專利名稱：用于治療受損的哺乳動物神經(jīng)組織的吡啶的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供了新的吡啶、包含這樣的吡啶的藥物組合物、以及這種組合物在治療包括但不限于受損的脊髓在內(nèi)的受損的哺乳動物神經(jīng)組織中的應用。在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物、組合物和方法通過恢復經(jīng)過神經(jīng)組織受損處的動作電位或神經(jīng)沖動傳導治療哺乳動物神經(jīng)組織損傷。值得注意地，在SSEP測試的基礎上，本發(fā)明化合物的體內(nèi)應用證實，所述化合物以比使用已知的4-氨基吡啶(4AP)試劑的對比治療更低的濃度提供了更長的持續(xù)作用。本發(fā)明的方法可以用于提高由疾病或物理損傷所引起的神經(jīng)細胞損害的修復。
背景技術：
脊髓損傷后功能喪失的生物學基礎是神經(jīng)沖動沿脊髓“上下”傳送的受阻。無論該損傷形成了多久，部分功能復原的基礎是這樣的神經(jīng)沖動的恢復—在本發(fā)明的情況下，這是通過藥物學手段實現(xiàn)的。
哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的機械損傷有時導致不可逆的功能缺陷。多數(shù)與外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)或中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)損傷相連的功能性缺陷源自神經(jīng)纖維或軸突的損傷，這阻礙了神經(jīng)沖動流沿神經(jīng)纖維的傳輸。這可以是因為由軸突所產(chǎn)生的導線的物理中斷。在膜不再作為離子屏障發(fā)揮作用，并/或成為病灶性脫髓鞘的情況下[Honmou，O.和Young，W.(1995)《脊髓軸突的創(chuàng)傷性損傷》(Traumatic injury to the spinalaxons)(Waxman，S.G.，Kocsis，J.D.，Stys，P.K.主編)《軸突》(The Axon)，NewYorkOxford UP，480-503頁；Maxwell，W.L.(1996)Histopathological changesat central nodes of ravier after stretch-injury，Microscopy Research andTechnique，34522-535；Maxwell，W.L.，Watt，C，Graham，DL，Gennarelli，LA.(1993)Ultrastructural evidence of axonal shearing as a result of lateralacceleration of the head in non-human primates，Acta Neuropathol，86136-144；Maxwell，W.L.，Graham，D.I.(1997)Loss of axonal microtubules andneurofilaments after stretch-injury to guinea pig optic nerve fibers，JNeurotrauma，14603-614；Blight，AR.(1993)《實驗性脊髓損傷中的髓鞘再形成、血運重建及功能的恢復》(Remyelination，Revascularization，and Recoveryof Function in Experimental Spinal Cord Injury)(Seil，F(xiàn).J.主編)《神經(jīng)生物學進展》(Advances in Neurobiology)《神經(jīng)損傷及再生》(Neural Injury andRegeneration)，59卷，New York，Raven Press，91-103頁]，也可能發(fā)生所述的阻斷。在其他情況下，功能性缺陷由于神經(jīng)沖動傳導的中斷而發(fā)生?，F(xiàn)在認為，即便是與脊髓損傷相連的嚴重的行動能力缺陷也主要是由于對白質(zhì)的最初機械性損傷造成的[Blight，A.R.Morphometric analysis of a model of spinal cord injuryin guinea pigs，with behavioral evidence of delayed secondary pathology，J.Neurolog.Sci.，103156-171，1991]。滯后卻進展性的所謂的“二級損傷”[Honmou和Young，W.(1995)《脊髓軸突的創(chuàng)傷性損傷》(Traumaticinjury to thespinal axons)(Waxman，S.G.，Kocsis，J.D.，Stys，P.K.主編)《軸突》(The Axon)，New YorkOxford UP 480-503頁；Young，W.(1993)Secondary injury mechanismsin acute spinal cord injury，J.Emerg.Med.，1113-22]隨后放大了該損傷，這導致形成空穴化的受損脊髓以及難以治療的行動能力的喪失等典型的臨床表現(xiàn)。
即便是在人們所經(jīng)受的臨床損傷中脊髓損傷是對脊髓的壓迫性傷害。由于真正的脊髓的解剖學橫斷在人體損傷中非常少見，認為脊髓損傷是“嚴重的”的流行觀點在很大程度上是不正確的。受傷以后，不同數(shù)量的脊髓白質(zhì)或“外殼”保持完整。然而，這一區(qū)域解剖學上完整的神經(jīng)纖維沒有發(fā)揮功能。具體而言，這一局部區(qū)域(通常小于1節(jié)脊椎的范圍)不能通過受損區(qū)域傳導神經(jīng)沖動。相信這是由于脫髓鞘作用以及其他因素的作用。使神經(jīng)傳導過程絕緣的髓磷脂的丟失或厚度減少引起Ranvier神經(jīng)節(jié)處的傳導中斷。這是因為所謂的“電壓閘”快速鉀離子通道位于髓磷脂絕緣層下的有髓鞘的神經(jīng)纖維的神經(jīng)節(jié)旁區(qū)域。在損傷后髓磷脂收縮或丟失的情況下，鉀離子通道簇暴露在細胞外液體中并也失去了其電絕緣性。通過這些裸露的通道的鉀離子丟失提高了鉀離子的細胞外濃度并協(xié)助抑制神經(jīng)沖動(實際上是這一局部神經(jīng)膜的去極性化)。的確，已知在脊髓損傷附近的細胞外微環(huán)境中富含鉀離子，這本身阻礙了神經(jīng)組織正常作用的能力[Eidelberg等，(1975)，Immediate consequencesof spinal cord injuryPossible role of potassium in axonal conduction block，Surg Neurol 3317-321]。
此外，髓磷脂電絕緣性的喪失促進了在其能開始穿過神經(jīng)節(jié)區(qū)域之前協(xié)助熄滅神經(jīng)沖動的鉀離子電流的短路[Blight A.R.(1993)，《實驗性脊髓損傷中的髓鞘再形成、血運重建及功能的恢復》(Remyelination，Revascularization，and Recoveryof Function in Experimental Spinal Cord Injury)(Seil，F(xiàn).J.主編)《神經(jīng)生物學進展》(Advances in Neurobiology)《神經(jīng)損傷及再生》(Neural Injury andRegeneration)，59卷，New York，Raven Press，91-103頁]。阻斷這一鉀離子從神經(jīng)纖維內(nèi)部外流到外界環(huán)境中去的藥物(稱為離子通道阻斷劑)被認為是患者中與不同程度功能恢復相關的經(jīng)脊髓損傷的動作電位(或神經(jīng)沖動)傳導的恢復的生物學基礎[Hayes K.C.等，(1993)Pre-clinical trial of 4-Aminopyridine in patientswith chronic spinal cord injury，Paraplegia 31216-224；Hayes K.C.(1994)4-Aminopyridine and spinal cord injuryA review，Restor NeurolNeurosci 6259-270；Hansebout R.R.，Blight等，(1993)4-Aminopyridine inchronic spinal cord injuryA controlled，double-blind，crossover study ineight patients.J Neurotrauma 1019-24]。僅有的此類藥物4-氨基吡啶(該藥物的緩釋形式被稱為氨吡啶)經(jīng)證明在對癱瘓病人的神經(jīng)功能恢復中具有前景。然而，僅在約30％經(jīng)治療的人群中產(chǎn)生具有臨床意義的功能恢復，并且總地來說，這些恢復與所需藥物濃度下發(fā)生的多種不必要的副作用相連。這樣的難以承受的副作用包括中度失去平衡感的暈眩直到癲癇發(fā)作的可能性。
這一問題如此重要以至于已經(jīng)在狗中采用將4 AP直接灌注入腦脊髓液[Pratt K.等，(1995)Plasma and cerebral spinal fluid concentrations of 4-Aminopyridinefollowing intravenous injection and metered intrathecal delivery in canines，J Neurotrauma 1223-39]，并最近已在6名患者中進行了試驗[Halter J.A.等，(2000)Intrathecal administration of 4-Aminopyridine in chronic spinalinjured patients，Spinal Cord 127828-232]。理論上這能在脊髓損傷處提供直接的藥物高濃度，從而避免了血液中的高濃度。雖然這樣的膜內(nèi)給藥是可能的，但它要求大范圍的復雜的手術以植入特殊的泵并將導管插入受損的脊髓。因此，需要有可用于治療脊髓損傷的并且沒有上述缺陷的改進的化合物、藥物組合物以及在方法。尤其需要通過體內(nèi)治療能降低對哺乳動物CNS組織(特別是脊髓組織)的創(chuàng)傷性損傷的破壞性作用的化合物、組合物和方法。
發(fā)明目的本發(fā)明的一個目的是提供能用于治療包括但不限于受損的脊髓在內(nèi)的受損的哺乳動物神經(jīng)組織的新的化合物、藥物組合物及方法。
本發(fā)明的進一步的目的是提供能用于治療包括但不限于受損的脊髓在內(nèi)的受損的哺乳動物神經(jīng)組織并恢復經(jīng)受損處的動作電位或神經(jīng)沖動傳導的新的化合物、藥物組合物及方法。
