)利要求76的方法，其中，還原劑是二(2-甲氧基乙氧基)氫化鋁鈉(Red-Al)，任選在溶劑中。
85.權(quán)利要求84的方法，其中，溶劑是乙醇。
86.權(quán)利要求76的方法，其中，該方法進(jìn)一步包括用酯部分對(duì)2′-C-甲基-胞苷的3′-位進(jìn)行酯化的步驟。
87.權(quán)利要求86的方法，其中，酯部分為氨基酸。
88.權(quán)利要求87的方法，其中，氨基酸L-纈氨酸。
全文摘要
本發(fā)明提供制備β－D和β－L 2’－C－甲基－核苷和2’－C－甲基－3’－O－酯核苷的改進(jìn)方法。
文檔編號(hào)C07H19/00GK1744903SQ200380109576
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月12日
發(fā)明者理查德·斯托勒, 阿德?tīng)枴つ滤_, 納拉揚(yáng)·喬杜里, 弗蘭克·瓦利戈拉 申請(qǐng)人:埃迪尼克斯(開(kāi)曼)有限公司