專利名稱:環(huán)庚基脂環(huán)酸菌的核酸引物及鑒定環(huán)庚基脂環(huán)酸菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有對(duì)嗜酸菌特別是屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)的嗜酸菌特異的序列的核酸引物以及用此引物鑒定嗜酸菌的方法。
背景技術(shù)：
多數(shù)細(xì)菌很難在酸性飲料(如果汁，乳酸菌飲料)中生長，因而這種飲料不容易被難以在其中生長的這些細(xì)菌污染。但是，能夠在酸性環(huán)境中生長的嗜酸菌可以引起酸性飲料污染，尤其是耐高溫的嗜酸菌的污染，這些細(xì)菌用傳統(tǒng)的高溫消毒方法難以將其殺滅。
有幾種方法可以檢驗(yàn)在這些飲料中存在嗜酸菌引起的污染，某些培養(yǎng)基可用于這種檢測(cè)方法。如日本未經(jīng)審查的公開號(hào)1996-140697公開了檢測(cè)耐高溫嗜酸菌的選擇性培養(yǎng)基和檢測(cè)該菌的方法。日本未經(jīng)審查的公開號(hào)1996-140696提出了檢測(cè)可在果汁中生長的一種耐熱嗜酸菌的方法。
在這些方法中，細(xì)菌可通過生化特性實(shí)驗(yàn)得到檢測(cè)，如分析細(xì)菌體的脂肪酸成分。該特性實(shí)驗(yàn)的缺點(diǎn)在于需要大量時(shí)間與人力。并且，所檢驗(yàn)細(xì)胞的鑒定要經(jīng)過全面的生物學(xué)檢測(cè)，這也需要大量的時(shí)間和復(fù)雜的步驟。
最近提出一種方法可以取代以上方法，該方法用嗜酸菌基因的部分核苷酸序列作為引物，通過PCR進(jìn)行DNA分析，能夠快速、方便地檢測(cè)出飲料樣品中是否存在嗜酸菌(日本未經(jīng)審查的專利公開號(hào)1998-234376)。
該方法所用的引物有編碼一種酶的部分核酸序列，這種酶存在于耐高溫的嗜酸菌中，并與ω-環(huán)己烷脂肪酸的生物合成有關(guān)。使用這種引物的方法只能檢測(cè)能產(chǎn)生這種參與ω-環(huán)己烷脂肪酸的生物合成的細(xì)菌。也就是說，該方法不能檢測(cè)嗜酸菌，而是檢測(cè)能夠產(chǎn)生一種特定酶的細(xì)菌，不管該菌是否有嗜酸性。然而，嗜酸菌與能否產(chǎn)生該特定酶沒有直接關(guān)系。因此，也許能污染飲料或其類似物的嗜酸菌不一定都能產(chǎn)生這種特定的酶。多數(shù)引起污染的嗜酸菌沒有產(chǎn)生這種特定的酶的能力。因此，用上述檢測(cè)方法所得的結(jié)果不可能預(yù)測(cè)由污染，引起的食物或飲料問題如難聞氣味。
所以，上述方法不適于檢測(cè)飲料或類似樣品中含有的或有可能污染樣品的嗜酸菌。該方法不能確定飲料樣品安全與否(樣品是否被有害的嗜酸菌污染)。另外，這種方法不能確認(rèn)嗜酸菌的種類。
本發(fā)明的目的在于提供一種可選擇性檢測(cè)和鑒定嗜酸菌的方法。
發(fā)明公開本發(fā)明者為達(dá)到上述目的進(jìn)行了廣泛深入的研究。最后，發(fā)明者成功地合成了針對(duì)有害嗜酸菌基因的特異性核苷酸序列的引物，該嗜酸菌可能存在于飲料或類似樣品中，并且開發(fā)了用該引物通過PCR迅速、方便地檢測(cè)和鑒定樣品中有害嗜酸菌的方法。至此，發(fā)明者完成了本發(fā)明。
本發(fā)明提供的核酸引物，每一個(gè)都含有一段核苷酸序列，如SEQID NO1-14中任一個(gè)所示。
本發(fā)明還提供用于鑒定嗜酸菌的如下從(1)到(8)的引物對(duì)。
(1) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
(2) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO3和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
(3) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO4和SEQ ID NO5所示的核苷酸序列。
(4) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO6和SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
(5) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO6和SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
(6) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO9和SEQ ID NO10所示的核苷酸序列。
(7) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO11和SEQ ID NO12所示的核苷酸序列。
(8) 此對(duì)引物由兩個(gè)引物組成，其分別含有如SEQ ID NO13和SEQ ID NO14所示的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了鑒定方法，該方法通過使用以上(1)-(8)中的至少一對(duì)引物，通過PCR擴(kuò)增，鑒定至少一種嗜酸菌，具體地講，鑒定存在于樣品，特別是飲料中選自以下一組嗜酸菌中的至少一種酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)和環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)。本發(fā)明中嗜酸菌的鑒定方法包括如下(a)至(c)的實(shí)施方案。
(a) 使用(1)、(2)和(6)引物對(duì)中的至少一對(duì)鑒定酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)。
(b) 使用(3)和(7)引物對(duì)中的至少一對(duì)鑒定酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)。
