專利名稱:花生四烯酸高產(chǎn)菌種分離篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物篩選技術(shù)，具體涉及合成花生四烯酸油脂的微生物分離篩選方法。
背景技術(shù)：
花生四烯酸和亞油酸、亞麻酸作為人體必需的3種脂肪酸具有多種生理功能?；ㄉ南┧嶂饕嬖谟谄鞴偌∪夂脱航M織中、與磷脂結(jié)合成結(jié)構(gòu)脂類，對人體起著重要作用?；ㄉ南┧崾窃S多二十碳烯酸衍生物的直接前體，包括前列腺素E2(PGE2)、前列環(huán)素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)、白細(xì)胞三烯B4(LTB4)和C4(LTC4)等等。這些生物活性物質(zhì)對脂蛋白的代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用?；ㄉ南┧徇€具有酯化膽固醇，抑制血小板聚集、增加血管彈性、降低血液粘度、調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。
花生四烯酸是母乳中的天然成分，是嬰兒大腦和視網(wǎng)膜的重要組成成分，對嬰兒發(fā)育非常重要?；ㄉ南┧嵩趹言械淖詈笕拢@種脂肪酸會沉積在胎兒的腦和視網(wǎng)膜上，而且其在腦和眼中的相對含量在出生后的幾個月里還會繼續(xù)增加，所以對處于視力發(fā)育和神經(jīng)發(fā)育的嬰兒格外重要。已有大量研究報告表明花生四烯酸有利于嬰兒的生長，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，視網(wǎng)膜的發(fā)育，智力和認(rèn)知能力的發(fā)育，脈管系統(tǒng)發(fā)育和免疫系統(tǒng)發(fā)育。用補(bǔ)充了DHA和花生四烯酸的奶粉喂養(yǎng)的嬰兒與用普通奶粉喂養(yǎng)的嬰兒相比，都表現(xiàn)出更好的視力準(zhǔn)確性，在解決問題的測試中表現(xiàn)更好，在神經(jīng)發(fā)育測試中的得分更高。
在植物油中，絕大多數(shù)都不含花生四烯酸，雖然花生四烯酸廣泛存在于動物體內(nèi)，但來源于動物組織的花生四烯酸無論是在產(chǎn)量上還是在成本上都無法滿足市場的需求。人們長期以來渴望獲得大量成本低、花生四烯酸含量高的產(chǎn)品。
采用發(fā)酵法由微生物來生產(chǎn)花生四烯酸是一種替代性來源，已發(fā)現(xiàn)許多微生物都能合成花生四烯酸，其中以高山被孢霉(Mortierella alpina)最具應(yīng)用前景。高山被孢霉是一種絲狀真菌，它在以碳水化合物為碳源的培養(yǎng)基中生長時，菌體內(nèi)會積累較多的油脂，其油脂的脂肪酸組成中含有豐富的多不飽和脂肪酸，尤其是花生四烯酸含量較高，被認(rèn)為是最好的生產(chǎn)花生四烯酸油脂的菌種，并且荷蘭、英國和美國FDA先后通過了野生被孢霉及其產(chǎn)物食用安全的認(rèn)證。
紅四氮唑是一種氧化劑，是脫氫酶的輔酶。紅四氮唑被活細(xì)胞吸收，與脫氫酶釋放的氫原子作用而被還原。我們發(fā)現(xiàn)菌體的紅四氮唑染色程度與花生四烯酸含量具有正相關(guān)性，花生四烯酸含量高的菌株紅四氮唑染色程度深。
對于花生四烯酸的生產(chǎn)，一株好的產(chǎn)生菌是至關(guān)重要的。它不僅能夠利用廉價的培養(yǎng)基，獲得高的產(chǎn)量，而且產(chǎn)物中花生四烯酸含量要高，因為這將簡化后處理中的分離純化過程。傳統(tǒng)的花生四烯酸產(chǎn)生菌的篩選方法包括利用低溫、阿司匹林選擇性培養(yǎng)基來篩選，但無論采用哪種篩選方法，在分離獲得大量菌株后都需要進(jìn)行花生四烯酸含量的測定以尋找其中的高產(chǎn)菌株，這是一個非常耗時的工作，包括菌體干燥、油脂提取和氣相色譜分析等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種花生四烯酸高產(chǎn)菌種分離篩選方法，該方法可以快速高效地篩選出花生四烯酸高產(chǎn)菌種。
本發(fā)明提供的一種花生四烯酸高產(chǎn)菌種分離篩選方法，其步驟為(1)土壤菌種的低溫分離和純化將所采土樣通過無菌水稀釋進(jìn)行平板分離，在0℃-10℃培養(yǎng)，待長出霉菌菌落，挑出單菌落，分離純化后保存；(2)花生四烯酸高產(chǎn)菌篩選(2.1)初篩將低溫分離的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)5-12天，收獲濕菌體，洗滌后將菌體置于容器中，每0.1g菌種加入2ml或4ml pH7.0-9.0的0.2％-0.8％的紅四氮唑溶液，25℃或室溫暗處放置0.5-4小時，菌體洗滌后碾磨成勻漿，從勻漿中提取三苯基甲臜，上清液在485nm波長下比色測定吸收值確定染色程度；(2.2)復(fù)篩選取紅四氮唑染色程度深的霉菌，對菌體進(jìn)行干燥，提取菌體油脂進(jìn)行氣相色譜分析，獲得花生四烯酸含量高的菌種。
由于低溫下可以分離到被孢霉屬被孢霉亞屬真菌，而被孢霉亞屬真菌可以合成花生四烯酸，而且菌體中的花生四烯酸含量與紅四氮唑染色具有正相關(guān)性，因此本發(fā)明采用低溫篩選與紅四氮唑染色相結(jié)合的方法可以快速高效地篩選花生四烯酸高產(chǎn)菌。本申請人利用本發(fā)明所提出的篩選方法，獲得了一株花生四烯酸高產(chǎn)菌株高山被孢霉Mortierella alpina M0223，其中花生四烯酸殘基含量最高達(dá)到了72.8％。(本申請人已于2003年3月10日在中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會保藏花生四烯酸高產(chǎn)菌株高山被孢霉，保藏編號為CGMCC No.0903)。
具體實施方式
下述結(jié)合實例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
實施例1(1)利用低溫篩選花生四烯酸產(chǎn)生菌取華中科技大學(xué)校園內(nèi)各處土壤，混合。所采土樣通過無菌水稀釋，取10-2、10-3兩個稀釋度各涂6個平板，平板培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基(PDA，20％土豆汁，2％葡萄糖，2％瓊脂，pH自然)。將平板放置于4℃低溫下培養(yǎng)，獲得72株霉菌菌株。這些霉菌都具有極為相似的菌落形態(tài)，菌落表面顏色為白色，背面顏色黃色，孢子顏色白或黃。菌落初長出時很薄，圓形，然后一層層擴(kuò)展，形成花瓣狀(有的為玫瑰花瓣狀，有的如菊花狀)，并長出長長的毛狀菌絲。顯微鏡下觀察，菌絲體內(nèi)有較多的油脂顆粒。所有這些霉菌都可以在4℃低溫和25℃溫度下生長，在25℃溫度下生長較快。
選取了其中幾株生長較快的菌種，進(jìn)行液體培養(yǎng)10天，收獲菌體，提取油脂，進(jìn)行菌體油脂的脂肪酸分析。結(jié)果見表1。
表1 低溫篩選的幾株菌種及其油脂中的花生四烯酸含量




(2)利用菌體的紅四氮唑染色程度與菌體中花生四烯酸含量具有正相關(guān)性進(jìn)行初篩將低溫分離的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)7天，收獲濕菌體，用蒸餾水洗滌兩遍，取0.1g菌體置于有蓋試管，加入2mlpH8.5的0.2％的紅四氮唑(Triphenyltetrazolium chloride)溶液，25℃置于暗處放置1小時。菌體用蒸餾水洗滌兩遍后碾磨成勻漿，用2ml乙酸乙酯室溫抽提紅色的三苯基甲臜(triphenylformazan)三遍，合并抽提液，在485nm波長下用分光光度計比色測定吸收值確定染色程度。結(jié)果見表2，顯示菌體的紅四氮唑染色程度與菌體油脂中的花生四烯酸含量具有正相關(guān)關(guān)系。
將低溫篩選的各菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)10天，將菌絲進(jìn)行紅四氮唑染色并定量染色程度，選取其中染色較深的24株菌株(結(jié)果見表3)進(jìn)行下一步復(fù)篩。
表2不同菌株菌體的紅四氮唑染色程度與油脂中的花生四烯酸含量關(guān)系


(3)利用氣相色譜分析方法進(jìn)行復(fù)篩將染色較深的24株菌株(結(jié)果見表3)進(jìn)行菌體干燥，提取菌體油脂，并進(jìn)行氣相色譜分析，考查各菌株的生長、產(chǎn)油及花生四烯酸生產(chǎn)能力。從該表可以看出油脂中的花生四烯酸與菌體染色程度具有正相關(guān)性，利用紅四氮唑和低溫相結(jié)合的方法能有效篩選花生四烯酸高產(chǎn)菌種。菌株M0223的油脂中花生四烯酸含量達(dá)到72.3％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到4.82g/l，表現(xiàn)出良好的花生四烯酸生產(chǎn)能力，該菌株經(jīng)過形態(tài)特征、生理特征和核糖體18S rDNA序列鑒定為高山被孢霉(Mortierella alpina)。
表3花生四烯酸高產(chǎn)菌的篩選


實施例2(1)利用低溫篩選花生四烯酸產(chǎn)生菌取武漢市區(qū)各處土壤，混合。所采土樣通過無菌水稀釋，取10-2、10-3兩個稀釋度各涂3個平板，平板培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基(硝酸鈉2g/l，磷酸氫二鉀1g/l，氯化鉀0.5g/l，硫酸鎂0.5g/l，硫酸亞鐵0.01g/l，葡萄糖30g/l，瓊脂20g/l，pH自然)。將平板放置于10℃低溫下培養(yǎng)，獲得42株霉菌菌株。這些霉菌菌落形態(tài)與實施例1相似。
(2)利用菌體的紅四氮唑染色程度與氣相色譜分析方法進(jìn)行篩選將分離到的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)5天，收獲濕菌體，洗滌兩遍，取0.1g菌體置于有蓋試管，加入4mlpH9.0的0.4％的紅四氮唑溶液，室溫下置于暗處放置4小時。菌體用蒸餾水洗滌兩遍后碾磨成勻漿，用2ml乙醇室溫抽提三遍，合并抽提液，在485nm波長下用分光光度計比色測定吸收值確定染色程度。選取其中染色較深的5株菌株進(jìn)行菌體干燥，提取菌體油脂，并進(jìn)行氣相色譜分析，考查各菌株的生長、產(chǎn)油及花生四烯酸生產(chǎn)能力，獲得一株高山被孢霉Y6，其菌體油脂中花生四烯酸含量達(dá)42.5％，花生四烯酸產(chǎn)量為3.12g/L。
實施例3(1)利用低溫篩選花生四烯酸產(chǎn)生菌取武漢市區(qū)各處土壤，混合。所采土樣通過無菌水稀釋，取10-2、10-3兩個稀釋度各涂3個平板，平板培養(yǎng)基為土豆培養(yǎng)基(PDA，20％土豆汁，2％葡萄糖，2％瓊脂，pH自然)。將平板放置于0℃低溫下培養(yǎng)，獲得10株霉菌菌株。這些霉菌菌落形態(tài)與實施例1相似。
(2)利用菌體的紅四氮唑染色程度與氣相色譜分析方法進(jìn)行篩選將分離到的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)12天，收獲濕菌體，洗滌兩遍，取0.1g菌體置于有蓋試管，加入2mlpH7.0的0.8％的紅四氮唑溶液，25℃置于暗處放置0.5小時。菌體用蒸餾水洗滌兩遍后碾磨成勻漿，用2ml丙酮室溫抽提三遍，合并抽提液，在485nm波長下用分光光度計比色測定吸收值確定染色程度。選取其中染色較深的4株菌株進(jìn)行菌體干燥，提取菌體油脂，并進(jìn)行氣相色譜分析，考查各菌株的生長、產(chǎn)油及花生四烯酸生產(chǎn)能力，獲得一株高山被孢霉M6，其菌體油脂中花生四烯酸含量達(dá)62.5％，花生四烯酸產(chǎn)量為4.12g/L。
權(quán)利要求
1.一種花生四烯酸高產(chǎn)菌種分離篩選方法，其步驟包括(1)土壤菌種的低溫分離和純化將所采土樣通過無菌水稀釋進(jìn)行平板分離，在0℃-10℃培養(yǎng)，待長出霉菌菌落，挑出單菌落，分離純化后保存；(2)花生四烯酸高產(chǎn)菌篩選(2.1)初篩將低溫分離的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)5-12天，收獲濕菌體，洗滌后將菌體置于容器中，每0.1g菌種加入2ml或4ml pH7.0-9.0的0.2％-0.8％的紅四氮唑溶液，25℃或室溫暗處放置0.5-4小時，菌體洗滌后碾磨成勻漿，從勻漿中提取三苯基甲臜，上清液在485nm波長下比色測定吸收值確定染色程度；(2.2)復(fù)篩選取紅四氮唑染色程度深的霉菌，對菌體進(jìn)行干燥，提取菌體油脂進(jìn)行氣相色譜分析，獲得花生四烯酸含量高的菌種。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種花生四烯酸高產(chǎn)菌種分離篩選方法，其步驟為(1)產(chǎn)生菌的低溫分離將所采土樣通過無菌水稀釋后進(jìn)行平板分離，在0-10℃培養(yǎng)，待長出霉菌菌落，挑出單菌落，分離純化后保存；(2)高產(chǎn)菌篩選(2.1)初篩將低溫分離的單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)5-12天，收獲濕菌體，洗滌后將菌體置于容器中，加入pH7.0-9.0的0.2%-0.8%的紅四氮唑溶液，放置0.5-4小時，菌體洗滌后碾磨成勻漿，從勻漿中提取三苯基甲臜，上清液在485nm波長下比色測定吸收值確定染色程度；(2.2)復(fù)篩選取紅四氮唑染色程度深的霉菌，對菌體進(jìn)行干燥，提取菌體油脂進(jìn)行氣相色譜分析。利用該方法可以快速高效地篩選高產(chǎn)菌種，篩選出的高產(chǎn)菌株高山被孢霉菌體油脂中花生四烯酸含量達(dá)到了72.3%。
文檔編號C12N1/14GKCN1255529SQ200410060623
公開日2006年5月10日 申請日期2004年7月22日
發(fā)明者余龍江, 朱敏, 周蓬蓬 申請人:華中科技大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan