專利名稱:屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)l-蘇氨酸細(xì)菌以及生產(chǎn)l-蘇氨酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸的方法，更具體地涉及有助于這種發(fā)酵的源自大腸桿菌(Escherichia coli)的基因。所述基因可以用來提高L-氨基酸生產(chǎn)，具體地， 例如，用來提高L-蘇氨酸的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，L-氨基酸是通過利用獲自天然來源的微生物菌株或其突變體的發(fā)酵方法進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)的，這些菌株受到修飾以提高L-氨基酸的產(chǎn)量。
已經(jīng)報(bào)道過許多提高L-氨基酸產(chǎn)量的技術(shù)，包括用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(例如參見美國專利號(hào)4，278，765)。其它提高產(chǎn)量的技術(shù)包括提高涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使所得的L-氨基酸的反饋抑制的靶酶脫敏(例如參見W095/16042或美國專利 4，346，170 ；5，661，012 和 6，040，160)。
可用于發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株是已知的，其中，某些菌株中涉及L-蘇氨酸生物合成的酶的活性提高(美國專利5，175，107 ；5, 661, 012 ；5, 705,371 ；5，939，307 ； EP0219027)，某些菌株耐受化學(xué)藥物如L-蘇氨酸及其類似物(W00114525A1，EP301572A2, US5, 376，538)，某些菌株中受產(chǎn)物L(fēng)-氨基酸或其副產(chǎn)物的反饋抑制的靶酶被脫敏(美國專禾Ij 5，175，107 ；5，661，012)，某些菌株中蘇氨酸降解酶失活(美國專利5，939，307 ； 6，297，031)。
已知的產(chǎn)蘇氨酸菌株VKPM 8-3996(美國專利5，175，107和5，705，371)是目前已知的最好的產(chǎn)蘇氨酸菌。為了構(gòu)建菌株VKPM B-3996，將下述幾種突變和質(zhì)粒導(dǎo)入親本大腸桿菌K-12(VKPM B-7)。突變體thrA基因(突變thrA44》編碼耐受蘇氨酸的反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I。突變體ilvA基因(突變ilvA44》編碼活性降低的蘇氨酸脫氨酶，其導(dǎo)致異亮氨酸生物合成的速率降低并且導(dǎo)致異亮氨酸饑餓的滲漏(leaky)表型。在包含ilvA442突變的細(xì)菌中，thrABC操縱子的轉(zhuǎn)錄不被異亮氨酸所抑制，因此對(duì)于蘇氨酸生產(chǎn)非常有效。tdh基因的失活導(dǎo)致蘇氨酸降解被阻止。將蔗糖同化作用的遺傳決定子(scrKYABR基因)轉(zhuǎn)移給所述菌株。為了提高控制蘇氨酸生物合成的基因的表達(dá)，將含有突變體蘇氨酸操縱子thrA442BC的質(zhì)粒pVIC40導(dǎo)入中間菌株TDH6。該菌株發(fā)酵期間積聚的L-蘇氨酸的量可以高達(dá)85g/l。
本發(fā)明人獲得了相對(duì)于大腸桿菌K-12的突變體thrR (本文稱作rhtA23)，其在基本培養(yǎng)基中具有對(duì)高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的耐受性(resistance) (Astaurova, 0· B.等，Appl. Bioch. And Microbiol.，21，611-616 (1985))。在分別產(chǎn)生 L-蘇氨酸(SU 專利號(hào) 974817)、高絲氨酸和谷氨酸(Astaurova, 0. B.等，Appl. Bioch. And Microbiol.，27， 556-561,1991, EP1013765A)的大腸桿菌菌株例如菌株VKPM B-3996中，上述突變導(dǎo)致這些氨基酸產(chǎn)量的提高。另外，本發(fā)明人揭示rhtA基因存在于大腸桿菌染色體ISmin上，鄰近編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)送系統(tǒng)組分的glnHPQ操縱子，并且所述rhtA基因與位于pexB和ompX基因之間的 ORFl(ybiF 基因，在 GenBank 登錄號(hào) AAA218541，gi :440181 中的第 764-1651 位)相同。表達(dá)ORFl編碼的蛋白的單元已被命名為rhtA(rht 耐受高絲氨酸和蘇氨酸) 基因。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)rhtA23突變是相對(duì)于ATG起始密碼子-1位上的A-G取代 (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and MolecularBiology in conjugation with 1997Annual Meeting of the American Society forBiochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24—29,1997, abstract No. 457，EP1013765A)。
