微生物分析的設備和方法
【專利說明】微生物分析的設備和方法
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 該申請要求于2013年4月30日提交、申請序列號是No. 13/874213的美國專利申 請"Apparatusandmethodsformicrobiologicalanalysis" 的優(yōu)先權。該申請還要求 于 2012 年 5 月 1 日提交的,發(fā)明人是JamesL.Stephenson、Jr.,OksanaGvozdyak、Roger Grist、ClayCampbell和IanD.Jardine,申請序列號是No. 61/687785的美國臨時專利申 請"Apparatusandmethodsformicrobialanalysisanddirectedempirictherapy" 的優(yōu)先權,通過引用將其全文結合至本公開。
【背景技術】
[0003] 近年來,質譜分析與傳統的鑒定微生物的方法相比,由于其準確性提高,獲得結果 的時間縮短,成為流行的鑒定微生物的手段。到目前為止,微生物鑒定中最常用的質譜分析 方法是基質輔助的激光解吸附離子化時間飛行(MALDI-T0F)質譜分析。在MALDI-T0F中, 未知微生物細胞與合適的紫外光吸收基質溶液混合,并在樣品板上干燥?;蛘撸梦⑸锛?胞的提取物取代完整細胞。轉移至質譜儀的離子源之后,激光束照射至樣品進行蛋白質的 解吸附和離子化,并收集隨時間變化的質譜數據。
[0004] MALDI-T0F法產生的微生物的質譜顯示了來自完整肽、蛋白質和蛋白質片段的大 量尖峰,其構成了該微生物的"指紋"。該方法依賴于未知微生物的質譜尖峰圖與參考數 據庫的匹配,所述參考數據庫包括采用基本相同的實驗條件所獲得的已知微生物的圖譜集 合。分離的微生物和參考數據庫中的某個圖譜的匹配越好,則將該微生物鑒定是屬、種、(或 在某些情況下)亞種級的可信度就越高。由于該方法依賴于MALDI-T0F質譜中尖峰圖的匹 配,其不需要鑒定或者另外表征在該未知微生物圖譜中表示的蛋白質以鑒定該微生物。
[0005] 盡管MALDI-T0F法快速、成本高效,其仍然具有缺陷從而限制了其應用范圍。基 質輔助激光解吸附離子化(MLDI)質譜中的信息內容反映了含量最高的、可離子化的蛋 白質,除了病毒,在所采用的實驗條件下,所述蛋白質通常局限于核糖體蛋白質。由于核糖 體蛋白質在原核生物中是高度保守的(conserved),因此,MALDI-T0F對緊密相關的微生 物的區(qū)分是有限的。而且,株型鑒定(strainidentification)和/或血清型鑒定、抗生 素耐受性、抗生素敏感性、毒力(virulence)或其它重要特征的確定取決于蛋白質標記物 而不是核糖體蛋白質的檢測,其進一步限制了MALDI-T0F在微生物分析中的應用。采用 MALDI-T0LF鑒定微生物的實驗室必須采用其它方法以進一步表征被鑒定的微生物。另外, MLDI-TOF法對質譜形狀匹配的依賴要求純的培養(yǎng)物,以獲得高質量結果,其通常不適用于 直接測試含有不同微生物的樣品。
[0006] 已經采用了若干其它的質譜分析法以檢測微生物。例如,已經描述了基于質譜的 蛋白質測序方法,其中液相色譜與串聯質譜聯用(LC-MS/MS),從源自微生物樣品的蛋白質 的酶分解物獲得序列信息。該方法,稱為"由下至上(bottom-up)"的蛋白質組學是被廣泛 應用的蛋白質鑒定方法。該方法可以提供亞種或株型級的鑒定,這是因為,色譜分離允許對 核糖體蛋白質之外的其它蛋白質進行檢測,包括有利于對抗生素耐受性標記物和毒力因子 進行表征的蛋白質。所述由下至上的方法的主要缺陷是獲得結果的時間延長,這是因為,需 要對蛋白質進行分解、長時間的色譜分離和數據處理。因此,該方法不適用于高產出量處 理。
【發(fā)明內容】
[0007] 本發(fā)明包括一種用于在從培養(yǎng)物分離之后或者直接從樣品對微生物進行鑒定的 新方法和系統,其中所述方法和系統是基于通過高分辨率/質量準確性的單級(MS)或多級 (MSn)質譜來對微生物的蛋白質進行表征。本公開采用基本適用于幾乎所有微生物的方法 和高分辨率/質量準確的單級(MS)或多級(MSn)質譜,還討論了對毒力因子、抗生素耐受 性標記物、抗生素敏感性標記物或其它特征的目標檢測和評估。盡管以下討論集中于通過 蛋白質表征來鑒定微生物,但是本公開所述的方法和系統同等適用于通過對一種或多種小 分子、脂類或碳水化合物等的表征來鑒定微生物。