本發(fā)明的進一步的目的是提供通過體內(nèi)治療能降低對哺乳動物CNS組織(特別是脊髓組織)的創(chuàng)傷性損傷的破壞性作用的化合物、組合物和方法。
本發(fā)明的進一步的目的是提供能刺激神經(jīng)組織生長或增殖的化合物、組合物和方法。
本發(fā)明的更進一步的目的是提供能用于治療包括但不限于受損的脊髓在內(nèi)的受損的哺乳動物神經(jīng)組織、沒有不必要的副作用并能在需要時方便地對患者給藥的新的化合物、藥物組合物及方法。
發(fā)明概述按照上述目的，本發(fā)明提供了新的取代的吡啶、包含這種吡啶的藥物組合物以及在治療包括但不限于受損脊髓在內(nèi)的受損哺乳動物神經(jīng)組織中使用這樣的吡啶的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物、組合物以及方法通過經(jīng)受損處神經(jīng)組織的動作電位或神經(jīng)沖動傳導的恢復治療哺乳動物神經(jīng)組織損傷。值得注意地，基于下文中所定義的SSEP測試，本發(fā)明化合物的體內(nèi)應用顯示，所述化合物在比使用已知的4 AP試劑的對照治療更低的濃度下提供了更長的持續(xù)作用。所述化合物在體內(nèi)給藥的情況下，通過經(jīng)過神經(jīng)組織受損處的神經(jīng)沖動傳導的恢復降低了創(chuàng)傷性CNS組織損傷的有害作用。
本發(fā)明所述的化合物、組合物和方法相對沒有不必要的副反應并能在需要時方便地對患者給藥。本發(fā)明所述的取代的吡啶表現(xiàn)出以前沒有認識到的鉀離子通道阻斷活性，能夠安全地遞送給哺乳動物、能以比已知的4AP試劑更低的濃度發(fā)揮作用、并且其單一劑量應用對于延伸的時間段是有效的。本發(fā)明所述吡啶的例子用下式(I)表示。應當認識到，也包括本發(fā)明所述吡啶的藥學上可接受的鹽、溶劑化物以及多晶型物。
其中R1是H或C1-C4烷基；R2是 基團、 基團或OR基團；R3是H、C1-C20烷基、OR基團、亞烷基酯基團 胺基團-NR11R12或-(CH2)m＝，其中m是1-3并與R6形成環(huán)，R是C1-C20烷基(優(yōu)選C1-C6烷基)、芳基(優(yōu)選苯基)或亞烷基芳基(其中所述亞烷基是C1-C20亞烷基，優(yōu)選C1-C3亞烷基，并且所述芳基優(yōu)選是苯基)，R10是C1-C10烷基(優(yōu)選C1-C3烷基)，n是1到20(優(yōu)選1到3)，R11選自H、C1-C4烷基、芳基、亞烷基芳基(其中所述亞烷基長度為20個以內(nèi)碳單位并且所述芳基優(yōu)選苯基)或上述亞烷基酯基團，并且R12選自H、C1-C4烷基、芳基、亞烷基芳基(其中所述亞烷基長度為20個以內(nèi)碳單位并且所述芳基優(yōu)選苯基)或上述亞烷基酯基團或是-(CH2)z-基團，其中z是0到2，從而R12與R6形成環(huán)，并且優(yōu)選地其中當R11和R12之一不是H時，R11或R12中的另一個是H；R6是H、C1-C4烷基、F、Cl、Br、I、NO2或NR13R14基團，其中R13是H或C1-C3烷基并且R14是-(CH2)m-基團，其中m是0到3并在R3不存在的情況下與 基團形成環(huán)；并且R7、R8和R9各自獨立選自H、C1-C4烷基、F、Cl、Br、I或NO2，并且優(yōu)選地，R7、R8和R9中至少兩個，更優(yōu)選地其中三個基團是H。
本發(fā)明包括藥學上可接受的式(I)的化合物的酸加成鹽。用于制備上述本發(fā)明的堿性化合物的藥學上可接受的酸加成鹽的酸是那些形成無毒酸加成鹽(即含藥學上可接受的陰離子的鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、磷酸鹽、酸式磷酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酸式檸檬酸鹽、酒石酸鹽、酒石酸氫鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽、糖酸鹽、安息香酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽及雙羥萘酸鹽(即1，1’-亞甲基-雙(2-羥基-3萘甲酸鹽))的酸。
本發(fā)明也包括式(I)的堿加成鹽?？梢杂米髦苽涫?I)的那些在自然界中是酸性的化合物的藥學上可接受的堿式鹽的試劑的化學堿是那些與這樣的化合物形成無毒堿式鹽的堿。這樣的無毒堿式鹽包括但不限于那些源自諸如堿性金屬陽離子(例如鉀離子和鈉離子)和堿性稀土金屬陽離子(例如鈣離子和鎂離子)、銨離子這樣的藥學上可接受的陽離子的堿式鹽，或諸如N-甲基葡糖胺-(甲葡胺)的水溶性胺加成鹽、以及烷醇銨以及其他藥學上可接受的有機胺的堿式鹽。
本發(fā)明所述化合物包括式(I)的化合物的所有立體異構(gòu)體(即順式和反式異構(gòu)體)和所有光學異構(gòu)體(例如R和S對映體)，以及這樣的異構(gòu)體的外消旋的、非對映的以及其他混合物，以及所有該化合物的多晶型物。
本發(fā)明所述化合物可以包括類似烯烴的雙鍵。在存在這樣的化學鍵的情況下，本發(fā)明所述的化合物以順式和反式構(gòu)象和其混合物的形式存在。
除非另有說明，這里所述的烷基和烯烴基團以及這里所述的其他基團的烷基部分(例如烷氧基)可以是線性的或分枝的，并且它們也可以是環(huán)狀的(例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基)或是線性的或是分枝的并包括環(huán)狀部分。除非另有說明，鹵素包括氟、氯、溴和碘。
本發(fā)明也涉及治療受損的哺乳動物神經(jīng)組織(特別是受損的人的神經(jīng)組織)，包括降低CNS或PNS組織損傷的有害作用的方法，該方法包括給予有此需要的哺乳動物(優(yōu)選的是人)有效量的式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物。
本發(fā)明也涉及治療受損的哺乳動物神經(jīng)組織(特別是受損的人的神經(jīng)組織)，包括降低CNS或PNS組織損傷的有害作用的藥物組合物，該組合物包括(a)藥學上可接受的載體；以及(b)式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物。其中，活性化合物(即式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物)的量是該化合物在包括降低CNS或PNS組織損傷的有害作用的治療受損的哺乳動物神經(jīng)組織中有效的量。
本發(fā)明也涉及通過式(I)的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物的體內(nèi)給藥降低CNS或PNS組織損傷的有害作用、以及通過恢復經(jīng)過神經(jīng)組織受損處的動作電位或神經(jīng)沖動傳導治療相關的神經(jīng)組織損傷的方法。
本發(fā)明所述的化合物和藥物組合物可以用作神經(jīng)營養(yǎng)因子。這里所使用的術語“神經(jīng)營養(yǎng)因子”是指能刺激神經(jīng)組織生長或增殖的化合物。在這點上，它們可以單獨施用或與包括但不限于神經(jīng)生長因子(NGF)、胰島素生長因子(IGF-1)以及諸如gIGF-1的其活性截短衍生物、酸性和堿性成纖維細胞生長因子(分別是aFGF和bFGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT-3)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(NT-4/5)的已知神經(jīng)營養(yǎng)因子共同施用。
本發(fā)明所述化合物的體外測試已經(jīng)說明，它們不僅具有阻斷鉀離子通道的性質(zhì)，而且通常有助于特異性地激活神經(jīng)回路。此外，體內(nèi)測試確定了這些化合物在恢復經(jīng)過脊髓白質(zhì)(僅由神經(jīng)纖維構(gòu)成)受損區(qū)域的神經(jīng)沖動傳導的作用。表示脊髓經(jīng)過受損處傳播神經(jīng)沖動的上升誘發(fā)沖動排的能力并隨后在大腦進行記錄(如下文進一步說明的)的體感誘發(fā)電位測試(SSEP)確定了體內(nèi)SSEP恢復超過了正常SSEP(受傷前)的20％，并且超過了由4AP誘導的相似的SSEP恢復的恢復水平。值得注意的是，基于SSEP測試，本發(fā)明所述化合物的體內(nèi)應用說明了，這些化合物的僅一次應用以比對照的4AP治療更低的濃度提供了更長的持續(xù)效果。
本發(fā)明的更多方面在以下的詳細說明中進行說明。


圖1圖解說明了(i)用于在器官培養(yǎng)物中檢測復合動作電位經(jīng)過標準的擠壓傷向豚鼠脊髓白質(zhì)條帶傳播的兩個蔗糖缺口隔室及記錄室(A部分)，(ii)單一的誘發(fā)CAP(B部分)，(iii)多個重復性CAPs(C部分)，(iv)經(jīng)受標準的擠壓傷后通過髓索的CAP傳導(D部分)，以及(v)藥物介入后CAP開始再次出現(xiàn)。
圖2圖解了用于檢測體內(nèi)本發(fā)明所述化合物的SSEP測試方案并反映了完好的動物中的正常記錄、中胸脊髓損傷后感官沖動的消失以及中央神經(jīng)控制過程的重要性。
圖3圖解了正常SSEP真實的、未編輯的電流記錄，并說明本發(fā)明所述的一種化合物N-(4吡啶基)氨基甲酸甲酯體內(nèi)給藥引起的接近正常皮層電位(P1)的快速建立。
圖4舉例說明了本發(fā)明所述吡啶衍生物某些實施例的結(jié)構(gòu)式。
圖5舉例說明了本發(fā)明所述吡啶衍生物更多實施例的結(jié)構(gòu)式。
圖6圖解說明了用于在器官培養(yǎng)物中檢測復合動作電位經(jīng)過標準的擠壓傷向豚鼠脊髓白質(zhì)條帶傳播的兩個蔗糖缺口隔室及記錄室。
圖7說明了在麻醉的豚鼠中的SSEP的測量。
圖8說明了恢復的復合神經(jīng)沖動對本發(fā)明所述化合物的存在的反應。
發(fā)明詳述如這里所述，以下術語具有相應的以下意義?！?AP”是指4-氨基吡啶?！半p蔗糖缺口隔室和記錄室(Double sucrose gap isolation and recordingchamber)”是在檢測經(jīng)過標準的擠壓傷向器官培養(yǎng)物中的豚鼠脊髓白質(zhì)條帶的復合動作電位傳播中使用的新的方法。脊髓損傷后行動能力的喪失的生物學基礎是從來自身體的神經(jīng)“輸入”的神經(jīng)沖動從脊髓到大腦的上升神經(jīng)沖動運輸?shù)闹袛?，以及反向的—大腦中產(chǎn)生的沖動傳輸在脊髓下行到達身體中的目標的喪失。因此，這一檢測工具是對于癱瘓的重要的和有關的生物學基礎的最初評價。雙蔗糖缺口室是在進行更艱巨和費時的在“完整”動物中檢測類似功能狀況之前對多種藥物學干預進行“初篩”的特別的方法，該方法獨立于諸如最佳給藥途徑(例如靜脈內(nèi)或口服給藥)等只能在動物測試中進行評價的其他實際考慮因素。