在蘇氨酸生物合成主流途徑的優(yōu)化條件下，可以通過向產(chǎn)蘇氨酸菌株補(bǔ)充遞增量的蘇氨酸遠(yuǎn)源前體(distant precursor)，如天冬氨酸，來進(jìn)一步改良該產(chǎn)蘇氨酸菌株。
已知天冬氨酸(aspartate)是天冬氨酸家族氨基酸(蘇氨酸，甲硫氨酸，賴氨酸) 以及二氨基庚二酸(diaminopimelate)(參與組成細(xì)菌細(xì)胞壁的一種化合物)合成的碳的供體。這些合成都要經(jīng)歷一條具有若干分枝點(diǎn)和極其敏感的調(diào)控方案的復(fù)雜途徑，在分枝點(diǎn)上(天冬氨酸，天冬氨酸半醛，高絲氨酸)存在著同工酶，其種數(shù)與從這一生物合成步驟所衍生的氨基酸一樣多。由thrABC操縱子的一部分編碼的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶 I促成蘇氨酸生物合成的第一和第三個(gè)反應(yīng)。蘇氨酸和異亮氨酸調(diào)節(jié)天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的表達(dá)，并且蘇氨酸還抑制催化上述兩個(gè)反應(yīng)的活性(Escherichia coli and Salmonella, Second Edition, Editor in Chief :F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C.，1996)。
asd基因編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(Asd ；EC 1. 2. 1. 11)，其是賴氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸和二氨基庚二酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶。天冬氨酸-β -半醛脫氫酶伴隨著NADP 的還原可逆地將L-天冬氨酰-4-Ρ轉(zhuǎn)變成L-天冬氨酸半醛。美國專利6，040, 160公開了 asd 基因擴(kuò)增對(duì)于大腸桿菌菌株的L-賴氨酸(屬于天冬氨酸家族)生產(chǎn)的影響。EP0219027A 公開了天冬氨酸-β-半醛脫氫酶可以用于棒狀桿菌(coryneform bacteria)的L-賴氨酸， L-蘇氨酸和L-異亮氨酸的生產(chǎn)。
不過，到目前為止，尚無利用具有增強(qiáng)的天冬氨酸- β -半醛脫氫酶活性的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌來生產(chǎn)L-蘇氨酸的報(bào)道。
發(fā)明概述
本發(fā)明的一個(gè)目的是提高產(chǎn)L-蘇氨酸菌株的產(chǎn)率以及提供一種利用這些菌株生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法。
上述目的已經(jīng)通過克隆在低拷貝載體上的編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的asd 基因可提高L-蘇氨酸生產(chǎn)這一發(fā)現(xiàn)而得以實(shí)現(xiàn)。由此，本發(fā)明已告完成。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)受到修飾以增強(qiáng)天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的活性。
本發(fā)明的另一目的是提供上述的細(xì)菌，其中通過提高天冬氨酸-半醛脫氫酶基因的表達(dá)而增強(qiáng)天冬氨酸-半醛脫氫酶的活性。
本發(fā)明的另一目的是提供上述的細(xì)菌，其中通過增加天冬氨酸半醛脫氫酶基因的拷貝數(shù)或修飾所述基因的表達(dá)控制序列來提高基因表達(dá)，從而增強(qiáng)天冬氨酸半醛脫氫酶的活性。
本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中通過用包含所述基因的載體轉(zhuǎn)化所述細(xì)菌來增加所述拷貝數(shù)。
本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中天冬氨酸-半醛脫氫酶基因源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌。
本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述天冬氨酸-半醛脫氫酶基因編碼選自下列的蛋白質(zhì)
(A)含有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B)含有在SEQ ID NO 2 所示的氨基酸序列中包含了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的刪除、取代、插入或添加的氨基酸序列，并具有天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的活性的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的另一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述天冬氨酸-半醛脫氫酶基因包含選自下列的DNA:
(a)包含SEQ ID NO=I中核苷酸1-1101的核苷酸序列的DNA ；和
(b)可在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO=I中核苷酸1-1101的核苷酸序列或與由該核苷酸序列制備的探針雜交，并且編碼具有天冬氨酸-β -半醛脫氫酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述嚴(yán)格條件包括在60°C及Ix SSC和0. SDS的鹽濃度下洗滌15分鐘的條件。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已被進(jìn)一步修飾以提高一種或多種選自下列的基因的表達(dá)
-突變體thrA基因，其編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，且其耐受蘇氨酸的反饋抑制；
-編碼高絲氨酸激酶的thrB基因；
-編碼蘇氨酸合酶的thrC基因；和
-編碼推定的跨膜蛋白的rhtA基因。
本發(fā)明的又一目的是提供如上所述的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已被修飾以提高所述突變體thrA基因，所述thrB基因，所述thrC基因和所述rhtA基因的表達(dá)。
本發(fā)明的又一目的是提供生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的細(xì)菌以引起L-蘇氨酸在培養(yǎng)基中的積聚，并且從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述
在本發(fā)明中，“產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌”指一種細(xì)菌，當(dāng)其在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)可以引起 L-蘇氨酸在培養(yǎng)基中積聚。可以通過選育來賦予或提高這種產(chǎn)L-蘇氨酸的能力。本文所用的短語“產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌”還指一種細(xì)菌，其與大腸桿菌野生型或親本菌株例如大腸桿菌K-12菌株相比，能產(chǎn)生更多的L-蘇氨酸并引起L-蘇氨酸在培養(yǎng)基中以更高的量積聚。
短語“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”指按照微生物領(lǐng)域技術(shù)人員已知的分類法而歸類在埃希氏菌屬中的細(xì)菌。本發(fā)明中用到的屬于埃希氏菌屬的微生物包括但不限于大腸桿菌 (E. coli) ο
可以用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的微生物并無特別限制，但例如由Neidhardt， F. C.等描述的細(xì)菌(大腸桿菌和鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium)，American Society for Microbiology, Washington D. C.，1208，表 1)當(dāng)為本發(fā)明所包括。
短語“天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的活性”指在磷酸或砷酸存在的情況下催化NADP 可逆的底物依賴型還原的活性。天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的活性可以通過如ft~eiSS，J.等(Curr. Microbiol.，7 :263-268(1982))所述的方法進(jìn)行測(cè)量。
短語“受到修飾以提高天冬氨酸- β -半醛脫氫酶的活性”指平均每個(gè)細(xì)胞的活性高于未修飾的菌株，如野生型菌株。此類修飾的例子包括提高平均每個(gè)細(xì)胞的天冬氨酸-β -半醛脫氫酶分子的數(shù)目，提高平均每個(gè)天冬氨酸-β -半醛脫氫酶分子的比活性等等。另外，可以用作比較的野生型菌株包括例如大腸桿菌Κ-12。天冬氨酸半醛脫氫酶細(xì)胞內(nèi)活性的提高將引起培養(yǎng)基中L-蘇氨酸積聚的量提高。
通過增強(qiáng)編碼天冬氨酸- β -半醛脫氫酶的基因的表達(dá)可以實(shí)現(xiàn)細(xì)菌細(xì)胞中天冬氨酸半醛脫氫酶活性的增強(qiáng)。源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的任何基因，以及源自其它細(xì)菌，如棒狀桿菌的任何基因，都可以用作天冬氨酸半醛脫氫酶基因。在這些之中，優(yōu)選屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的基因。
作為編碼大腸桿菌天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的基因，asd基因已經(jīng)得以闡明 (GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 1，gi :16131307 的序列中第 3572511-3571408 位核苷酸)。 因此，利用基于該基因核苷酸序列制備的引物通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參照White， T.J.等，Trends Genet.，5，185 (1989))可以獲得asd基因。以類似的方式可以獲得其它微生物的編碼天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的基因。
源自大腸桿菌的asd基因可以體現(xiàn)為例如編碼下列蛋白質(zhì)㈧或⑶的DNA
(A)具有SEQ ID NO 2中所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或
(B)具有在SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中包含了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的刪除、取代、插入或添加的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。
“幾個(gè)”氨基酸的數(shù)目根據(jù)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位置或種類而不同。它可以是2-30，優(yōu)選2-15，對(duì)于蛋白質(zhì)(A)更優(yōu)選2-5。在對(duì)于所述蛋白質(zhì)的功能非關(guān)鍵性的蛋白質(zhì)區(qū)域中可以發(fā)生氨基酸的刪除、取代、插入或添加。這是因?yàn)橐恍┌被岜舜司哂懈叨韧葱詮亩S結(jié)構(gòu)或活性不受這種變化影響。因此，在保持天冬氨酸半醛脫氫酶的活性的前提下，蛋白質(zhì)變異體(B)可以是相對(duì)于SEQ ID NO :2中所示天冬氨酸-β-半醛脫氫酶完整氨基酸序列具有不低于70 %，優(yōu)選不低于80 %，更優(yōu)選不低于90 %，最優(yōu)選不低于95%同源性的任一變異體。兩種氨基酸序列之間的同源性可以利用公知的方法確定， 例如計(jì)算機(jī)程序BLAST 2. 0，其計(jì)算三種參數(shù)分值、同一性和相似性。
—個(gè)或幾個(gè)氨基酸的取代、刪除、插入或添加應(yīng)當(dāng)是保守性突變以維持活性。代表性的保守性突變是保守性取代。保守性取代的例子包括Ser或Thr對(duì)Ala的取代，Gln, His 或 Lys 對(duì) Arg 的取代，Glu, Gin, Lys, His 或 Asp 對(duì) Asn 的取代，Asn, Glu 或 Gln 對(duì) Asp 的取代，Ser 或 Ala 對(duì) Cys 的取代，Asn, Glu, Lys, His, Asp 或 Arg 對(duì) Gln 的取代，Asn, Gln, Lys 或 Asp 對(duì) Glu 的取代，Pro 對(duì) Gly 的取代，Asn，Lys, Gin, Arg 或 Tyr 對(duì) His 的取代，Leu， Met, Val 或 Phe 對(duì) Ile 的取代，lie, Met, Val 或 Phe 對(duì) Leu 的取代，Asn, Glu, Gin, His 或 Arg 對(duì) Lys 的取代，lie，Leu，Val 或 Phe 對(duì) Met 的取代，Trp，Tyr，Met，Ile 或 Leu 對(duì) Phe 的取代，Thr或Ala對(duì)kr的取代，Ser或Ala對(duì)Thr的取代，Phe或Tyr對(duì)Trp的取代，His, Phe或Trp對(duì)Tyr的取代，和Met，Ile或Leu對(duì)Val的取代。
編碼與上述天冬氨酸-β -半醛脫氫酶基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過例如修飾編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶(SEQ ID NO 1)的DNA的核苷酸序列而獲得，例如，通過定點(diǎn)誘變使在特定位點(diǎn)上的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基包括(involve)刪除、取代、插入或添加。如上所述修飾的DNA可以通過常規(guī)已知的突變處理獲得。這些處理包括用羥胺處理編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，或用紫外光輻照或諸如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸的試劑對(duì)包含所述DNA的細(xì)菌進(jìn)行處理。
編碼與天冬氨酸-β -半醛脫氫酶基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過在合適的細(xì)胞中表達(dá)具有上述突變的DNA并考察任何表達(dá)產(chǎn)物的活性而獲得。編碼與天冬氨酸-β -半醛脫氫酶基本上相同的蛋白質(zhì)的DNA還可以通過從編碼天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的突變體DNA或從包含突變體的細(xì)胞中分離DNA而獲得，其可以在嚴(yán)格條件下與核苷酸序列中包含有例如SEQ IDNO 1中所示核苷酸序列的探針雜交，并且編碼具有天冬氨酸-β-半醛脫氫酶活性的蛋白質(zhì)?！皣?yán)格條件”這里指這樣的條件，在該條件下形成所謂的特異性雜交體，并且不形成非特異性雜交體。這種條件難以用數(shù)值來清楚地表達(dá)。不過， 例如，可以以下面的條件為例來說明嚴(yán)格條件在此條件下，具有高度同源性的DNA，例如具有不小于50%同源性的DNA，可以彼此雜交；但是同源性低于上述值的DNA則不能彼此雜交。或者，嚴(yán)格條件也可以以下面的條件為例來說明在此條件下，DNA能夠在等同于DNA 印跡雜交(Southern hybridization)中普通洗滌條件的鹽濃度，即Ix SSC,0. 1% SDS，優(yōu)選0. Ix SSC, 0. 1% SDS的鹽濃度下，于60°C雜交。洗滌的持續(xù)時(shí)間取決于用于印跡雜交的膜的類型，而且按照慣例由生產(chǎn)商推薦。例如，推薦的在嚴(yán)格條件下洗滌Hybond N+尼龍膜(Amersham)的持續(xù)時(shí)間為15分鐘。
還可以將SEQ ID NO=I核苷酸序列的部分序列用作探針。探針可以利用基于SEQ ID NO :1核苷酸序列的引物，并包含SEQ ID NO 1核苷酸序列的DNA片段作為模板，通過PCR 來制備。當(dāng)使用大約300bp長(zhǎng)度的DNA片段作為探針時(shí)，洗滌的雜交條件包括，例如，50°C， 2x SSC 和 0. 1% SDS0
如上所述的核苷酸的取代、刪除、插入或添加還包括天然存在的突變(突變體或變異體)，這些突變可以歸因于，例如，含有天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的細(xì)菌的種內(nèi)或?qū)賰?nèi)的多樣性。
“用編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌”指通過例如常規(guī)方法將DNA導(dǎo)入細(xì)菌中。這種 DNA的轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的提高，并且將增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的活性。
增強(qiáng)基因表達(dá)的方法包括提高基因拷貝數(shù)。將基因?qū)肽軌蛟趯儆诎ＯＪ暇鷮俚募?xì)菌中發(fā)揮作用的載體中可提高該基因的拷貝數(shù)。優(yōu)選地使用低拷貝載體。低拷貝載體的例子包括但不限于pSC101，p麗118，ρ麗119等等。術(shù)語“低拷貝載體”是用于指拷貝數(shù)最高為5拷貝每細(xì)胞的載體。轉(zhuǎn)化的方法包括迄今已報(bào)道的任何已知方法。例如，對(duì)于大腸桿菌Κ-12可以利用已經(jīng)報(bào)道的一種通過氯化鈣處理受體細(xì)胞而提高細(xì)胞對(duì)于DNA的通透性的方法(Mandel, Μ.和 Higa，Α.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))。
基因表達(dá)的增強(qiáng)還可以通過例如同源重組，Mu整合(Mu integration)等方法，將多拷貝的基因?qū)爰?xì)菌染色體中而實(shí)現(xiàn)。例如，一次Mu整合允許最多將基因3個(gè)拷貝導(dǎo)入細(xì)菌染色體中。
基因表達(dá)的增強(qiáng)還可以通過將本發(fā)明的DNA置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下而實(shí)現(xiàn)。例如，已知的Iac啟動(dòng)子，trp啟動(dòng)子，trc啟動(dòng)子，以及λ噬菌體的Pk，和啟動(dòng)子都是強(qiáng)啟動(dòng)子。可以將強(qiáng)啟動(dòng)子的使用與基因拷貝的增加結(jié)合起來。[0053]或者，可以通過例如向啟動(dòng)子中導(dǎo)入突變以提高位于該啟動(dòng)子下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而增強(qiáng)啟動(dòng)子的作用。另外已知，發(fā)生在核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)和起始密碼子之間的間隔區(qū)中，特別是起始密碼子緊鄰上游的序列中的幾個(gè)核苷酸的取代，可深刻地影響mRNA 的可翻譯性。例如已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，根據(jù)起始密碼子之前三個(gè)核苷酸的性質(zhì)不同，表達(dá)水平變化范圍可達(dá) 20 倍(Gold 等，Annu. Rev. Microbiol.，35，365-403，1981 ；Hui 等，EMBO J.，3， 623-629，1984)。已經(jīng)證明，rhtA23突變是在相對(duì)ATG起始密碼子的_1位置上的A-G取代 (ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistryand Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of theAmerican Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24—29,1997, abstract No. 457)。由此可能暗示，rhtA23突變將增強(qiáng)rhtA基因表達(dá)，并因此提高對(duì)于蘇氨酸，高絲氨酸和其它一些轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的物質(zhì)的耐受性。
另外，還可以向細(xì)菌染色體上天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因的啟動(dòng)子區(qū)中導(dǎo)入核苷酸取代，從而增強(qiáng)啟動(dòng)子功能。改變表達(dá)控制序列可以通過例如與使用溫度敏感型質(zhì)粒的基因置換相同的方式來進(jìn)行，如在國際公開號(hào)W000/18935和日本專利公開號(hào) 1-215280中所公開的。
提高天冬氨酸半醛脫氫酶基因的拷貝數(shù)還可以通過將多拷貝的天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因?qū)爰?xì)菌的染色體DNA中而實(shí)現(xiàn)。為了將多拷貝的天冬氨酸-β -半醛脫氫酶基因?qū)爰?xì)菌染色體中，使用在染色體DNA中具有多個(gè)拷貝的序列進(jìn)行同源重組，以該序列在染色體DNA中的拷貝為同源重組的靶序列。在染色體DNA中具有多個(gè)拷貝的序列包括但不限于重復(fù)DNA，或存在于轉(zhuǎn)座元件末端的反向重復(fù)序列。另外，如美國專利號(hào)5，595，889所公開的，可以將天冬氨酸_ β _半醛脫氫酶基因并入轉(zhuǎn)座子中，并使該轉(zhuǎn)座子得以被轉(zhuǎn)移以便將該基因的多個(gè)拷貝導(dǎo)入染色體DNA中。
質(zhì)粒DNA的制備方法包括但不限于DNA的消化和連接，轉(zhuǎn)化，選擇寡核苷酸作為引物等等，或其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法。這些方法，已在例如Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch, Ε· F.,禾口 Maniatis, Τ· ,“Molecular CloningA Laboratory Manual, Second Edition，，, Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)中得以描述。
可以通過將上述DNA導(dǎo)入具有固有的產(chǎn)L-蘇氨酸能力的細(xì)菌中而獲得本發(fā)明的細(xì)菌?；蛘撸梢酝ㄟ^賦予已經(jīng)包含上述DNA的細(xì)菌以產(chǎn)L-蘇氨酸的能力而獲得本發(fā)明的細(xì)菌。
本發(fā)明的所包括的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)L-蘇氨酸細(xì)菌如大腸桿菌菌株TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美國專利5，175，107，美國專利5，705，371)，大腸桿菌菌株NRRL-21593(美國專利5，939，307)，大腸桿菌菌株FERM BP-3756 (美國專利5，474，918)，大腸桿菌菌株FERM BP-3519和FERM BP-3520 (美國專利 5，376，538)，大腸桿菌菌株 MG442 (Gusyatiner 等，Genetika (俄文)，14，947-956 (1978))， 大腸桿菌菌株VL643和VL2055 (EPl 149911A)等等。
菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，并且是蔗糖同化性的(sucroseassimilative)， 而ilvA基因具有滲漏突變。此菌株在rhtA基因中具有突變，此突變賦予對(duì)于高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的耐受性。菌株B-3996含有質(zhì)粒pVIC40，該質(zhì)粒是通過將包括編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變體thrA基因的thrA*BC操縱子插入到源于RSF1010的載體中而獲得的，所述天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I已經(jīng)基本上對(duì)蘇氨酸引起的反饋抑制脫敏。菌株B-3996于1987年11月19日保藏于全聯(lián)盟抗生素科學(xué)中心(All-Union Scientific Center of Antibiotics)(Nagatinskaya Street3_A,113105Moscow, Russian !^deration)，保藏號(hào)RIA1867。該菌株還于1987年4月7日保藏于俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (Dorozhny proezd. 1，Moscow 113545，Russian Federation)，保藏號(hào) B-3996。
優(yōu)選地，本發(fā)明的細(xì)菌受到進(jìn)一步修飾以增強(qiáng)下列基因中的一種或多種以及asd 基因的表達(dá)
-編碼耐受由蘇氨酸引起的反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變體 thrA基因；
-編碼高絲氨酸激酶的thrB基因；
-編碼蘇氨酸合酶的thrC基因；
本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是這樣的細(xì)菌，其除了 asd基因被增強(qiáng)之外，還受到修飾以增強(qiáng)編碼推定的跨膜蛋白的rhU基因。本發(fā)明的最優(yōu)選的實(shí)施方案是受到修飾以提高asd基因，突變體thrA基因，thrB基因，thrC基因和rhtA基因的表達(dá)的細(xì)菌。
本發(fā)明的生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-蘇氨酸得以在培養(yǎng)基中積聚，并且從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸的步驟。
在本發(fā)明中，培養(yǎng)以及從培養(yǎng)基中收集并純化L-蘇氨酸可以通過類似于常規(guī)發(fā)酵方法的方式進(jìn)行，在所述常規(guī)發(fā)酵方法中利用微生物生產(chǎn)L-蘇氨酸。
用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是合成的也可以是天然培養(yǎng)基，只要是所述培養(yǎng)基包括碳源，氮源和礦物質(zhì)，必要時(shí)還包括適量的微生物生長(zhǎng)所需的營養(yǎng)成分。所述碳源可以包括多種糖類如葡萄糖和蔗糖，以及多種有機(jī)酸。根據(jù)所選微生物的同化方式，可以使用醇類，包括乙醇和甘油。用作所述氮源的有各種銨鹽如氨和硫酸銨，其它的氮化合物如胺 (amine)，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物，和經(jīng)過消化的發(fā)酵微生物。用作所述礦物質(zhì)的有磷酸二氫鉀(potassium monophosphate)，硫酸鎂，氯化鈉，硫酸亞鐵，硫酸錳，氯化鈣等等。用作所述維生素的有硫胺素，酵母提取物等等。必要時(shí)，培養(yǎng)基中可以加入其它營養(yǎng)成分。例如，如果微生物生長(zhǎng)需要異亮氨酸(異亮氨酸營養(yǎng)缺陷型)，可以將足量的異亮氨酸加到培養(yǎng)基中。
優(yōu)選在有氧條件下進(jìn)行培養(yǎng)，例如振蕩培養(yǎng)和通氣攪拌培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為 20-40 V，優(yōu)選30-38 V。培養(yǎng)物的pH通常在5和9之間，優(yōu)選在6. 5和7. 2之間?？梢杂冒保妓徕}，多種酸，多種堿和緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的PH。通常，1-5天的培養(yǎng)可導(dǎo)致L-蘇氨酸在液體培養(yǎng)基中的積聚。
培養(yǎng)后，可以通過離心或膜過濾將固體如細(xì)胞從液體培養(yǎng)基中移除，隨后收集 L-蘇氨酸并通過離子交換，濃縮和結(jié)晶方法進(jìn)行純化。
實(shí)施例
下面將參照下列非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加具體地闡釋。
實(shí)施例1 :asd基因從大腸桿菌中克隆入pM載體
從獲自俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (Dorozhny proezd. 1，Moscow 113545，Russian Federation)的大腸桿菌菌株(K12Mu cts62Mud5005) (VKPM B-6804)的染色體DNA中克隆asd基因。首先，誘導(dǎo)大腸桿菌菌株(K12Mu cts62Mud5005) (VKPM B-6804)中的小Mu噬菌體。隨后，使用所獲得的一組(the set)包含部分染色體的質(zhì)粒 pMud5005的衍生物轉(zhuǎn)化asd菌株SH 309。獲自俄羅斯國立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM) (Dorozhnyproezd. 1, Moscow 113545, Russian Federation) ^ SH 309 (VKPMB-3899) 具有下列表型:F-araD139rpsL150deoCl ptsF25relAl feb5301rbsRugpA704: : TnlODel (ar gF-lac) U169Del (mal-asd) TetE StrE0 asd-菌株 SH309 不能在 L-培養(yǎng)基(L-medium)上生長(zhǎng)，且其生長(zhǎng)需要二氨基庚二酸(diaminopimelinic acid) (DAPA)。在L-培養(yǎng)基上選擇具有質(zhì)粒pMud5005-asd的SH 309asd+克隆。分離質(zhì)粒pMud5005_asd并將含有asd基因的 BamHI-PstIDNA片段(1646bp)再克隆入ρ麗119，所述ρ麗119事先已被修飾使得啟動(dòng)子Plac 為啟動(dòng)子PkK取代。由此構(gòu)建了含有受啟動(dòng)子Pk控制的asd基因的質(zhì)粒pMW-asd。質(zhì)粒 pMW-asd與質(zhì)粒pVIC40(復(fù)制子pRSFlOlO)相容，因此兩種質(zhì)粒pVIC40和pMW_asd可以同時(shí)保持在細(xì)菌中。
將pMW-asd質(zhì)粒導(dǎo)入抗鏈霉素的產(chǎn)蘇氨酸大腸桿菌菌株B-3996中。由此獲得菌株 B-3996(pMW-asd)。
實(shí)施例2. asd基因擴(kuò)增對(duì)蘇氨酸生長(zhǎng)的影響
兩種大腸桿菌菌株B-3996和B-3996 (pMW-asd)都在含有鏈霉素(100 μ g/ml)和氨芐青霉素(100 μ g/ml)的L-瓊脂(L-agar)平板上于37°C生長(zhǎng)18- 小時(shí)。將菌株于旋轉(zhuǎn)振蕩器上O50rpm)32°C下在盛有2ml含4%蔗糖的L-肉湯培養(yǎng)基(L_broth medium) 的20X200mm試管中生長(zhǎng)18小時(shí)以獲得種子培養(yǎng)物。隨后，用0. Iml (5% )種子培養(yǎng)物接種發(fā)酵培養(yǎng)基。發(fā)酵在20X200mm試管中于2ml基本發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行。在32°C，250rpm 振蕩條件下使細(xì)胞生長(zhǎng)M小時(shí)。
培養(yǎng)后，通過薄層層析測(cè)定培養(yǎng)基中L-蘇氨酸的積聚量。用流動(dòng)相 propan-2-ol 丙酮水25%氨水=25 25 7 6 (ν/ν)在 Sorbfil 平板上展開， (StockCompany Sorbopolymer, Krasnodar, Russia)。用茚三酮的丙酮溶液(2% )作為顯色劑。結(jié)果在表1中給出。
發(fā)酵培養(yǎng)基的組成(g/Ι)如下
蔗糖40. O
(MM)2SO4 10. O
KH2PO41. O
MgSO4 · 7Η20 0. 4
FeSO4 · 7H20 0. 02
MnSO4 · 5H20 0. 02
鹽酸硫胺素 0. 0002
酵母提取物 1. 0
CaCO320. 0
L-異亮氨酸 0. 05
將蔗糖和硫酸鎂單獨(dú)滅菌。于180°C對(duì)CaCO3進(jìn)行干熱滅菌2小時(shí)。將pH調(diào)節(jié)至 7.0。滅菌后將抗生素加入培養(yǎng)基中。
盡管已經(jīng)參照其優(yōu)選的實(shí)施方案對(duì)發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)描述，對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見可以進(jìn)行各種變化，采用各種等同方案，而不背離本發(fā)明的范圍。本文引入上述各個(gè)文件的全文以供參考。
表 1.
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生L-蘇氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)大腸桿菌以使L-蘇氨酸在所述培養(yǎng)基中積累，其中所述大腸桿菌已受到修飾以增加天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的活性；和從所述培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸，其中所述大腸桿菌已進(jìn)一步受到修飾以與未修飾的細(xì)菌相比增強(qiáng)突變thrA基因、thrB基因、 thrC基因和rhtA基因的表達(dá)，所述突變thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I且其耐受蘇氨酸的反饋抑制，所述thrB基因編碼高絲氨酸激酶，所述thrC基因編碼蘇氨酸合酶，所述rhtA基因編碼推定的跨膜蛋白，其中通過增加編碼由SEQ ID NO 2的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的天冬氨酸-β -半醛脫氫酶基因的表達(dá)而使所述天冬氨酸-β -半醛脫氫酶的活性與未修飾的細(xì)菌相比增加。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中通過增加天冬氨酸半醛脫氫酶基因的拷貝數(shù)或?qū)⑺龌蛑糜趶?qiáng)啟動(dòng)子的控制下，從而增強(qiáng)天冬氨酸- β -半醛脫氫酶的所述活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2的方法，其中通過用包含所述基因的載體轉(zhuǎn)化所述大腸桿菌來增加拷貝數(shù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1的方法，其中所述天冬氨酸-β-半醛脫氫酶基因包含由SEQID NO 1中核苷酸1-1101的核苷酸序列組成的DNA。
專利摘要
公開了一種使用屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其中所述細(xì)菌已受到修飾以增強(qiáng)天冬氨酸-β-半醛脫氫酶的活性。
文檔編號(hào)C12N1/21GKCN1914328 B發(fā)布類型授權(quán) 專利申請(qǐng)?zhí)朇N 200480035821
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2004年12月3日
發(fā)明者埃卡特里納·A·薩夫拉索瓦, 安德雷·O·洛巴諾夫, 尤里·I·科茲洛夫, 瓦萊里·Z·阿克維迪安, 阿拉·M·卡普蘭 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan專利引用 (2), 非專利引用 (1),