用于識別前列腺癌和前列腺肥大的方法及試劑盒的制作方法
【專利說明】用于識別前列腺癌和前列腺肥大的方法及試劑盒 【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及,用于識別前列腺癌和前列腺肥大的方法及試劑盒。 【【背景技術】】
[0002] 公知前列腺癌(prostatecarcinoma:以下簡稱為"Pea")是男性的主要的死亡原 因,前列腺特異抗原(prostate-specificantigen:以下簡稱為"PSA")被認為對Pca的最 重要的腫瘤標志物(非專利文獻1)。PSA是約34kDa的糖蛋白,糖鏈占其約8%。已經(jīng)在多 種文獻中記載了對Pca的早期診斷的血清PSA測試的有用性,但在罹患Pca的男性和罹患 前列腺肥大(benignprostatehyperplasia:以下簡稱為"BPH")的男性之間有被稱為灰 色區(qū)(grayzone)的既說不上是Pca也說不上是BPH的區(qū)域(非專利文獻2)。從而至今實 施用于正確地區(qū)別2種病變的嘗試,例如,將PSA密度、PSA梯度、游離PSA/總PSA的比等作 為指標的嘗試。但是,這樣的方法難以正確地區(qū)別2種病變。因此,現(xiàn)在的血清PSA測試對 Pca不是特異性的、且無使靈敏度和特異性一同滿足的適宜的截止值成為世界性的問題。
[0003] 基于這樣的背景、作為本發(fā)明人的大山等的組將從精囊液純化的PSA用N-糖苷酶 F處理,切出PSA的N型糖鏈,由基質(zhì)關聯(lián)激光解吸/電離飛行時間(MALDIT0F)質(zhì)譜(MS)進 行解析,作為PSA的糖鏈鑒定19種,得知PSA的糖鏈非常地富多樣性(非專利文獻3)。其 以前,Stamey等的組報告,作為PSA的糖鏈,僅表達以雙鏈在末端,唾液酸以a(2, 6)鍵與半 乳糖結合的N型糖鏈(非專利文獻4)、由大山等的組明了,末端的唾液酸不僅通過a(2, 6) 鍵、還存在約10%通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的。其后,大山等的組在不僅含糖鏈、還含 PSA的肽序列的狀態(tài)下由MS-MS解析PSA而得知,PSA的N型糖鏈的末端唾液酸殘基,伴隨 癌化,相比通過a(2, 6)鍵,通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合增加(非專利文獻5)。
[0004] 鑒于以上的見解,認為以有末端唾液酸殘基通過a(2,3)鍵與半乳糖結合的N型 糖鏈的PSA量作為指標識別Pca和BPH是可能的,實際上,由作為本發(fā)明人的大山在專利文 獻1中提議的使用特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的朝 鮮槐凝集素的親和性層析,確認可識別Pca和BPH。但是,由使用朝鮮槐凝集素的親和性層 析識別Pca和BPH的方法作為與至今提議的方法完全不同的方法被關注,由于有末端唾液 酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的PSA量是總PSA量的僅1~2 %,是極微 量,為了進行精度高的識別,有作為分析樣品大量(10ml左右)需要血清的問題。另外,使 用的朝鮮槐凝集素由于是自天然物的提取物,也有確認在批間的品質(zhì)的偏差等的問題。
[0005]【現(xiàn)有技術文獻】
[0006]【專利文獻】
[0007] 專利文獻1 :專利第4514919號公報 [0008]【非專利文獻】
[0009]非專利文獻I:StameyTA,YangN,HayAR,etal.,N. Engl. J. Med. 1987 ;317 :909-916
[0010] 非專利文獻2 :CatalonaWJ,etal.,JAMA1998 ;279 :1542-1547
[0011] 非專利文獻 3 :0hyamaC,etal.,Glycobiology,2004 ; 14 :671_679
[0012] 非專利文獻 4 :BelangerA,VanHalbeekH,GravuxesHC,etal.Prostate,1995 ;27 : 187-197
[0013] 非專利文獻 5 :TajiriM,OhyamaC,WadaY,Glycobiology,2008 ;18 :2-8 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0014]【發(fā)明要解決的技術課題】
[0015] 從而本發(fā)明以提供以少的分析樣品高靈敏度地再現(xiàn)性良好地識別Pca和BPH的方 法作為目的。
[0016] 【解決課題的技術方案】
[0017] 本發(fā)明人鑒于上述的方面進行銳意探討的結果發(fā)現(xiàn),通過使用特異性地識別末端 唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克隆抗體的免疫學測定法測定分析 樣品中含的有末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量,可 以少的分析樣品高靈敏度地再現(xiàn)性良好地識別Pca和BPH。
[0018] 基于上述的見解進行的本發(fā)明的用于識別Pca和BPH的方法,如實施方式1所述, 包括:使含PSA的分析樣品和固定化了抗游離PSA抗體的載體接觸,而使游離PSA結合于載 體上固定化了的抗游離PSA抗體之后,使游離PSA結合于固定化了的抗游離PSA抗體的載 體和特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克隆抗體接 觸,而使特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克隆抗體 結合于與載體上固定化了的抗游離PSA抗體結合的游離PSA,測定有末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量,通過將得到的測定量與預先設定的Pca 和BPH的截止值比較,將相比截止值更多的情況判斷為Pca或其似然性高,少的情況判斷為 BPH或其似然性高。
[0019] 另外,實施方式2所述的方法是在實施方式1所述的方法中,含PSA的分析樣品是 選自血清、尿、前列腺組織提取液、精液、膀胱清洗液的至少1種。
[0020] 另外,實施方式3所述的方法是在實施方式1所述的方法中,抗游離PSA抗體是抗 人游離PSA特異性單克隆抗體(不與復合物PSA反應)。
[0021] 另外,實施方式4所述的方法是在實施方式1所述的方法中,載體是磁性粒子。
[0022] 另外,本發(fā)明的用于識別Pca和BPH的試劑盒,如實施方式5所述,至少含固定化 了抗游離PSA抗體的載體,和特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合 的糖鏈的單克隆抗體。
[0023] 【發(fā)明效果】
[0024] 由本發(fā)明可提供以少的分析樣品高靈敏度地再現(xiàn)性良好地識別Pca和BPH的方 法。 【【附圖說明】】
[0025] 【圖1】是實施例1中的,Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量的測定結果(根據(jù)熒光強度)。
[0026] 【圖2】同是實施例1中的,基于測定結果的ROC曲線。
[0027] 【圖3】實施例2中的,Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量的測定結果(左)和基于此測定結果的ROC曲線(右)。
[0028] 【圖4】實施例3中的,Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量的測定結果(左)和基于此測定結果的 ROC曲線(右)。
[0029] 【圖5】實施例4中的,Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量的測定結果(用空白樣品的熒光強度或 HLT樣品的熒光強度補正的)。
[0030] 【實施方式】
[0031] 本發(fā)明的用于識別Pca和BPH的方法包括:使含PSA的分析樣品和固定化了抗游 離PSA抗體的載體接觸,而使游離PSA結合于載體上固定化了的抗游離PSA抗體之后,使 游離PSA結合于固定化了的抗游離PSA抗體的載體和特異性地識別末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克隆抗體接觸,而使特異性地識別末端唾液酸殘基通 過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克隆抗體結合于與載體上固定化了的抗游離PSA抗 體結合的游離PSA,測定有末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離 PSA量,通過將得到的測定量與預先設定的Pca和BPH的截止值比較,將相比截止值更多的 情況判斷為Pca或其似然性高,少的情況判斷為BPH或其似然性高。
[0032] 在本發(fā)明中,作為含PSA的分析樣品,可舉出血清、尿、前列腺組織提取液、精液、 膀胱清洗液等。其制備可由公知的方法進行。分析樣品是少量即可。優(yōu)選為1~1000 y1、 更優(yōu)選為5~500y1、最優(yōu)選為10~100y1。
[0033] 固定化了抗游離PSA抗體的載體可使用市售的抗游離PSA抗體和載體,由公知的 方法制備。為了高靈敏度地測定有末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖 鏈的游離PSA量,作為抗游離PSA抗體,優(yōu)選使用抗人游離PSA特異性單克隆抗體(不與復 合物PSA反應的)(例如克隆2E2來源的或克隆8A6來源的等被市售)。載體只要是可固 定化磁性粒子或孔板等的抗體即可,由于可由磁力容易地回收而處理性優(yōu)良等的點,優(yōu)選 為磁性粒子。再有,在本發(fā)明中"游離PSA"是指不與a1-抗胰凝乳蛋白酶等的蛋白結合的 PSA,也被稱為非蛋白結合型PSA或游離型PSA(復合物PSA是指與蛋白結合的PSA)。
[0034] 特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克隆 抗體只要是末端唾液酸殘基通過a(2,3)鍵與半乳糖結合的糖鏈、S卩,特異性地識別 Siaa(2, 3)Gal糖鏈的單克隆抗體即可。作為市售的例示有由是本發(fā)明人的鈴木等的組確 立的HYB4單克隆抗體(和光純藥公司),但不限于此。
[0035] 使含PSA的分析樣品和固定化了抗游離PSA抗體的載體接觸,而使游離PSA結合 于載體上固定化了的抗游離PSA抗體的工序,及使游離PSA結合于固定化了的抗游離PSA 抗體的載體和特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖鏈的單克 隆抗體接觸,而使以90>特異性地識別末端唾液酸殘基通過a(2, 3)鍵與半乳糖結合的糖 鏈的單克隆抗體結合于與載體上固定化了的抗游離PSA抗體結合的游離PSA的工序,均 在例如,在2°C~5°C的溫度條件下進行10分鐘~3小時即可。有末端唾液酸殘基通過 a(2, 3)鍵與半乳糖結合的N型糖鏈的游離PSA量的測定可由例如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附試 驗)夾心法或流式細胞術進行。后者的情況中,測定例如使用進行可檢測的熒光標記的第 二抗體進