如圖6所示，隔離的脊髓(點畫帶)顯示放置在隔室內(nèi)，并且中心池(central cell)連續(xù)用氧化的克雷布斯液(類似于細胞外液體)灌注。向該隔室添加待測藥物。脊髓的兩端位于通過充滿流動的等滲蔗糖溶液的狹窄的缺口從所述中心池隔開的充滿等滲KCl(類似于細胞內(nèi)液體)的獨立的池中。電極由Ag/AgCl金屬絲形成。動作電位經(jīng)過蔗糖缺口左側(cè)的一對電極產(chǎn)生，經(jīng)過所述脊髓的中央部分傳導并由缺口右側(cè)的另一對電極通過常規(guī)的橋聯(lián)放大技術進行記錄。脊髓的壓縮在其近似中點在中央的含克雷布斯液的隔室中進行。這隨后干擾了通過脊髓向位于遠端的記錄電極的復合動作電位的傳導。
如上所述，一條長度約為35-40毫米的剝離的脊髓白質(zhì)(從成年豚鼠獲得)被置于所述隔室內(nèi)并通過蠕動泵連續(xù)傾注氧化的克雷布斯液(2毫升/毫米)。所述脊髓條的自由端穿過蔗糖缺口置于充滿等滲(120mM)氯化鉀的旁室。所述隔室的的溫度用位于底部的采用電熱調(diào)節(jié)系統(tǒng)(Cambion Instruments)恒溫的Peltier單元進行保持。刺激神經(jīng)軸突并通過位于側(cè)面隔室和中心池中的Ag/AgCl金屬絲電極記錄白質(zhì)條帶另一端的復合動作電位以及復合膜電位(以缺口電位的形式)。中心池與設備的地線相連。刺激信號通過刺激隔離單元進行傳輸并通常是以0.1毫秒恒定電流單極脈沖的形式。使用橋聯(lián)放大器和將數(shù)字數(shù)據(jù)儲存在錄像帶上的神經(jīng)記錄器(均來自Neurodata Instruments Inc.)進行記錄。使用定制的Labview軟件(NationalInstruments)在Macintosh Power PC G3計算機上進行隨后的分析。這些過程以及雙蔗糖缺口隔室的構(gòu)建描述在Moriarty，L.J.；Duerstock，B.S.；Bajaj，C.L.；Lin，K.；Borgens，R.B.Two and Three Dimensional Computer Graphic Evaluationof the Subacute Spinal Cord Injury.J.Neurologic.Sci.1998，155，121-137；Borgens，R.B.；Shi，R.；Bohner，T.D.Behavi oral Recovery from Spinal CordInjury Following Delayed Application of Polyethylene Glycol.Journal ofExperimental Biology，2002，205，1-12中，這些文獻被并入本文作為參考。
在這里所使用的涉及本發(fā)明所述新的吡啶的情況下，“有效量”是指當對患者或受試者給藥時，足以導致不能正常行使功能的已經(jīng)損壞或傷害的神經(jīng)在電的和/或動作功能上可測量的改善的所述化合物的數(shù)量。如下所述，治療的功效可以通過多種方法確定，這包括檢測神經(jīng)功能恢復的方法。關于術語“有效量”對于其他物質(zhì)(例如4AP)的使用，該術語用于說明所述物質(zhì)在本發(fā)明中使用的背景的范圍內(nèi)一種物質(zhì)有效的數(shù)量。
這里所使用的“神經(jīng)組織”是指任何脊椎動物的神經(jīng)組織，尤其包括哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)的細胞。更具體地說，神經(jīng)組織包括脊髓神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)以及還有腦神經(jīng)細胞。
“神經(jīng)組織損傷”、“受損的哺乳動物神經(jīng)組織”或“CNS或PNS神經(jīng)組織損傷”包括任何原因引起的相應神經(jīng)組織的損傷，例如由包括但不限于神經(jīng)組織損傷、創(chuàng)傷性引發(fā)的壓縮、腫瘤、出血、感染性過程、脊椎狹窄或血液供應減少等創(chuàng)傷引起的損傷。
“治療受損的哺乳動物神經(jīng)組織”包括但不限于本發(fā)明所述化合物、組合物和方法的體內(nèi)應用以恢復經(jīng)過神經(jīng)組織受損處的動作電位或神經(jīng)沖動傳導。該術語也可以包括無論是否通過動作電位或神經(jīng)沖動傳導的恢復，通過刺激神經(jīng)組織生長或增殖、通過改善損傷處附近細胞外微環(huán)境的有害狀態(tài)或其他方式的旨在降低任何損傷對哺乳動物神經(jīng)組織的有害影響的用藥。
這里所使用的“神經(jīng)營養(yǎng)因子”是指能夠刺激神經(jīng)組織生長或增殖的化合物，這包括本發(fā)明所述化合物以及這里先前所述的已知的神經(jīng)營養(yǎng)因子。
“體感誘發(fā)電位測試(SSEP)”是一種測量“完整”動物中上行神經(jīng)沖動“傳輸”的方法。SSEP表示脊髓經(jīng)受損處傳播隨后在腦部記錄的神經(jīng)沖動的上行誘發(fā)沖動排的能力。誘發(fā)電位的這些沖動排由動物后肢的脛骨神經(jīng)的電刺激誘發(fā)，該刺激在完整動物中引起疼痛感應沖動的上行感應沖動排向大腦對側(cè)感覺皮層的傳輸。嚴重的脊髓損傷抑制了誘發(fā)電位經(jīng)過受損處的能力并從而在損傷后SSEP沒有在腦部進行記錄。經(jīng)過整個動物的SSEP傳導恢復的定量評價提供了這些化合物可以用于在具體的、局部的、和標準的CNS損傷后逆轉(zhuǎn)動作能力喪失中的可能新的更相關的指標。為了消除可能由于其他因素引起的無法記錄SSEP的可能性，使用前肢正中神經(jīng)進行對照記錄。由于所述神經(jīng)回路完全完好的(即“高于”脊髓損傷的水平)，正常SSEP必須在這樣的“對照”刺激之后獲得。圖2是這一測試方案的圖解并提供了在完好的動物中正常記錄、中胸脊髓損傷后感官沖動的消失的例子，并詳細解釋了這些結(jié)果，并且這強調(diào)了正中神經(jīng)對照步驟的重要性。
“神經(jīng)束”、“長神經(jīng)束”以及“CAPS”具有以下含義。在脊髓中(獨立于腦)，長的未破損的神經(jīng)纖維束(稱為“神經(jīng)束”)有時在脊索的整個長度上攜帶其上行和下行的神經(jīng)沖動(“長神經(jīng)束”)。在這樣的“長神經(jīng)束”(諸如脊柱路徑、脊髓下丘腦神經(jīng)束)上攜帶的神經(jīng)沖動是CAPs。在完整的動物中，受到例如應用于足部的疼痛刺激所刺激的神經(jīng)沖動沿脊髓上行到達腦—到達大腦感官皮層的軀體感官區(qū)。雖然CAPs從脊髓上行至后腦可以不具有神經(jīng)突觸介導的從一個神經(jīng)元至另一個神經(jīng)元的傳導，從后腦到達皮層的方式則截然不同，其中在不同區(qū)域數(shù)以百計的神經(jīng)突觸從一個腦神經(jīng)元到下一個腦神經(jīng)元“接力”傳導神經(jīng)沖動最終到達感官皮層。這里是應用于足部的疼痛刺激最終被意識所認識的區(qū)域。與CAPs不同，這些上行CAPs與通過大腦復雜神經(jīng)回路的神經(jīng)突觸傳遞共同稱為“誘發(fā)電位”。CAPs通過脊髓白質(zhì)的有限區(qū)域進行測量，而誘發(fā)電位代表通過整個動物的傳導。脊髓損傷阻段了通過脊髓的CAP傳導(圖1)不過它當然也消除了整個動物中通過脊髓的神經(jīng)傳導。
I.新的吡啶的合成其結(jié)構(gòu)式如圖4和5所示的本發(fā)明所述的典型的化合物的合成按以下詳細所述的步驟進行。然而需要認識到，具有式(I)的新的吡啶的其他衍生物和取代物也在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。
具有式(I)的這些典型化合物的原材料是有商業(yè)現(xiàn)貨的或本領域內(nèi)已知的。例如，4-(甲氨基)吡啶購自Lancaster Synthesis。4-(二甲氨基)吡啶購自Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI。以下的酰胺和尿素使用常規(guī)方法合成，例如，這些方法描述在Ghosh，S.；Krishnan，A.；Das，P.K.Ramakrishnan，S.Determination of Critical MicelleConcentration by Hyper-Rayleigh Scattering.J.Am.Chem.Soc.2003，125，1602-1606；Kato，T.；Yamamoto，Y.；Takeda，S.Ketene and Its Derivatives.IV.Reaction of Primary Amine with Ketene Acetals.Yakugaku Zasshi 1973，93(8)，1034-1042；Meanwell，N.A；Sit，S.Y.；Gao，J.；Wong，H.S.；Gao，O.；St.Laurent，D.R.；Balasubramanian，N.Regiospecific Functionalization of1，3-Dihydro-2H-benzimidazol-2-one and Structurally Related Cyclic UreaDerivatives.J.Org.Chem.1995，60，1565-1582；Kovalenko，A.L.；Serov，Y.V.；Nikonov，A.A.；Tselinskii，IV.Aminomethylation of N，N’-and N，N，N’-Substituted Ureas with N-Methylene-tert-butylamine.Zhur.Org.Khim.1991，27(10)，2074-2077，所有這些文獻都被并入本文作為參考。
以下氨基甲酸酯由4-AP合成。
R＝甲基、乙基或叔丁基4-AP購自Richman Chemical Co.，Lower Gwynedd，PA。所有試劑收到后直接使用而不再進一步純化。熔點使用Thomas Hover熔點儀在毛細管中測定并未作修正。NMR光譜在Bruker ARX-300裝置上通過使用指示溶劑獲得。