(c) 使用(4)、(5)和(8)引物對(duì)中的至少一對(duì)鑒定環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)。
具體地講，本發(fā)明提供了一種通過一次PCR反應(yīng)完成(a)到(c)所述實(shí)施方案的方法。該方法可以實(shí)現(xiàn)，因?yàn)樵谙嗤琍CR條件下本發(fā)明的引物對(duì)能夠擴(kuò)增三種嗜酸菌的每一種菌的靶基因區(qū)。在該方法中，對(duì)三種嗜酸菌特異的三個(gè)引物對(duì)都放在例如多孔板的孔中，隨后對(duì)樣品進(jìn)行PCR，以便使三種嗜酸菌能夠同時(shí)由一次PCR反應(yīng)檢測(cè)和鑒定出來。如此，這種方法能簡(jiǎn)便、迅速地檢查樣品中存在的有害嗜酸菌，并因此能簡(jiǎn)單、快速地預(yù)測(cè)樣品中的污染。
本發(fā)明的鑒定方法測(cè)試樣品中存在的細(xì)菌DNA是否與本發(fā)明的核酸引物雜交，以確定嗜酸菌(脂環(huán)酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)的特定微生物)的存在與否。
在本說明書中，氨基酸、肽、核苷酸序列、核酸等的縮寫參見IUPAC-IUB Communication on Biological Nomenclature，Eur.J.Biochem.，1389(1984)或“Guideline for preparation of a specificationcontaining nucleotide sequences or amino acid sequences(JPO)”或在該領(lǐng)域中常規(guī)使用的那些縮寫。
以下將詳細(xì)闡述根據(jù)本發(fā)明的核酸引物、引物對(duì)和嗜酸菌的鑒定方法。
本發(fā)明的核酸引物必需包含一個(gè)由SEQ ID NOS1-14所示的核苷酸序列。每一序列ID號(hào)所表示的核苷酸序列基本與嗜酸菌的16s的核糖體RNA的部分核苷酸序列相對(duì)應(yīng)。
本發(fā)明者注意到了嗜酸菌16s的核糖體RNA基因，并發(fā)現(xiàn)使用具有該菌16s核糖體RNA基因特定部位的核苷酸序列或其同源核苷酸序列即在嚴(yán)格條件下能與16s核糖體RNA基因的核苷酸序列雜交的核苷酸序列作為引物能夠特異地鑒定靶嗜酸菌。
16s的核糖體RNA基因編碼核糖體RNA，核糖體RNA是核糖體(合成蛋白質(zhì)的一種重要的細(xì)胞器)的結(jié)構(gòu)成分，該基因存在于所有的微生物中。
可能混在飲料中的屬于脂環(huán)酸芽孢桿菌屬的有害嗜酸菌的16s核糖體RNA基因是已知的。如，關(guān)于酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)(ATCC27009)，源于DSM446菌株的1548個(gè)堿基對(duì)(在EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)，登錄號(hào)為X60742)就是已知的[Int.J.Syst.Bacteriol.，42(2)，263-269(1992)]。關(guān)于酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，被保藏微生物ATCC49025的16s核糖體RNA(1522 bp)可參見Hokkaido大學(xué)助研Yamazaki的博士論文。關(guān)于環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)(ATCC49028)，已知1537個(gè)堿基對(duì)在EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫中注冊(cè)，登錄號(hào)為X51928[Curr.Microbiol.，21，325-327(1990)]。
由于16s核糖體RNA是種特定的，該RNA的特定部分序列能夠非常好地用于鑒定可能存在于飲料等樣品中的有害嗜酸菌。
本發(fā)明的核酸引物被設(shè)計(jì)成被擴(kuò)增的區(qū)域有大約100到2000bp長，引物長至少約10個(gè)核苷酸，優(yōu)選13到30個(gè)核苷酸，更優(yōu)選13到23個(gè)核苷酸。
最好是引物對(duì)中的兩個(gè)引物具有盡可能近的Tm值(Nakayama，Hiroki，“Shinpan Bio Jikken IllustratedHonto ni fueru PCR(New Editionof Illustrated Biological ExperimentEfficient PCR)”，Shujun-sha，page25(2nded.，June 1，1998)，以提高擴(kuò)增的再現(xiàn)性。引物的核苷酸序列優(yōu)選盡可能與基因的核苷酸序列相似，以提高與待擴(kuò)增基因區(qū)域的特異結(jié)合能力。但引物核苷酸序列不必完全與基因核苷酸序列相同。有一或幾個(gè)堿基不同于基因的堿基的引物能擴(kuò)增到所需的基因核苷酸序列，從而檢測(cè)特定的嗜酸菌。這種引物的實(shí)例包括那些含有由SEQ ID NO3或8所示核苷酸序列的引物。
就以上條件，本發(fā)明的引物用已知的方法即可合成。如可用化學(xué)方法亞磷酸胺法或三酯法合成引物。另外，使用商品化的自動(dòng)寡核苷酸合成儀，例如Perkin-Elmer或其他廠家的自動(dòng)DNA合成儀，通過β-氰乙基合成方法也可合成該引物。
使用化學(xué)合成的單鏈產(chǎn)物，用以下方法能獲得雙鏈片段。首先，合成單鏈產(chǎn)物的互補(bǔ)鏈，然后，在適宜條件下，使互補(bǔ)鏈與單鏈產(chǎn)物退火/復(fù)性或用合適的引物序列和DNA聚合酶使之加到單鏈產(chǎn)物中。
本發(fā)明的引物可以被定義為在嚴(yán)格條件下，能夠與含有特定嗜酸菌16s核糖體RNA的核苷酸序列的DNA進(jìn)行雜交的一段DNA。嚴(yán)格條件是指通常使用引物的條件。如這樣一種條件在50℃下，含0.1％SDS的0.2×SSC，或60℃下，在含0.1％SDS的1×SSC中。