[0008] 一方面,本發(fā)明提供了一種傳統由下至上蛋白質組學方法的替代方法,即通 過基本適用于幾乎所有微生物的方法對源自微生物細胞的完整蛋白質進行由上至下 (top-down)的分析,所述微生物包括革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、分枝桿菌、支原體、 酵母菌、病毒和絲狀(即顯微鏡可見的)真菌。本發(fā)明提供了對含有微生物混合物的樣品 中的微生物在屬、種、亞種、致病株型、甚至是血清型級的鑒定,和/或對直接來自純的和/ 或混合培養(yǎng)物以及直接樣品(例如表面拭子、體液等)的微生物進行鑒定。另外,可以采用 該方法對毒力因子、抗生素耐受性和敏感性標記物或其它特征進行目標檢測。本發(fā)明的方 法簡單且快速,這是因為,不需要對樣品進行化學或酶分解,而且實時進行數據處理。
[0009] 示例性方法包括兩階段工藝。在第一階段,樣品中微生物的可溶蛋白質被快速提 取,并經質譜儀分析,以便基于對一種或多種被提取的可溶蛋白質的分子量和片段分析來 鑒定微生物。第一階段在幾分鐘之內完成,例如少于10分鐘,少于5分鐘或大約1分鐘之 內或更少。第二階段采用快速色譜(rapid,time-compressedchromatography)分離和質 譜分析(例如目標MS和MSn)以進一步表征在第一步中鑒定的微生物,例如通過確定毒力 因子、抗生素耐受性標記物、抗生素敏感性標記物或其它特征來表征。第二階段在幾分鐘之 內完成,例如少于15分鐘,少于10分鐘,或大約5分鐘之內或更少。兩個階段均依靠對源 自微生物的完整蛋白質的檢測和鑒定,不需要將蛋白質進行化學、物理或酶降解至它們的 取代肽。
[0010] 對樣品中一種或多種微生物進行鑒定和表征的另一示例性方法包括以下步驟: (a)采用質譜分析進行第一分析方法,以對一種或多種微生物中的每一個檢測和鑒定一種 或多種(例如,一、二、三、四、五種或更多)蛋白質;(b)利用上述來自一種或多種微生物中 的每一個的一種或多種蛋白質的身份,進一步確定樣品中的至少一種微生物;(c)利用來 自步驟(b)的信息從預定義的分析方法列表中自動選擇第二分析方法,第二分析方法也采 用質譜分析;以及(d)對樣品執(zhí)行第二分析方法,以確定樣品中是否存在指示抗生素耐受 性標記物、抗生素敏感性標記物和/或毒力因子的蛋白質,以及任選地,對樣品中存在的抗 生素耐受性標記物、抗生素敏感性標記物和/或毒力因子進行定量。
[0011] 目標微生物包括但不限于:革蘭氏陽性細菌、革蘭氏陰性細菌、分枝桿菌、支原體、 酵母菌、病毒和絲狀真菌。表征過程可以包括檢測感興趣的微生物所產生的毒力因子、耐受 性標記物、抗生素敏感性和任何其它分子,包括但不限于影響臨床結果的那些分子。該方法 適用于大量的不同類型樣品,包括源自臨床樣品的純的或混合培養(yǎng)物的樣品,包括但不限 于:血、尿、糞便、痰、傷口和體表拭子,還適用于其它來源的樣品,包括工業(yè)或環(huán)境樣品,例 如食品、飲料、土壤、水、空氣和表面拭子。
[0012] 本發(fā)明的方法包括下述步驟中的至少一個或多個:微生物細胞破碎、蛋白質溶解、 樣品清洗(脫鹽、去除不可溶組分和碎片、和/或濃縮)、注入樣品或流動注射、快速部分液 相色譜分離、溶液中蛋白質的離子化、MS和MS/MS模式的高分辨率/質量準確性的多級質 譜分析、經分子量分析和/或蛋白質測序分析的微生物鑒定。
[0013] 本發(fā)明的方法和樣品制備試劑盒提供了執(zhí)行該方法的裝置。如一個實施例中所考 慮的,快速提取程序之后跟著進行在線(on-line)清洗和直接分析。在另一實施例中,快速 提取之后對完整蛋白質進行快速部分液相色譜分離。之后,蛋白質被離子化,例如被電噴霧 離子化。完整蛋白質進行MS和MSn分析,從而根據需要將微生物鑒定至屬、種、株型、亞種、 致病型或血清型級。MS或MSn法可以采用直接測序或圖形匹配法進行病原鑒定。在采集過 程中實時執(zhí)行該鑒定過程。其也可以在采集之后進行。該系統進一步提供了對毒力因子、 耐受性標記物、抗生素敏感性標記物和/或例如與疾病相關的任何其它相關標記物的定量 檢測和鑒定。
[0014] 由于采用有限的一組試劑來執(zhí)行通用方法,本發(fā)明的方法適于在進行樣品制備和 質譜分析的全自動系統內使用。
[0015] 理想地,從樣品制備至結果報告自動執(zhí)行本發(fā)明的方法。結果可以自動傳至醫(yī)院 電子醫(yī)療記錄系統,結果可以在此直接與患者治療方案、保險、帳單聯系起來,或用于流行 病學報告。該綜合系統有利于對醫(yī)院、局部、區(qū)域和全球范圍內的疾病爆發(fā)進行流行病學追 蹤。對于高產出量的實驗室,多個系統可以與中央計算機連接,所述中央計算機在報告之前 對來自不同儀器的數據進行整合。該系統能夠引入表型易感性數據,該數據可以與本發(fā)明 生成的鑒定、毒力、抗生素耐受性和分型信息結合起來。
[0016] 通過以下說明書和所附的權利要求,本發(fā)明的這些和其它目標和特征將變得完全 顯而易見,或者可以通過下文所述的本發(fā)明的實施被了解。
【附圖說明】
[0017] 為了進一步闡明本公開內容的上述和其它優(yōu)勢和特征,通過參考特定實施例,對 本公開內容進行尤其詳細的描述,用附圖對所述實施例進行說明。應當認識的是,這些附圖 僅僅用于舉例說明本公開內容的實施例,因此不能被認為是對其范圍的限制。通過采用以 下附圖對本公開內容進行特別和詳細地描述和解釋,其中:
[0018] 圖IA是用于描述鑒定微生物的方法的流程圖;
[0019] 圖IB是示意性描述了鑒定微生物的算法的流程圖;
[0020] 圖2是示意性描述了對來自至少一種微生物的可溶蛋白質進行快速提取和分析 的系統從而鑒定所述至少一種微生物的框圖;
[0021] 圖3是示意性描述了根據圖2所示系統的一個實施例所能采用的一個流路圖;
[0022] 圖4描述了經直接注入而得到的大腸桿菌提取物的全掃描電噴霧質譜;
[0023] 圖5描述了圖4所示的大腸桿菌提取物在50道爾頓(Da)窗口的質量分離;
[0024] 圖6描述了圖5所示的50道爾頓的窗口的串聯質譜;
[0025] 圖7描述了大腸桿菌的脫氧核糖核酸(DNA)結合蛋白質H-sn的+19的電荷狀態(tài) 的MS/MS碎片;
[0026] 圖8A-8F描述了對從地衣芽孢桿菌(BacillusIicheniformis)、白念珠菌 (Candidaalbicans)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、玫瑰色庫克菌(Kocuriarosea)、木 糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)和包皮垢分支桿菌(Mycobacteriumsmegmatis) 提取出的可溶蛋白質進行快速部分色譜分離的質譜數據;
[0027] 圖9A顯示的MS數據描述了在標準生長條件和在苯唑西林存在下生長18小時的 耐抗生素大腸桿菌(ATCC35218)之間的比較;
[0028] 圖9B顯示的MS數據描述了圖9A的在標準生長條件和在乙氧萘青霉素存在下生 長18小時的耐抗生素大腸桿菌之間的比較;
[0029] 圖9C顯示的MS數據描述了圖9A的在標準生長條件和在青霉素存在下生長18小 時的耐抗生素大腸桿菌之間的比較;
[0030] 圖9C顯示的MS數據描述了圖9A的在標準生長條件和在阿莫西林存在下生長18 小時的耐抗生素大腸桿菌之間的比較;
[0031] 圖10描述了來自白假絲酵母菌的四種不同蛋白質的高分辨率/質量準確性的經 提取的離子圖譜;
[0032] 圖11A-11C描述了 34攝氏度下、在Oxoid原裝胰酶大豆瓊脂上生長20小時的各 種微生物的快速部分分離質譜(FPCS-MS)總離子電流圖譜。(A) -大腸桿菌ATCC8739; (B) -鵪鶉腸球菌ATCC700425; (C) -枯草芽孢桿菌斯皮茲仁亞種ATCC6633;以及
[0033] 圖12描述了源自于由圖IlA所示、在34攝氏度下、在Oxoid原裝胰酶大豆瓊脂上 生長20小時的大腸桿菌ATCC8739的FPCS-MS所得信息的蛋白質去卷積質量。
【具體實施方式】
[0034] 在一個實施例中,本