N-(4-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯(1)的合成。在0℃下向三乙胺/CH2Cl2(1∶1，200毫升)中的4-氨基吡啶溶液(50.0g，531mmol)中緩慢加入CH2Cl2(150毫升)中的二碳酸二叔丁酯(di-t-butyl-dicarbonate)溶液(116g，531mmol)。所得混合物過夜加熱至室溫隨后進行濃縮。粗產(chǎn)物在熱的乙酸乙酯中溶解，過濾并用正己烷沉淀。沉淀通過過濾收集，用正己烷洗滌并真空干燥以產(chǎn)生91.0g(得率88％)純的氨基甲酸叔丁酯。Mp＝147-148℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ8.97(s，1H，N-H)；8.39(d，J＝5.2Hz，2H，Ar)；7.41(d，J＝5.2Hz，2H，Ar)；1.46(s，9H，t-Bu)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ153.1(C＝O)；150.3(Ar)；147.3(Ar)；113.0(Ar)；81.5(O-C-R3)；28.6(Me)。C10H14N2O2(分子量194.23)的計算值C＝61.84，H＝7.27，N＝14.42。實測值C＝61.60，H＝7.05，N＝14.50。
N-(4-吡啶基)氨基甲酸乙酯(2)的合成。在0℃下向CH2Cl2(200mL)中的4-氨基吡啶(20.0g，212mmol)溶液中加入三乙胺(30.0mL，212mmol)和氯甲酸乙酯(20.3mL，212mmol)。所得混合物過夜加熱至室溫隨后進行濃縮。固體產(chǎn)物用飽和的NaHCO3水溶液調(diào)成漿狀，攪拌1小時，濃縮并真空干燥。粗產(chǎn)物用熱的MeOH(500mL)制漿1小時、過濾并濃縮濾出液。粗氨基甲酸酯從甲苯/正己烷中重結(jié)晶以產(chǎn)生31.8g(得率90％)純的氨基甲酸乙酯。Mp＝127-128℃。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ10.02(s，1H，N-H)；8.56(d，J＝6.2Hz，2H，Ar)；7.63(d，J＝6.2Hz，2H，Ar)；4.33(q，J＝7.1Hz，2H，OCH2)；1.38(t，J＝7.1Hz，3H，Me)。13C NMR(75MHz，CDCl3)δ154.3(C＝O)；150.2(Ar)；147.3(Ar)；113.3(Ar)；61.8(OCH2)；14.8(Me)。C8H10N2O2(分子量166.18)的計算值C＝57.82，H＝6.07，N＝16.86。實測值C＝58.01，H＝5.92，N＝16.62。
N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯(3)的合成。在0℃下向CH2Cl2(200mL)中的4-氨基吡啶(20.0g，212mmol)溶液中加入三乙胺(30.0mL，212mmol)和氯甲酸甲酯(16.4mL，212mmol)。所得混合物過夜加熱至室溫隨后進行濃縮。固體產(chǎn)物用飽和的NaHCO3水溶液調(diào)成漿狀，攪拌1小時，濃縮并真空干燥。粗產(chǎn)物用熱的MeOH(500mL)制漿1小時、過濾并濃縮濾出液。粗氨基甲酸酯從甲苯/正己烷中重結(jié)晶以產(chǎn)生15.5g(得率48％)純的氨基甲酸甲酯。
以下過程也可用于合成N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯(3)在0℃下向CH2Cl2(200mL)中的4-氨基吡啶(15.0g，160mmol)溶液中加入三乙胺(30.0mL，212mmol)并隨后加入氯甲酸甲酯(15.0mL，192mmol)。粗氨基甲酸酯從水中重結(jié)晶以生成15.9g(得率66％)純的氨基甲酸甲酯12。Mp＝168-170℃。1H NMR(300MHz，MeOH-d4)δ8.49(d，J＝6.5Hz，2H，Ar)；7.67(d，J＝6.5Hz，2H，Ar)；5.22(br s，1H，N-H)；3.94(s，3H，OMe)。13C NMR(75MHz，MeOH-d4)δ156.0(C＝O)；151.0(Ar)；149.2(Ar)；114.3(Ar)；53.3(OMe)。C7H8N2O2(分子量152.15)的計算值C＝55.26，H＝5.30，N＝18.41。實測值C＝55.29，H＝5.31，N＝18.20。
N-(4-吡啶基)氨基甲酸異丙酯(4)的合成。在0℃下向CH2Cl2(50mL)中的4-氨基吡啶(2.00g，21.2mmol)溶液中加入三乙胺(3.50mL，25.0mmol)和氯甲酸異丙酯(22.0mL，1.0M溶于甲苯中)。除去冰浴并將所得的混合物在2小時內(nèi)加熱至室溫。反應混合物通過硅膠(乙酸乙酯)塞過濾后濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯中重結(jié)晶以生成1.90g(得率50％)純的氨基甲酸異丙酯。
N-(4-吡啶基)氨基甲酸十二烷酯(5)的合成。在0℃下向CH2Cl2(50mL)中的4-氨基吡啶(3.00g，31.9mmol)溶液中加入三乙胺(5.60mL，40.0mmol)和氯甲酸十二烷酯(8.70g，35.0mmol)。除去冰浴并將所得的混合物在3小時內(nèi)加熱至室溫，隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中。從CH2Cl2中提取產(chǎn)物，用鹽水洗滌、干燥(MgSO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯/正己烷中重結(jié)晶以產(chǎn)生8.80g(得率90％)純的氨基甲酸十二烷酯。
N-(4-吡啶基)氨基甲酸芐酯(6)的合成。在0℃下向CH2Cl2(30mL)中的4-氨基吡啶(2.00g，21.2mmol)溶液中加入三乙胺(3.50mL，25.0mmol)和氯甲酸芐酯(3.10g，22.0mmol)。除去冰浴并將所得的混合物過夜加熱至室溫，隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中。從CH2Cl2中提取產(chǎn)物、干燥(Na2SO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯中重結(jié)晶以產(chǎn)生2.90g(得率60％)純的氨基甲酸芐酯。
N-(4-吡啶基)苯甲酰胺(7)的合成。在0℃下向CH2Cl2(50mL)中的4-氨基吡啶(3.00g，31.9mmol)溶液中加入三乙胺(6.70mL，47.9mmol)和苯甲酰氯(3.70mL，31.9mmol)。除去冰浴并將所得的混合物在1.5小時內(nèi)加熱至室溫。反應用飽和的NaHCO3水溶液終止，用CH2Cl2萃取產(chǎn)物、用鹽水洗滌、干燥(MgSO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯/正己烷中重結(jié)晶以產(chǎn)生4.73g(得率75％)純的苯甲酰胺。
N-(4-吡啶基)乙酰胺(8)的合成。在0℃下向CH2Cl2(30mL)中的4-氨基吡啶(2.00g，21.2mmol)溶液中加入三乙胺(3.60mL，25.6mmol)和醋酸酐(2.20mL，23.2mmol)。除去冰浴并將所得的混合物過夜加熱至室溫，隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中?；旌衔飻嚢?5分鐘隨后進行分層。水相層以相同方式用CH2Cl2再萃取2次。對合并的有機層進行干燥(Na2SO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯中重結(jié)晶以產(chǎn)生1.60g(得率56％)純的乙酰胺。
N-(4-吡啶基)丙酰胺(9)的合成。在0℃下向CH2Cl2(30mL)中的4-氨基吡啶(3.00g，31.9mmol)溶液中加入三乙胺(6.70mL，47.8mmol)和丙酰氯(3.30mL，38.2mmol)。除去冰浴并將所得的混合物在4小時內(nèi)加熱至室溫，隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中?；旌衔飻嚢?5分鐘并過濾。濾餅從乙酸乙酯中重結(jié)晶以生成1.65g(得率50％)純的丙酰胺。
N-(4-吡啶基)三甲基乙酰胺(10)的合成。在0℃下向CH2Cl2(30mL)中的4-氨基吡啶(2.00g，21.2mmol)溶液中加入三乙胺(3.50mL，25.0mmol)和三甲基乙酰氯(2.70mL，23.2mmol)。除去冰浴并將所得的混合物過夜加熱至室溫，隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中?；旌衔飻嚢?分鐘隨后進行分層。水相層以相同方式用CH2Cl2再萃取2次。對合并的有機層進行干燥(Na2SO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯中重結(jié)晶以產(chǎn)生1.40g(得率37％)純的三甲基乙酰胺。
N-(4-吡啶基)琥珀酰胺酸乙酯(N-(4-Pyridyl)Ethyl Succinamate)(11)的合成。在0℃下向CH2Cl2(50mL)中的4-氨基吡啶(1.50g，16.0mmol)溶液中加入三乙胺(3.50mL，25.0mmol)和4-氧-4-氯丁酸乙酯(2.25mL，16.0mmol)。所得的混合物攪拌1.5小時隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中?；旌衔飻嚢?分鐘隨后進行分層。水相層用CH2Cl2再萃取2次。合并的有機層干燥(Na2SO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從乙酸乙酯/正己烷中重結(jié)晶以產(chǎn)生590mg(得率17％)純的琥珀酰胺酸酯。
N，N’-(4-吡啶基)脲(12)的合成。將苯(50mL)中的4-氨基吡啶(3.00g，31.9mmol)與羰基二咪唑(5.17g，32.0mmol)的混合物回流5小時。反應混合物進行濃縮并且粗產(chǎn)物從水中重結(jié)晶以生成1.60g(得率47％)純的脲。
N，N’-(3，4-吡啶基)脲(13)的合成。將苯(50mL)中的3，4-二氨基吡啶(2.50g，23.0mmol)與羰基二咪唑(7.50g，46.0mmol)的混合物回流4小時，隨后注入水中。所得的混合物用1.0M HCl酸化并分層。水相層的pH值用飽和的NaHCO3水溶液調(diào)節(jié)到約4.0隨后濃縮溶液。固體產(chǎn)物真空干燥16小時隨后用熱的MeOH混合制漿。過濾漿狀混合物并濃縮濾出液。粗產(chǎn)物從水中重結(jié)晶以產(chǎn)生2.63g(得率85％)純的脲。
P，P-二苯基N-(4-吡啶基)膦酰胺(P，P-diphenyl N-(4-pyridyl)Phosphinamide)(14)的合成。向CH2Cl2(30mL)中的4-氨基吡啶(1.00g，10.6mmol)溶液中加入三乙胺(1.70mL，12.0mmol)和二苯基次膦酸氯(2.00mL，10.6mmol)。反應混合物攪拌6小時隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中。所得的混合物攪拌15分鐘隨后進行分層。水相層用CH2Cl2再萃取2次。合并的有機層干燥(Na2SO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從MeOH/水中重結(jié)晶以產(chǎn)生2.69g(得率86％)純的膦酰胺(Phosphinamide)。
4-吡啶基氨基磷酸，聯(lián)苯酯(15)的合成。在CH2Cl2(30mL)中的4-氨基吡啶(1.00g，10.6mmol)溶液中加入三乙胺(2.20mL，16.0mmol)和聯(lián)苯氯磷酸酯(2.30mL，11.0mmol)。反應混合物攪拌3小時隨后注入飽和的NaHCO3水溶液中。所得的混合物攪拌15分鐘隨后進行分層。水相層用CH2Cl2再萃取2次。合并的有機層干燥(Na2SO4)并濃縮。粗產(chǎn)物從MeOH/EtO中重結(jié)晶以產(chǎn)生1.36g(得率39％)純的氨基磷酸二酯。
除非另有說明，上述每個反應的壓力不是關鍵的。通常，所述反應應在約1個到約3個大氣壓的壓力下進行，優(yōu)選環(huán)境壓力(約1個大氣壓)。
其本質(zhì)是堿性的具有式(I)的化合物能與各種無機和有機酸形成多種不同的鹽。雖然這樣的鹽對動物給藥必須是藥學上可接受的，在實踐中經(jīng)常希望首先從反應混合物中以藥學上不可接受的鹽的形式分離具有式(I)的化合物并隨后簡單地通過用堿性試劑處理將其轉(zhuǎn)化成游離堿化合物，并隨后將所述游離堿轉(zhuǎn)化成藥學上可接受的酸加成鹽。本發(fā)明所述堿化合物的酸加成鹽通過用基本相當量的選取的礦物或有機酸在水性溶劑媒介中或在諸如甲醇或乙醇的適當有機溶劑中對所述堿化合物進行處理方便地進行制備。溶劑經(jīng)過仔細蒸發(fā)獲得所需的固體鹽。
用于制備本發(fā)明所述堿性化合物的藥學上可接受的酸加成鹽的酸是那些形成無毒酸加成鹽(即含藥學上可接受的陰離子的鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硝酸鹽、硫酸鹽或硫酸氫鹽、磷酸鹽或酸性磷酸鹽、醋酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽或酸性檸檬酸鹽、酒石酸鹽或酒石酸氫鹽、琥珀酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、葡萄糖酸鹽、糖酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、以及雙羥萘酸鹽(即1，1’-亞甲基-雙(2-羥基-3萘甲酸鹽))的酸。
那些本質(zhì)也是酸性的具有式(I)的化合物能夠與多種藥學上可接受的陽離子形成堿加成鹽。這樣的鹽的例子包括堿性金屬或堿性稀土金屬以及尤其是鈉鹽和鉀鹽。這些鹽都通過常規(guī)技術進行制備。用作制備本發(fā)明所述藥學上可接受的堿式鹽的試劑的化學堿是那些與這里所述具有式(I)的酸性化合物形成無毒堿式鹽的堿。這些無毒堿式鹽包括那些源自諸如鈉、鉀、鈣和鎂等等藥學上可接受的陽離子的鹽。這些鹽可以通過用含所需藥學上可接受的陽離子的水溶液對相應的酸性化合物進行處理，并隨后將所得的溶液蒸干(優(yōu)選在減壓條件下)方便地進行制備。另外，它們也可以通過將酸性化合物的較低烷醇溶液與所需堿性金屬醇鹽共同混合，并隨后用于前述相同的方式將所得的溶液蒸干。在任何一種情況下，使用了優(yōu)選的試劑化學計量量以確保反應完全和最大的產(chǎn)物得率。
本發(fā)明所述組合物使用一種或多種藥學上可接受的載體以傳統(tǒng)方式進行配制。可以在這些藥物組合物中使用的藥學上可接受的載體包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(如人血清白蛋白)、緩沖物質(zhì)(如磷酸鹽)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解液(如醇溶蛋白硫酸鹽)、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠體硅、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素衍生物、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
本發(fā)明所述組合物可以通過口服、非經(jīng)消化道的注射、噴霧劑吸入、局部用藥、直腸用藥、鼻噴、口腔用藥、陰道用藥或通過植入的儲器進行給藥。這里所使用的術語“非經(jīng)消化道的注射”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、損傷處以及顱內(nèi)注射或灌注技術。優(yōu)選地，所述化合物通過口服、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射給藥。
無菌可注射形式的本發(fā)明所述組合物可以是水性或油質(zhì)的懸浮液。這些懸浮液可以按照本領域內(nèi)已知的技術使用分散劑或潤濕劑和懸浮劑進行配制。無菌的注射用制劑也可以是位于無毒的非經(jīng)消化道注射所可接受的稀釋液或溶劑中的無菌的注射用溶液或懸浮液，例如象位于1，3-丁二醇中的溶液。除了可以使用的其他可接受的媒介和溶劑之外，可以使用水、林格溶液和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油是常規(guī)使用的溶劑或懸浮介質(zhì)。為此，可以使用包括單甘油酯或雙甘油酯的任何溫和的不揮發(fā)油。諸如油酸和其甘油酯衍生物的脂肪酸，以及諸如橄欖油或蓖麻油的天然的藥學上可接受的油(特別是其polyoxyothylated形式)可用于制備注射劑。這些油溶液或懸浮液可以包含長鏈醇稀釋劑或分散劑，諸如Ph.Helv或類似的醇。
本發(fā)明所述藥物組合物可以包括但不限于膠囊、藥片、水性懸浮液或溶液在內(nèi)的任何口服所可接受的劑量形式口服給藥。在口服藥片的情況下，通常使用的載體包括乳糖和玉米淀粉。通常也添加諸如硬脂酸鎂的潤滑劑。對于口服的膠囊形式，有用的稀釋劑包括乳糖和干的玉米淀粉。當口服需要水性懸浮液時，活性成分與乳化劑和懸浮劑組合使用。如果需要，也可以添加某些甜味劑、芳香劑或著色劑。
另外，本發(fā)明所述的藥物組合物可以以用于直腸給藥的栓劑的形式給藥。這可以通過將所述物質(zhì)與適當?shù)臒o刺激性賦形劑混合，所述賦形劑在室溫下是固體但在直腸溫度下是液體，從而會在直腸中溶化并釋放藥物。這樣的材料的包括可可油、蜂蠟和聚乙二醇。
本發(fā)明所述的藥物組合物也可以局部給藥，特別是在治療的標靶包括通過局部用藥易于到達的部位和器官，這包括眼睛、皮膚或下消化道的疾病。適當?shù)木植渴褂门浞綄γ總€部位或器官方便地進行制備。
直腸栓劑劑型(見上述)或適當?shù)墓嗄c劑劑型可以實現(xiàn)對于下消化道的局部使用。也可以使用局部透皮藥膏。
對于局部應用，所述藥物組合物可以在適當?shù)暮瑧腋≡诨蛉芙庠谝环N或多種載體中的活性成分的油膏內(nèi)進行配制。用于本發(fā)明所述化合物的局部給藥的載體包括但不限于礦物油、液體礦脂、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟和水。另外，所述藥物組合物可以在適當?shù)暮瑧腋∮诨蛉芙庥谝环N或多種藥學上可接受的載體中的活性成分的洗液或乳膏中進行配制。適當?shù)妮d體包括但不限于礦物油、山梨聚糖單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨蠟酯蠟、棕櫚醇、2-辛基十二碳醇、苯甲醇和水。
對于用于眼部，所述藥物組合物可以以含或不含諸如苯扎氯銨(benzylalkoniumchloride)的防腐劑的等滲的、pH調(diào)節(jié)的無菌生理鹽水中微粉化的懸浮液或優(yōu)選地以等滲的、pH調(diào)節(jié)的無菌生理鹽水中溶液的形式進行配制。另外，對于眼部應用，所述藥物組合物可以在諸如凡士林的油膏中進行配制。
本發(fā)明所述的藥物組合物也可以通過鼻噴或吸入給藥。這樣的組合物按照藥物劑型領域所熟知的技術進行制備并可以使用苯甲醇或其他適當?shù)姆栏瘎⒃鰪娚锼幮实奈沾龠M劑、氟碳化合物、以及/或其他常規(guī)的增溶劑或分散劑以生理鹽水中的溶液的形式進行制備。
與載體材料組合以形成單一劑量形式的本發(fā)明所述的新的吡啶的量應取決于所治療的對象和給藥的具體方式。優(yōu)選地，所述組合物應當這樣配制以使得劑量介于約5-100mg/kg之間，更優(yōu)選地對接受這些組合物的患者可以給予每天每千克體重約10-50mg所述新的吡啶。
也應當理解，對于特定患者的具體劑量和治療計劃應取決于包括所使用具體化合物的活性、年齡、體重、整體健康狀況、性別、飲食、給藥時間、排泄速度、藥物組合、以及主治醫(yī)師的判斷和所治療的特定疾病或損傷的嚴重程度等多種因素。
按照另一種實施方案，本發(fā)明提供了一種以單一劑量形式或單獨的、多個劑量形式將新的吡啶化合物和神經(jīng)營養(yǎng)因子給藥的方法。如果使用單獨劑量形式，取決于所述物質(zhì)的生物藥效率和藥代動力學，它們可以同時給藥、連續(xù)給藥或在小于約12小時內(nèi)相繼給藥，更優(yōu)選地在小于約8小時內(nèi)相繼給藥。
優(yōu)選地，本發(fā)明所述方法用于恢復患者體內(nèi)經(jīng)過神經(jīng)組織受損處的神經(jīng)沖動傳導。
本發(fā)明所述的方法和組合物可以用于治療由多種疾病或物理性創(chuàng)傷所引起的神經(jīng)損傷。這包括但不限于阿爾茨海默病、帕金森病、ALS、中風以及中風相關的缺血、神經(jīng)系統(tǒng)癱瘓、其他神經(jīng)系統(tǒng)退化疾病、運動神經(jīng)元疾病、坐骨神經(jīng)擠壓變形、脊髓損傷和面部神經(jīng)擠壓。本發(fā)明所述化合物可以單獨或作為組合治療的一部分給藥。如果是活性成分的組合給藥，則它們可以同時、分別或順序給藥。
II.新的吡啶引起神經(jīng)沖動傳導恢復的體外測試對本發(fā)明所述新的吡啶的潛在治療價值的體外篩選說明了其在恢復通過脊髓白質(zhì)(僅由神經(jīng)纖維構(gòu)成)受損區(qū)域的神經(jīng)沖動傳導中的效果。為了展示相對體內(nèi)測試的進步，用于絕緣性受損的脊髓的水溶液中的任何化合物應當在應用后至少15分鐘內(nèi)表現(xiàn)出復合動作電位傳導這樣的部分恢復[Shi R，Pryor JD(2002)，Pathologicalchanges of isolated spinal cord axons in response to mechanical stretch，Neuroscience 110765-77]。如圖1和6所示，使用雙蔗糖缺口隔離和記錄室(見前文說明)的所述新的吡啶的體外測試滿足這一標準。在恢復神經(jīng)沖動傳導中這樣的復合作用通過檢測通過標準的擠壓傷向器官培養(yǎng)物中豚鼠脊髓白質(zhì)的復合動作電位的傳播進行測定。
如先前所公開的，脊髓損傷后行動能力喪失的生物學基礎是來自軀體的神經(jīng)“輸入”到腦部的沿脊髓“上行”神經(jīng)沖動傳輸?shù)闹袛?，以及反向的—腦中產(chǎn)生的沿脊髓“下行”至軀體靶標的沖動傳輸?shù)膯适?。因此，這一檢測手段是對于癱瘓而言關鍵的和相關的生物學基礎的最初評價。
雙蔗糖缺口體外記錄現(xiàn)在參見圖6，該圖表示了雙蔗糖缺口記錄和隔離室。從深度麻醉的動物體內(nèi)(見下文)快速剝離豚鼠的完整脊髓并置于緩沖的、充入二氧化碳的克雷布斯液中備用。在置于隔室中之前，通常將脊髓縱向切開以分離主要由白質(zhì)構(gòu)成的隨后置于隔室中的長條(約38-40mm)。存在3個大的含有不同液體介質(zhì)的隔間不斷泵入和去除(通過吸引的方法)氧化的克雷布斯液的中央隔室和充滿等滲KCl的兩端隔室。所述脊髓長度橫跨所有3個隔室連同位于隔室之間的兩個小水池。這些小的水池含有不斷泵入并吸走的蔗糖。蔗糖有助于將脊髓的末端與位于生理溶液中的中間部分分離。脊髓一端的刺激產(chǎn)生經(jīng)過白質(zhì)傳導的復合動作電位(CAP)以在隔室的另一端進行記錄。由流動的蔗糖所提供的末端的電絕緣性以及所述脊髓片段的末端比中心(處于細胞外電位)更接近于細胞內(nèi)電位的事實提供了CAPs優(yōu)越的分辨率。此外，復合膜電位(缺口電位)的持續(xù)監(jiān)測也可以在每個實驗過程中進行。
為了產(chǎn)生對電刺激的特有反應，通常將所述脊髓在記錄室保持穩(wěn)定約1小時。隨后使用以約1.5米/秒的沖擊器將所述脊髓在其中心(在中央隔室中)進行拉伸。這以標準化方式將所述脊髓拉長。這一拉伸引起經(jīng)過受損處的CAP傳播的暫時喪失，其隨時間得到改善。一旦自發(fā)的恢復產(chǎn)生穩(wěn)定的“恢復CAP”，向中央隔室的液體介質(zhì)添加藥物。CAPs的記錄是連續(xù)的，雖然需要約0.5小時使得藥物誘導的變化幅度得以穩(wěn)定。這一反應以“用藥前”恢復的電位(標準化為100％)的增加(或降低)進行報道。隨后所述藥物從隔室中洗去，并且在獲得“用藥后”電記錄之前所述脊髓受損處暴露在新鮮充入二氧化碳的克雷布斯液中約1小時。
同樣參見雙蔗糖缺口記錄和絕緣室，圖1部分A說明了這一裝置稍微不同的實施方案的特征。尤其是圖1右上方的示意性3維圖畫顯示了其尺度—該室是由清澈的樹脂玻璃制成的。在示意性的3維圖畫下方，圖解了4個隔間并按照所泵入的溶液進行了標記。這些溶液通過吸引技術吸出，這通過使用毛細管泵(沒有顯示)產(chǎn)生了適度的、但連續(xù)的介質(zhì)流。外面的隔室處于或接近細胞內(nèi)電位而中間的隔室(含平衡的生理器官培養(yǎng)溶液)處于細胞外電位。因此，神經(jīng)沖動過程中的膜電位的倒置以與“單一”單位細胞內(nèi)電生理學記錄相似的方式直接測量—引起復合動作電位(CAP)分辨率的提高。
CAP由數(shù)以萬計橫跨豚鼠脊髓的單獨的神經(jīng)纖維(稱為神經(jīng)元)的同步激發(fā)所產(chǎn)生。脊髓受到刺激以在隔間的一側(cè)同步“激發(fā)”CAPs(在所示的例子中，隔間左側(cè))并在右端記錄CAPs的到達。經(jīng)過將橫跨隔室整個寬度的脊髓片段末端電絕緣的所述隔室的蔗糖快速流動界面極大地減少了所述兩種不同溶液的混合。生理溶液(克雷布斯液)在提供泵經(jīng)中間隔室的介質(zhì)的儲器中也是pH穩(wěn)定并氧化的。這提高并確保了所述脊髓在生理測量過程中的生存能力。仔細剝離的約40mm長的脊髓片段可以保持在所述隔室中—在兩天內(nèi)正常發(fā)揮功能(通過神經(jīng)沖動傳導得以體現(xiàn))。B部分表示了單一的誘發(fā)CAP，C部分顯示了許多重復CAPs(由一系列重復刺激引起)。這樣的記錄指示了細胞內(nèi)單個神經(jīng)纖維記錄，并且其分辨率水平比通過細胞外記錄技術的測量CAP的傳統(tǒng)方法提高了約100倍。
D部分顯示了在脊髓中間(即中央生理隔間中)經(jīng)受標準的擠壓損傷后經(jīng)過脊髓的復合神經(jīng)沖動(CAP)傳導。對左側(cè)刺激的神經(jīng)沖動傳輸?shù)竭_損傷部位并被阻斷—無法穿越該隔間從而在右側(cè)得以記錄。
參見圖1的F部分，在藥物干預后CAP開始重新出現(xiàn)在中間隔間(即含克雷布斯液的隔間)中浸泡損傷位置的生理溶液中添加本發(fā)明所述化合物。定量比較神經(jīng)沖動傳導的恢復的最精確的方法是為了將受傷前的值與添加“待測”藥物所產(chǎn)生的值進行比較，用計算機計算CAP的量和持續(xù)時間的導數(shù)(即“曲線下的面積”)。
III.體內(nèi)檢測在使用豚鼠的活體動物檢測過程中，本發(fā)明所述新的吡啶衍生物通過胃導管對先前已經(jīng)在中胸脊髓受到標準的擠壓傷的大的成年豚鼠給藥。這些化合物在這第二種技術中恢復傳導的能力通過SSEP的定量評價進行確定。采用了以下方案和給藥路線。
在脊髓損傷之前，對完全成年的豚鼠(Hardy株，約400g)用肌肉注射克他命/Rompum(Ketamine/Rompum)進行輕度麻醉并在放置如圖2所示的刺激和記錄電極過程中使其保持靜止。隨后在這一正常動物體內(nèi)連續(xù)獲得一系列脛骨神經(jīng)和正中神經(jīng)刺激的SSEP記錄。這里應當注意到，所有的手術過程和生理學記錄在麻醉的動物上進行。所有動物實驗按照學校動物護理和使用委員會所核準的方案進行，嚴格遵守學校、州、聯(lián)邦對于在研究中使用動物的指導方針。
隨后進行了背部椎板切除手術，將脊柱內(nèi)的中胸脊椎的背側(cè)(背后的)區(qū)域打開，將脊髓的堅硬的遮蓋物(硬髓膜)切除，并通過標準化技術制造脊髓擠壓傷(持續(xù)移位壓縮)，參見Blight AR(1991a)，Morphometric analysis of a model of spinal cordinjury in guinea pigs，with behavioral evidence of delayed secondarypathology，J Neurol Sci 103156-171，；Borgens RB，Shi R，Bohnert D(2002)，Behavioral recovery from spinal cord injury following delayed applicationof polyethylene glycol，J Exp Biol 2051-12，兩篇文獻都被并入本文作為參考。
手術后5到10分鐘內(nèi)，獲得了另一組SSEP記錄—這表明在各種情況下SSEP的完全喪失同時也作為陽性對照過程(正中神經(jīng)刺激)。這一“水平線”記錄證明對于脊髓來說所述損傷的嚴重性并通過SSEP的喪失表明了損害了全部的上行功能。
使所有動物恢復、治愈并在受到損傷后2個月內(nèi)不再用于手術實驗。不過，周期性地獲取生理學記錄以監(jiān)測其狀態(tài)—并且損傷后約2個月時的最后記錄用于證實經(jīng)過中胸受損處的上行SSEP傳導的延續(xù)性喪失。
手術8周并獲得“用藥前”電記錄后，輕度麻醉豚鼠并將待測化合物通過胃導管直接胃內(nèi)給藥(化合物在導入到胃部的過程中是不溶解的，然而，胃導管和化合物的任何殘留通過小于1mL蒸餾水的二次導入沖入胃中)。
此后開始SSEP電記錄，并在治療后5到6小時的期間內(nèi)每小時獲得這樣的記錄。
在這些多個時間點上獲得血樣并凍存以備以后通過HPLC檢測技術對化合物的精確血漿水平進行測定。(最后的這一步驟使化合物更深入地向臨床使用發(fā)展成為可能)。
在大部分情況下，藥物通過插入麻醉動物口內(nèi)的胃導管直接向動物胃部給藥。
參見圖2，正常功能的神經(jīng)回路通過刺激前肢正中神經(jīng)的神經(jīng)沖動—進入脊髓、沿脊髓上行至終點的通路以在大腦對側(cè)感官運動皮層中測量的誘發(fā)電位的形式進行了概述。在完好(未受傷害或正常的)動物中腿部脛骨神經(jīng)的刺激會對到達大腦的誘發(fā)電位產(chǎn)生類似的攔阻。這顯示為峰(P)1和2先后到達的誘發(fā)電位(豚鼠左邊真實電記錄的頂部)。大腦和后肢之間脊髓的擠壓阻斷了這些電位沿脊髓的上行。所述損傷通過中斷SSEP阻斷了大腦皮層對腳部疼痛刺激的評估。
圖2左側(cè)所示的實際的軀體感應誘發(fā)電位記錄說明在造成了這樣的擠壓傷之后誘發(fā)電位立即完全消失(擠壓后記錄)。這種傳導阻斷狀態(tài)在動物中持續(xù)了連續(xù)的1個檢測月。底部記錄顯示在這一脊髓受損的動物中進行的正中神經(jīng)對照步驟說明如果沒有被損傷所阻斷，誘發(fā)電位可以在腦部測得。
圖2右邊的插圖中所簡化的神經(jīng)回路顯示正常情況下會產(chǎn)生從足部到脊髓到大腦的上行誘發(fā)電位的對后肢的電刺激(實際上是脛骨神經(jīng)刺激)。這一回路被表現(xiàn)為脊髓中的破裂的脊髓損傷所中斷。在實驗室中可以確認，由位于腦部的電極所記錄的上行SSEP的消失不是由于控制過程所造成的假象。在產(chǎn)生圖2所反映的數(shù)據(jù)的實驗中，刺激前肢(實際上是刺激前肢的正中神經(jīng))產(chǎn)生沿脊髓上行到大腦的SSEP-因為這一神經(jīng)回路沒有被局部的脊髓損傷所中斷(即位于損傷部位“上方”)。
圖2左側(cè)顯示了SSEP的真實的生理學記錄(在用C標記的插圖中)。每個波形是前肢或后肢中相關神經(jīng)的200次重復刺激的平均值。上面顯示了在感官皮層記錄的對后肢脛骨神經(jīng)刺激反應的正常SSEP。應當注意到，顯示了兩個SSEP峰(P1和P2)。P1是先到達的誘發(fā)電位(刺激后約24毫秒錄得)，P2是后到達的(刺激后約60毫秒)。這是因為快速和慢速傳導纖維以及神經(jīng)突觸在其從脊髓向大腦上傳時分成不同反應時間的峰。所述動物中為期1個月的連續(xù)監(jiān)測中沒有恢復的中胸脊髓的擠壓傷消除了SSEP記錄(擠壓后記錄)。底部記錄顯示了證明不能記錄SSEP不是由于除脊髓損傷外的其他變量的對照SSEP(正中神經(jīng)刺激)。
現(xiàn)在轉(zhuǎn)而考察稍有不同的實驗方案，對大的(＞350g)成年雌性豚鼠進行麻醉(戊巴比妥鈉，見下文)并在完好的動物中進行正常計劃的軀體感官誘發(fā)電位(SSEP)測試。這包括記錄來自感官運動皮層對最初的(通常)對側(cè)前肢正中神經(jīng)和對側(cè)后肢正中神經(jīng)的刺激反應的誘發(fā)電位。獲得這些基線記錄以后，對動物進行深度麻醉，通過手術暴露脊髓并通過標準化技術壓破(見下文“手術”)。一小時以內(nèi)，獲得第2組電記錄，說明通過新鮮受損處誘發(fā)電位傳導的傳導的喪失。重要的是首先確定擠壓傷位置以上的神經(jīng)回路是完整及正常的。
SSEP可以在該動物中正中神經(jīng)刺激后進行記錄，這構(gòu)成了對SSEP記錄過程的內(nèi)參照(見圖7)。
參見圖7，記錄A是未編輯的對脛骨神經(jīng)刺激應答的沿脊髓上行先到達的誘發(fā)電位(峰1；P1)。底部的3條跡線是200次刺激的單獨隊列。上面的單一跡線連同記錄B-D是平均的波形。這一記錄在脊髓擠壓之前從麻醉的豚鼠中獲得。在B中，脊髓擠壓1小時后獲得的波形顯示相同動物中前肢正中神經(jīng)的對照刺激。注意先到達的誘發(fā)電位的巨大振幅。在C中，顯示了相同動物在相同時間點后肢脛骨神經(jīng)刺激后通過脊髓損傷處的SSEP電導的完全喪失。該動物中這一通過受損脊髓白質(zhì)傳導復合動作電位上行沖動排的能力的完全喪失在1周后仍然明顯(D)。本說明書中所使用的所有動物都具有這樣的特征記錄。
類似于圖2，圖7中豚鼠的圖解顯示被正中神經(jīng)的刺激所激活的對照回路。被后肢脛骨神經(jīng)的刺激所激活的神經(jīng)回路能被脊髓損傷所阻斷。
在獲得這些記錄以后，動物從麻醉狀態(tài)恢復并保持1周。記錄了另一組誘發(fā)電位以確定殘留傳導缺陷的范圍是受傷后約1周。獲得這些記錄之后，通過強飼將用作標準品的4-AP或一種衍生物對動物給藥。隨后在30分鐘、1小時、然后每小時直至4小時對藥物對傳導的作用進行監(jiān)測。在記錄時期結(jié)束后，使所述動物恢復并隨后送回其籠舍。在下一日(約18小時后)獲得最后一組記錄，隨后對這些動物實施安樂死。
手術作為一種減少損傷的動作和解剖學結(jié)果可變性的方法，相比恒定沖擊優(yōu)選常規(guī)的恒定移位損傷。這一常規(guī)方法在Borgens，R.B.；Shi，R.；Bohner，T.D.Behavioral Recovery from Spinal Cord Injury Following Delayed Applicationof Polyethylene Glycol.Journal of Experimental Biology 2002，205，1-12；Blight，A.R.Morphometric analysis of a model of spinal cord injury in guineapigs，with behavioral evidence of delayed secondary pathology.Neurolog.Sci.1991，103，156-171中有所描述。這兩篇文獻都被并入本文作為參考。
簡述通過肌肉注射100mg/kg鹽酸可他命和20mg/kg甲苯噻嗪對成年豚鼠(＞約350g；Hartley株)實行麻醉。背部椎板切除過程使位于約第12節(jié)胸椎水平(T12)到第1節(jié)腰椎水平(L1)的脊髓暴露出來。暴露的脊髓使用特別改進的具有平頭的鉗子壓破。為固定動物以進行電記錄。通過肌肉注射(0.1cc的戊巴比妥鈉，50mg/ml)進行更溫和的麻醉。在研究結(jié)束時，當所述動物處于麻醉狀態(tài)時，通過顯著提高麻醉劑劑量對豚鼠實施安樂死，之后進行灌注/固定(含戊二醛的磷酸鹽緩沖林格溶液)。
SSEP經(jīng)過脊髓受損處白質(zhì)的神經(jīng)沖動傳導的喪失是與SCI中所觀察到的災難性的動作缺陷相關的。這些脊髓中上行和下行的復合神經(jīng)沖動沖動排與大量的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸有關，并且當被上肢或下肢的復合神經(jīng)的電激活(在SSEP中)或皮層激活(在運動誘發(fā)電位記錄或MEPs過程中，這里沒有進行)所刺激時被稱之為“誘發(fā)電位”(EP)。這種形式的大部分上行沖動的刺激—隨后在大腦的對側(cè)感官運動皮層中對其進行記錄被稱為軀體感官誘發(fā)電位測試(SSEP)。
使用一對插入膝蓋膝后彎槽處的神經(jīng)附近的針式電極實現(xiàn)了后肢脛骨神經(jīng)的刺激。類似的SSEP通過用一對刺激電極對前肢正中神經(jīng)的刺激進行誘發(fā)。記錄電極位于覆蓋對側(cè)皮層區(qū)的頭皮上，還有一個通常位于耳廓上的無關緊要的電極。
對于一個研究期間的完整的電記錄包括一系列200次對神經(jīng)的刺激(2mA方形波，以3Hz持續(xù)時間200微秒，見圖7的A部分)。隨后將3到4組這些記錄進行平均以產(chǎn)生單一波形用于如圖7的A和B部分所示的定量研究。記錄和刺激使用了NihonKohden Neuropak 4和Power Mac G-3計算機。
定量評價包括從刺激開始(注意刺激物的人為假象)到誘發(fā)電位產(chǎn)生的反應時間的測量，然而最可信并有信息量的比較數(shù)據(jù)包括使用IPLabTM光譜軟件(Scanalytics，F(xiàn)arifax，VA)以像素為單位對EP下面積的測定。通過將受損后(或治療后)EP除以在正常動物中所記錄的最初EP的面積對這些峰波形下的面積(位于基線上的)進行標準化。如果所有(100％)損傷前正常情況下被刺激過程同步激發(fā)的神經(jīng)纖維在治療后理論上恢復傳導能力，這樣平均SSEPs應當達到1.0。
給藥使用以下方法通過強飼法進行給藥。通過使用圓的有尖端的喂養(yǎng)針(或是18規(guī)格55mm長或16規(guī)格75mm長；Fine Science Tools)將所有檢測的藥物加入溶液(見下文)導入豚鼠胃部。僅對麻醉的動物實施強飼。在豚鼠中，柔軟的上腭與舌頭底部相連，僅有一個小口供導管通過。喂養(yǎng)針在門牙和臼齒起點之間前進，這引起吞咽或嘔吐反射，有助于喂養(yǎng)針進入胃部。在這一操作之前，通過將其末端接近動物的最后一根肋骨并標記鼻尖附近針的近側(cè)部分對合適的針(按相對于豚鼠的尺寸大小排列)進行標記。這為強飼過程中進到胃部的所需長度提供了估計。喂養(yǎng)針可以與能將材料導入胃部或從中取出的注射器或吸出器相連。
劑量及重量數(shù)據(jù)對于豚鼠的起始劑量是通過在狗的截癱臨床病例中所給予的4-AP的區(qū)間內(nèi)(每千克體重0.5-1.0mg)使用進行估計的。在約500g的豚鼠的情況下，這會導致約0.25g的總劑量。制備了用于強飼的存儲液，其中0.2cc水溶液中包含了0.2mg 4-AP。這使得給予動物的總濃度相對標準化，并受到其重量沒有顯著差異的促進(用4-AP檢測的10只動物的平均重量是421.5±20.9g；用氨基甲酸甲酯檢測的動物的平均體重是411.6±23g；P≥0.5)。等于0.47±0.04mg/kg的4-AP有效劑量足以產(chǎn)生電生理學記錄的提高。通過比較，氨基甲酸酯3的有效劑量似乎稍低一些(0.37±0.2mg/kg)，但是考慮到小樣本數(shù)這一差異不具有統(tǒng)計學上的差異(P＞0.05)。
IV.結(jié)果經(jīng)過豚鼠脊髓的神經(jīng)傳導的體外檢測下面所展示的(甲氨基)吡啶氨基化合物和脲以與4-AP相同的有效濃度都不能對CAP振幅的恢復產(chǎn)生任何改進。
三種化合物，N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯(3)、N-(4-吡啶基)氨基甲酸乙酯(2)和N-(4-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯(1)都表現(xiàn)出不同的恢復通過受損脊髓的神經(jīng)傳導的能力。對這三種氨基甲酸酯的最初試驗確定，等于或低于4-AP濃度(100μM)的工作濃度能夠在雙蔗糖缺口記錄室中引起可重復的神經(jīng)傳導的恢復。發(fā)現(xiàn)氨基甲酸甲酯(3)和氨基甲酸乙酯(2)與4-AP的作用方式相似，以大約100μM的濃度在沒有毒效的條件下引起CAP傳導的恢復。在這些體外試驗中毒效定義為CAP的顯著降低。另一方面，發(fā)現(xiàn)當添加到浸泡溶液中時，100μM的氨基甲酸叔丁酯(1)對白質(zhì)具有毒性。然而發(fā)現(xiàn)比用4-AP低得多的氨基甲酸酯(1)的有效濃度(1μM)在沒有毒效的情況下可重復地改善通過受損處的CAP傳導。對于氨基甲酸甲酯(3)而言，100μM的有效濃度引起平均30.6±11.7％(n＝4)的恢復的CAP中的振幅的提高。對于氨基甲酸乙酯(2)，相同濃度下的提高為18.6±8.7％(n＝8)。這一振幅的提高是有統(tǒng)計學意義的(P＜0.04)。洗滌1小時后，提高的CAP的振幅下降到用藥前水平。1μM氨基甲酸叔丁酯(1)將恢復的CAP振幅提高了15.4±3.4％(n＝5)。這一提高相對于用藥前CAPs非常明顯(P≤0.002)。圖8提供了這三種藥物中每一種改善CAP電記錄的例子并用圖形展示了這些數(shù)據(jù)。具體來說，A欄中的第一個電記錄顯示了添加氨基甲酸乙酯(2)之前恢復的復合動作電位(CAP)(最初的小波形是刺激物的假象)。第2個記錄在添加氨基甲酸酯(2)之后約半個小時獲得。注意CAP振幅約20％的提高。第3個記錄顯示了在去除藥物并洗滌約30分鐘后，這一提高的CAP的振幅回落至用藥前水平。B欄顯示了加入氨基甲酸甲酯(3)后獲得的類似的一組電記錄。此外，在藥物存在條件下振幅的提高是明顯的。這一提高只在給藥過程中得以保持并在洗去藥物后測量到近似用藥前的水平。C欄描述了使用氨基甲酸叔丁酯(1)的類似于A和B的一組記錄。D欄提供了所有數(shù)據(jù)的柱狀圖。100μM的氨基甲酸酯(3)和(2)具有統(tǒng)計學意義地提高了CAP振幅(P＜0.04；一個星號)，而1μM的氨基甲酸酯(1)與用藥前振幅相比具有統(tǒng)計學意義地提高了CAP(P＜0.002；2個星號)。
豚鼠中的體內(nèi)檢測手術后，在能夠完成電記錄之前所有動物中的SSEP已經(jīng)消除(＜1小時)。除了兩只動物以外，所有動物中這些“水平線”記錄也是1周記錄的特征，這說明手術1周后在任何一只豚鼠中基本沒有神經(jīng)傳導自行恢復的跡象。在兩個例外中，注意到了小而很早到達的誘發(fā)電位(EP；約25毫秒反應時間)，然而，這一峰的幅度僅略高于基線且不是可信的誘發(fā)電位。因此，對這些動物進行了強飼和進一步記錄并將其數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)合并。4-AP和氨基甲酸酯(3)和(2)的強飼一切正常；然而，我們無法使用氨基甲酸叔丁酯(1)進行這一程序。晶體氨基甲酸酯(1)不能耐受并且生產(chǎn)用于口服的已知濃度的溶液的最初的嘗試遇到了問題。因此，這里出于比較的目的以下僅提供了初步的體外數(shù)據(jù)。
正如通過先到達的EP的恢復(高于基線)所觀察到的，4-AP在攝入后30分鐘到1小時以內(nèi)引起強烈的可靠的EP的增強。10只動物中的兩只在強飼后4小時內(nèi)對4-AP沒有反應。在使用氨基甲酸酯(1)和(2)的情況下，不存在沒有反應的情況。
注意到雖然樣本數(shù)較小，還是說明了氨基甲酸甲酯(1)引起的EP恢復的明顯增強(見圖3)。圖3顯示了在口服N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯(1)后脊髓神經(jīng)傳導的恢復。圖3中未編輯的正常SSEP電記錄表示在A部分中。后肢脛骨神經(jīng)電刺激后，通過位于麻醉的豚鼠的感官皮層上的電極記錄波形。A部分中底部的3個記錄是神經(jīng)的200次重復刺激的單獨跡線。虛線(SA)標記了刺激物人工假象。顯示了在未受損傷的豚鼠(A)中刺激后約30毫秒后先到達的皮層電位(P1)。
B部分中，顯示了在提供了A部分中記錄的相同動物中對口服待測化合物的反應。B部分上面的記錄是在如這里所述的中胸脊髓壓迫性損傷后1小時實行的。注意后肢脛骨神經(jīng)刺激后皮層電位的完全消失。1周后(B部分中第2條跡線)無法通過脊髓損傷處傳導神經(jīng)沖動的情況基本沒有改變。底部的記錄是在N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯(1)的胃導管給藥后1小時進行的。注意接近正常皮層電位(P1)的快速恢復。
雖然樣本數(shù)較小，還是說明了氨基甲酸甲酯(1)引起的EP恢復的明顯增強(見圖3)。因此，提供了這些組之間的一些統(tǒng)計學比較。所有數(shù)據(jù)通過將恢復的EP下的面積(用像素表示)除以受損前的這一數(shù)據(jù)進行標準化。
數(shù)據(jù)顯示，損傷1周后，氨基甲酸酯(1)比4-AP顯著增強了EP的恢復。雙因素方差分析和直接學生氏t檢驗都證實了顯著提高(方差分析＝0.02；雙側(cè)學生氏T＝0.47)?？紤]到后一個檢測相對于小的樣本數(shù)更謹慎，下面的表1中只提供了這一比較。注意氨基甲酸甲酯(1)與結(jié)構(gòu)上類似的氨基甲酸乙酯(2)相比對EP的增強(表1)。后者與4-AP數(shù)據(jù)相比不滿足顯著性。
表1

檢測了4-AP的三個氨基甲酸酯衍生物(1、2和3)。所有3個化合物引起了高于用藥前水平的CAP的提高，并在所研究的濃度下沒有任何毒性的跡象。與4-AP相同的濃度(100μM)的氨基甲酸甲酯(3)和乙酯(2)是有效的，雖然它們比4-AP引起稍低的CAP恢復。氨基甲酸叔丁酯(1)的結(jié)果也是引人注意的。使用4-AP的最佳濃度，這一化合物被證實對于脊髓是非常有毒的。然而，1μM(4-AP最佳濃度的1％)的氨基甲酸叔丁酯(1)顯示了與氨基甲酸酯(3)和(2)所觀察到的恢復程度相當?shù)腃AP恢復的提高。
因此，所述公開清楚地說明，三種化合物，氨基甲酸甲酯(3)、氨基甲酸乙酯(2)和氨基甲酸叔丁酯(1)都能增強機械性損傷的脊髓片段中的動作電位傳導。100μM的氨基甲酸酯(3)和(2)顯著增強了CAP傳導，而1μM的氨基甲酸叔丁酯能顯著增強CAP傳導。
精通本領域的人員應當理解，前述的說明和實施例僅是對本發(fā)明的舉例說明，并且不應解釋為對本發(fā)明范圍的限制。在不背離以下權利要求所限定的本發(fā)明的精神和范圍的前體下可以對這里所詳細展示的方案進行變更。
權利要求
1.一種具有式(I)的化合物 或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物，其中R1是H或C1-C4烷基；R2是 基團、 基團或OR基團；R3是H、C1-C20烷基、OR基團、亞烷基酯基團 胺基團-NR11R12或-(CH2)m＝基團，其中m是1-3并與R6形成環(huán)，R是C1-C20烷基、芳基或亞烷基芳基，R10是C1-C10烷基，n是1到20，R11選自H、C1-C4烷基、芳基、亞烷基芳基或上所述亞烷基酯基團，并且R12選自H、C1-C4烷基、芳基、亞烷基芳基或上所述亞烷基酯基團或是-(CH2)z-基團，其中z是0到2，從而R12與R6形成環(huán)，且其中當R11和R12之一不是H時，R11或R12中的另一個是H；R6是H、C1-C4烷基、F、Cl、Br、I、NO2或NR13R14基團，其中R13是H或C1-C3烷基，并且R14是-(CH2)m-基團，其中m是0到3并在R3不存在的情況下與 基團形成環(huán)；并且R7、R8和R9各自獨立選自H、C1-C4烷基、F、Cl、Br、I或NO2，優(yōu)選地，R7、R8和R9中至少兩個，更優(yōu)選地其中三個基團是H。
2.如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物，其特征在于，所述化合物選自N-(4-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸乙酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸異丙酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸十二烷酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸芐酯；N-(4-吡啶基)苯甲酰胺；N-(4-吡啶基)乙酰胺；N-(4-吡啶基)丙酰胺；N-(4-吡啶基)三甲基乙酰胺；N-(4-吡啶基)琥珀酰胺酸乙酯；N，N’-(4-吡啶基)脲；N，N’-(3，4-吡啶基)脲；P，P-二苯基N-(4-吡啶基)膦酰胺；和4-吡啶基氨基磷酸聯(lián)苯酯。
3.一種用于治療受損的哺乳動物神經(jīng)組織的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載體以及在這樣的治療中有效量的如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物。
4.如權利要求3所述的藥物組合物，其特征在于，如權利要求1所述的化合物選自N-(4-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸乙酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸異丙酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸十二烷酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸芐酯；N-(4-吡啶基)苯甲酰胺；N-(4-吡啶基)乙酰胺；N-(4-吡啶基)丙酰胺；N-(4-吡啶基)三甲基乙酰胺；N-(4-吡啶基)琥珀酰胺酸乙酯；N，N’-(4-吡啶基)脲；N，N’-(3，4-吡啶基)脲；P，P-二苯基N-(4-吡啶基)膦酰胺；和4-吡啶基氨基磷酸，聯(lián)苯酯；及其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物。
5.一種對遭受受損的哺乳動物神經(jīng)組織困擾的哺乳動物進行治療的方法，其特征在于，所述方法包括向有此需要的哺乳動物給予有效量的如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述哺乳動物神經(jīng)組織損傷是由外傷、疾病、外傷引起的壓迫、腫瘤、出血、感染過程、脊椎狹窄或供血不足所引起的。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于，施用如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物使得通過哺乳動物神經(jīng)組織損傷處的動作電位或神經(jīng)沖動傳導得以恢復。
8.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述受損的哺乳動物神經(jīng)組織是CNS或PNS組織。
9.如權利要求8所述的方法，其特征在于，所述受損的哺乳動物神經(jīng)組織是脊髓組織并且所述哺乳動物是人。
10.如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括給予哺乳動物有效量的如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物，其選自N-(4-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸乙酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸異丙酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸十二烷酯；N-(4-吡啶基)氨基甲酸芐酯；N-(4-吡啶基)苯甲酰胺；N-(4-吡啶基)乙酰胺；N-(4-吡啶基)丙酰胺；N-(4-吡啶基)三甲基乙酰胺；N-(4-吡啶基)琥珀酰胺酸乙酯；N，N’-(4-吡啶基)脲；N，N’-(3，4-吡啶基)脲；P，P-二苯基N-(4-吡啶基)膦酰胺；和4-吡啶基氨基磷酸，聯(lián)苯酯。
11.如權利要求5所述的方法，其特征在于，如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物作為神經(jīng)營養(yǎng)因子發(fā)揮功能。
12.如權利要求5所述的方法，其特征在于，如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物與另一種藥物活性劑共同給藥。
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述其他藥物活性劑是神經(jīng)營養(yǎng)因子。
14.如權利要求5所述的方法，其特征在于，如權利要求1所述的化合物或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或多晶型物選自N-(4-吡啶基)氨基甲酸叔丁酯、N-(4-吡啶基)氨基甲酸乙酯、N-(4-吡啶基)氨基甲酸甲酯、以及N-(4-吡啶基)氨基甲酸異丙酯。
全文摘要
本發(fā)明提供了新的吡啶、含這樣的吡啶的藥物組合物、以及這種組合物在治療包括但不限于受損脊髓在內(nèi)的受損的哺乳動物神經(jīng)組織中的應用。在一個實施方案中，本發(fā)明的化合物、組合物和方法通過恢復經(jīng)過神經(jīng)組織受損處的動作電位或神經(jīng)沖動傳導治療哺乳動物神經(jīng)組織損傷。值得注意的是，在SSEP檢測的基礎上，本發(fā)明化合物的體內(nèi)應用證實，所述化合物以比用已知試劑4－氨基吡啶(4 AP)對比治療更低的濃度提供了更長的持續(xù)作用。
文檔編號C07D213/74GK1745064SQ200380109400
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月5日 優(yōu)先權日2002年12月6日
發(fā)明者R·B·博根斯, R·史, S·R·伯恩, D·T·史密斯 申請人:泊達研究基金會