本發(fā)明中引物核苷酸序列的具體實(shí)例如SEQ ID NOS1-14所示。SEQ ID NO1的核苷酸序列與酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)DSM446 16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X60742，1548 bp)的核苷酸序列的161-180位核苷酸相對(duì)應(yīng)。SEQ ID NO3序列與以上序列相同，只是第3個(gè)堿基A被G替代。
SEQ ID NO2的核苷酸序列與酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)DSM446 16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X60742，1548 bp)的互補(bǔ)鏈序列的核苷酸序列的591-611位核苷酸相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO4的核苷酸序列與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)ATCC49025的16s核糖體RNA基因(1522bp)的核苷酸序列172-192位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO5的核苷酸序列與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)ATCC49025的16s核糖體RNA基因核(1522bp)的苷酸序列587-609位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO6的核苷酸序列與環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X51928，1537bp)的核苷酸序列的186-207位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO7的核苷酸序列與環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X51928，1537bp)的核苷酸序列的583-603位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO8與SEQ ID NO7相同，除了第11-14位堿基的cccg被ttc所取代。
SEQ ID NO9的核苷酸序列與酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X60742，1548bp)的核苷酸序列的168-180位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO10的核苷酸序列與酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X60742，1548bp)的互補(bǔ)鏈序列的核苷酸591-605位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO11的核苷酸序列與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)ATCC49025的16s核糖體RNA基因(1522bp)的核苷酸序列的176-192位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO12的核苷酸序列與酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)ATCC49025的16s核糖體RNA基因(1522bp)的核苷酸序列的587-606位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO13的核苷酸序列與環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X51928，1537bp)的核苷酸序列的191-207位相對(duì)應(yīng)。
SEQ ID NO14的核苷酸序列與環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X51928，1537bp)的核苷酸序列的583-595位相對(duì)應(yīng)。
可用于本發(fā)明方法中的引物組合(正向引物和反向引物組成的引物對(duì))實(shí)例包括以上(1)到(8)個(gè)引物對(duì)。
使用本發(fā)明中的引物對(duì)，通過確認(rèn)樣品中是否有擴(kuò)增的DNA片段，可以檢測(cè)和鑒定嗜酸菌(酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus))。
本發(fā)明方法中使用的典型樣品的實(shí)例為飲料，其他樣品包括土壤、蔬菜、肉類和糖果等，最好通過釣取菌落法將在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的克隆釣出，把測(cè)試細(xì)菌從樣品中分離出來。
依照本發(fā)明的方法，首先通過已知方法如酚抽提等從按上述方式分離的測(cè)試菌中提取DNA以獲得DNA樣本，然后使本發(fā)明的某對(duì)引物和DNA聚合酶作用于所得DNA樣本的一部分，在特定條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR可以擴(kuò)增樣品DNA的特定基因區(qū)域。所獲PCR混合物經(jīng)過例如電泳，根據(jù)大小分離擴(kuò)增的DNA，最后確定是否存在DNA擴(kuò)增產(chǎn)物。
以這種方式，本發(fā)明方法通過核查是否含有預(yù)期大小的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物能夠判斷樣品中是否含有嗜酸菌。而且DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列可以被測(cè)定，并通過與特定嗜酸菌基因區(qū)域的核苷酸序列進(jìn)行比較，能進(jìn)行更可靠的檢測(cè)和鑒定。
PCR反應(yīng)可以通過傳統(tǒng)方法進(jìn)行(例如，見Science，230，1350(1985))。
被擴(kuò)增的DNA片段可以通過傳統(tǒng)方法如凝膠電泳進(jìn)行分離和純化。
本發(fā)明引物及被分離和純化DNA片段的核苷酸序列可以通過傳統(tǒng)方法測(cè)定，如雙脫氧法[Proc.Natl.Acad.Sci.，USA.，74，5463(1977)]、Maxam-Gilbert法[Methods in Enzymology，65，499(1980)]或類似方法。商品化的序列測(cè)定試劑盒可更方便地測(cè)定核苷酸的序列。
本發(fā)明的引物可用做DNA雜交方法的探針，用來鑒定嗜酸菌。DNA雜交方法例如可按如下進(jìn)行將按上述方法從樣品制備的DNA樣本吸附并固定到聚酰胺膜或類似物上，與標(biāo)有生物素或類似物的探針雜交。依該方法，如果DNA樣本與探針互補(bǔ)，就會(huì)在聚酰胺膜(或類似物)上形成雙鏈。通過測(cè)量雙鏈中標(biāo)記物的活性可以鑒定待測(cè)嗜酸菌。
附圖的簡(jiǎn)要說明
圖1是使用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)嗜酸菌鑒定時(shí)所得PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。
圖2是使用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)嗜酸菌鑒定時(shí)所得PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。
圖3是使用本發(fā)明的引物對(duì)，對(duì)嗜酸菌鑒定時(shí)所得PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果圖。
完成本發(fā)明的最好方式舉出下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳盡說明。
實(shí)施例1(1)測(cè)試細(xì)菌下面表1中所列的被保藏的細(xì)菌用作測(cè)試菌。
表1
(2)DNA溶液制備使用InstaGene DNA純化介質(zhì)(Bio-Rad)，按公司說明書操作，從每個(gè)測(cè)試菌中制備DNA溶液。具體過程是，對(duì)菌體進(jìn)行漂洗，包括用800μl無菌水懸浮接種環(huán)細(xì)胞，離心懸浮液(10000G，10分鐘)，去上清，分離沉淀物(細(xì)胞)。重復(fù)一次此漂洗過程。把InstaGene DNA純化介質(zhì)(200μl)加到所獲的沉淀物(細(xì)胞)中，隨后在56℃孵育30分鐘。然后，細(xì)胞經(jīng)攪拌(使用旋渦器)和煮沸(8分鐘)溶解，最后獲取DNA溶液。
(3)本發(fā)明引物的設(shè)計(jì)與合成表2所示的本發(fā)明引物是根據(jù)如下三種嗜酸菌的16s核糖體RNA基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)和合成的酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)的16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X60742，(EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫))[Int.J.Syst.Bacteriol.，42(2)，263-269(1992)]，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的16s核糖體RNA基因(參見Hokkaido大學(xué)助研Yamazaki的博士論文)，和環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)的16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)為X51928(EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫))[Curr.Microbiol.，21，325-327(1990)]。用自動(dòng)DNA合成儀(Perkin-Elmer)進(jìn)行引物合成。
表2
(4)通過PCR鑒定嗜酸菌(4-1)PCR混合物的制備根據(jù)表3所示配方，在0.2ml試管(TAKARA SHUZO公司)中加入試劑和由(2)制備的各DNA溶液，制成PCR混合物。本操作須在冰塊上進(jìn)行。
表3
(4-2)PCR把含有由(4-1)制備的混合物的每個(gè)試管放入熱循環(huán)儀中進(jìn)行熱激(TakaRa PCR熱循環(huán)儀MP，TAKARA SHUZO公司產(chǎn)品)，然后，在如表4所示的溫度條件下進(jìn)行PCR。具體步驟是，在94℃下進(jìn)行4分鐘的熱變性后，完成如下的循環(huán)29次94℃熱變性30秒，60℃退火/復(fù)性30秒，72℃延長反應(yīng)1分鐘。最后，在94℃下經(jīng)30秒熱變性，60℃下30秒退火/復(fù)性，72℃下5分鐘的延長反應(yīng)完成PCR。
表4
實(shí)驗(yàn)使用的引物對(duì)為(A)由引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2組成；(B)由引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO2組成；(C)由引物SEQ IDNO4和SEQ ID NO5組成；(D)由引物SEQ ID NO6和SEQ ID NO7組成；(E)由引物SEQ ID NO6和SEQ ID NO8組成。第一個(gè)實(shí)驗(yàn)使用引物對(duì)(A)、(C)和(D)，第二個(gè)實(shí)驗(yàn)使用引物對(duì)(B)、(C)和(E)完成。
(4-3)電泳完成PCR擴(kuò)增后，在25μl的反應(yīng)混合物中加入5μl 6×上樣緩沖液(TAKARA SHUZO CO.，LTD)，混勻后取6μl所得混合物在1.5％瓊脂糖凝膠(瓊脂糖L03，TAKARA SHUZO CO.，LTD.的產(chǎn)品，1×TBE緩沖液)上進(jìn)行電泳(電泳設(shè)備Mupid，Cosmo Bio Co.)(4-4)觀察完成電泳之后，將凝膠在含1μg/ml溴乙錠的溶液中染色20分鐘，然后用水浸洗10分鐘。在紫外線(微型透照器，Bio-Rad)下觀察電泳圖并用Polaroid相機(jī)進(jìn)行拍照。
(4-5)結(jié)果圖1和2為該電泳結(jié)果(照片)。
圖1為第一個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(使用引物對(duì)(A)，(C)，(D))。圖2為第二個(gè)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(使用引物對(duì)(B)，(C)，(E))。圖1和2的各泳道的具體說明如下。
圖1泳道 M 標(biāo)準(zhǔn)分子量泳道 1 酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)泳道 2 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidoterrestris)泳道 3 環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Cycloheptanicus)泳道 4 芽孢桿菌屬模式種(B.subtilis)泳道 5 凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)
泳道 6 嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)泳道 7 生孢梭菌(Cl.Sporogenes)圖2泳道 M 標(biāo)準(zhǔn)分子量泳道 1 環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Cycloheptanicus)泳道 2 酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidoterrestris)泳道 3 酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)泳道 4 芽孢桿菌屬模式種(B.subtilis)泳道 5 凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)泳道 6 嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)泳道 7 生孢梭菌(Cl.Sporogenes)根據(jù)照片所示結(jié)果，可以分析各引物對(duì)和各測(cè)試菌之間的關(guān)系(+檢測(cè)到的；-未檢測(cè)到的)。表5為實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
表5
以上圖1、圖2和表5所示結(jié)果表明當(dāng)測(cè)試菌為以下三種菌，酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)時(shí)，通過使用本發(fā)明的引物對(duì)可分別形成450bp，430bp和400bp的PCR靶產(chǎn)物。另外可以確定，當(dāng)測(cè)試菌為其他類似種類時(shí)沒有PCR產(chǎn)物形成。
這說明使用本發(fā)明的一種引物對(duì)便能可靠地檢測(cè)和鑒定這三種嗜酸菌中的任意一種。
以上測(cè)試是在相同PCR條件下進(jìn)行的。因此，當(dāng)以上三種分別針對(duì)三種嗜酸菌的引物對(duì)結(jié)合使用時(shí)，通過一次PCR即可同時(shí)檢測(cè)和鑒定以上三種嗜酸菌。由此，本方法能簡(jiǎn)單、快速、特異性地檢測(cè)出可能存在于樣品中的有害嗜酸菌。從而判斷出樣品是否被嗜酸菌污染。
實(shí)施例2(1)測(cè)試菌表1所列的被保藏細(xì)菌用作測(cè)試菌。
(2)DNA溶液制備按實(shí)施例1(2)中同樣的方式制備DNA溶液。
(3)本發(fā)明引物的設(shè)計(jì)與合成表6所列引物的設(shè)計(jì)與合成分別根據(jù)以下三種嗜酸菌的16s核糖體RNA基因核苷酸序列酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)的16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)X60742，(EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫))[Int.J.Syst.Bacteriol.，42(2)，263-269(1992)]，酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)的16s核糖體RNA基因(參見Hokkaido大學(xué)助研Yamazaki的博士論文)，和環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)的16s核糖體RNA基因(登錄號(hào)為X51928(EMBL/GenBank數(shù)據(jù)庫))[Curr.Microbiol.，21，325-327(1990)]。用自動(dòng)DNA合成儀(Perkin-Elmer)合成引物。
表6
(1)通過PCR鑒定嗜酸菌(4-1)PCR混合物制備根據(jù)表3配方，把試劑和在(2)中制備的DNA溶液放入0.2ml試管(TAKARA SHUZO公司)中制成PCR混合物。以上操作于冰塊上進(jìn)行。
(4-2)PCR把裝有如上(4-1)混合物的試管放到熱循環(huán)儀(TaKaRa PCR熱循環(huán)儀MP，TAKARA SHUZO CO.，LTD.產(chǎn)品)中進(jìn)行熱激。然后在表4所列的溫度條件下進(jìn)行PCR。
使用的引物對(duì)為(F)由引物SEQ ID NO9和引物SEQ ID NO10組成；(G)由引物SEQ ID NO11和引物SEQ ID NO12組成；(H)由引物SEQ ID NO13和引物SEQ ID NO14組成。
(4-3)電泳觀察完成PCR擴(kuò)增后，在25μl的反應(yīng)混合物中加入5μl 6×上樣緩沖液(TAKARA SHUZO CO.，LTD)，混勻后取6μl在1.5％瓊脂糖凝膠(瓊脂糖LO3，TAKARA SHUZO CO.，LTD.產(chǎn)品，1×TBE緩沖液)上進(jìn)行電泳(電泳設(shè)備Mupid，Cosmo Bio Co.)電泳之后，將凝膠在含1μg/ml溴乙錠的溶液中染色20分鐘，然后用水浸洗10分鐘。在紫外線(微型透照器，Bio-Rad)下觀察凝膠遷移圖并用Polaroid相機(jī)拍照。
(1)結(jié)果圖3所示為該電泳結(jié)果(照片)。
在圖3中，從左到右所示為使用引物對(duì)(F)，(G)和(H)的結(jié)果。各泳道的含義同圖1.。
根據(jù)照片所示結(jié)果，可分析使用每對(duì)引物對(duì)和檢測(cè)每種測(cè)試菌間的關(guān)系(+檢測(cè)到；-未檢測(cè)到)。表7示該結(jié)果。
表7
圖3和表7的結(jié)果表明當(dāng)測(cè)試菌為以下三種，也就是酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)、環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)時(shí)，使用本發(fā)明的引物對(duì)可以分別擴(kuò)增出450bp、430bp和400bp的PCR靶產(chǎn)物。另一方面還證實(shí)，若測(cè)試菌為其它類似菌，則不會(huì)有PCR產(chǎn)物出現(xiàn)。這表明使用本發(fā)明的引物對(duì)能對(duì)以上三種嗜酸菌進(jìn)行可靠的檢測(cè)和鑒定。
在可能被嗜酸菌污染的飲料等樣品中，使用一次PCR反應(yīng)進(jìn)行上述檢測(cè)，就可同時(shí)對(duì)以上三種嗜酸菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。例如，將對(duì)三種嗜酸菌之一特異的本發(fā)明的引物對(duì)分別加入多孔板的孔中，對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。因此本發(fā)明能夠簡(jiǎn)單、快速地檢測(cè)出樣品中嗜酸菌的污染。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供嗜酸菌特異性的引物。使用本發(fā)明的這些引物，能夠?qū)︼嬃系阮愃飘a(chǎn)品中嗜酸菌的污染進(jìn)行特異、簡(jiǎn)單、快速檢測(cè)。
序列表<110>大塚制藥株式會(huì)社(Otsuka Pharmaceutical Co.，Ltd.)<120>環(huán)庚基脂環(huán)酸菌的核酸引物及鑒定環(huán)庚基脂環(huán)酸菌的方法(Primer ofAlicyclobacillus cycloheptanicus and method for detection of the microorganism)<130>SPI042313-47<150>JP 2000-70284<151>2000-03-14<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)的引物<400>1ctaatgccgg atacgcccgc 20<210>2<211>21<212>DNA
<213>人工序列<223>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)的引物<400>2 ctttcactccagacttgctc g 20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)的引物<400>3ctgatgccgg atacgcccgc 20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidoterrestris)的引物<400>4acgggtaggc atctacttgt g 21<210>5
<211>23<212>DNA<213>人工序列<223>酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidoterrestris)的引物<400>5tggactttca cttcagactt aca 23<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Cycloheptanicus)的引物<400>6cgctgggaaa ggtgcaaatg ca 22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<223>環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.CyclohePtanicus)的引物<400>7ggactttcac cccggacaca cg 22
<210>8<211>21<212>DNA<213>人工序列<223>環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.CyclohePtanicus)的引物<400>8ggactttcac ttcgacacac g 21<210>9<211>13<212>DNA<213>人工序列<223>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)的引物<400>9cggatacgcc cgc 13<210>10<211>15<212>DNA<213>人工序列<223>酸熱脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidocaldarius)的引物
<400>10ctccagactt gctcg 15<210>11<211>17<212>DNA<213>人工序列<223>酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidoterrestris)的引物<400>11gtaggcatct acttgtg 17<210>12<211>20<212>DNA<213>人工序列<223>酸土脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Acidoterrestris)的引物<400>12actttcactt cagacttaca 20<210>13<211>17<212>DNA
<213>人工序列<223>環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Cycloheptanicus)的引物<400>13ggaaaggtgc aaatgca 17<210>14<211>13<212>DNA<213>人工序列<223>環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(A.Cycloheptanicus)的引物<400>14ccccggacac acg 13
權(quán)利要求
1.一種核酸引物，其包含由SEQ ID NOS6-8和13-14中任一個(gè)所示的核苷酸序列。
2.一種核酸引物，其包含由SEQ ID NO6所示的核苷酸序列。
3.一種核酸引物，其包含由SEQ ID NO7所示的核苷酸序列。
4.一種核酸引物，其包含由SEQ ID NO8所示的核苷酸序列。
5.一種核酸引物，其包含由SEQ ID NO13所示的核苷酸序列。
6.一種核酸引物，其包含由SEQ ID NO14所示的核苷酸序列。
7.一種用于鑒定環(huán)庚基脂環(huán)酸菌(Alicyclobacillus cycloheptanicus)的引物對(duì)，其是下面任意一個(gè)引物對(duì)(1)包含由SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO7所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)；(2)包含由SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO8所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)；(3)包含由SEQ ID NO13所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO14所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求
7的引物對(duì)，其是包含由SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO7所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)。
9.根據(jù)權(quán)利要求
7的引物對(duì)，其是包含由SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO8所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求
7的引物對(duì)，其是包含由SEQ ID NO13所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO14所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)。
11.鑒定樣品中環(huán)庚基脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacilluscycloheptanicus)的方法，包括采用選自下組中的至少一個(gè)引物對(duì)進(jìn)行PCR(1)包含由SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQID NO7所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)；(2)包含由SEQ ID NO6所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO8所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)；以及(3)包含由SEQ ID NO13所示核苷酸序列的核酸引物和包含由SEQ ID NO14所示核苷酸序列的核酸引物的引物對(duì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求
11的方法，其中所述樣品為飲料。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)和鑒定飲料等類似產(chǎn)品中有害嗜酸菌的技術(shù)。本方法包括使用包含SEQ ID NOS6－8和13－14之一所示核苷酸序列的特異性的核酸引物對(duì)，通過PCR擴(kuò)增，對(duì)樣品中環(huán)庚基脂環(huán)酸菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GKCN1576375SQ200410062921
公開日2005年2月9日 申請(qǐng)日期2001年2月23日
發(fā)明者高市昌久, 岡本俊彥, 渡邊義也, 半谷泉 申請(qǐng)人:大塚制藥株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan