專利名稱：一種真菌的篩選方法以及采用該菌種生產(chǎn)纖維素酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌及應(yīng)用該菌種生產(chǎn)纖維素酶(包括CMC酶、濾紙酶 等)的方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱，在食品、飼料、 醫(yī)藥、紡織、洗滌劑和造紙等工業(yè)領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。自從1906年Seilliere 從蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶以來，人們對(duì)纖維素酶做了大量的研究，特別 是20世紀(jì)80年代以來，由于分子生物學(xué)的發(fā)展及生物工程技術(shù)的興起，纖 維素酶的研究出現(xiàn)了新的前景。大量的纖維素酶產(chǎn)生菌種被發(fā)現(xiàn)，包括真菌 和細(xì)菌等。
^^0^y/7/^w/" 是一種植物致病菌，能夠?qū)е绿O果等許多水果的
腐爛，也用于印染行業(yè)的污水處理，未見有生產(chǎn)纖維素酶的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容
.
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之一是公開一種真菌的篩選培養(yǎng)方法。 本發(fā)明用于生產(chǎn)纖維素酶(包括CMC酶、濾紙酶等)的微生物是一種真 菌5o^70sp/weWa fifoAWea，并按照菌種篩選分離的順序命名為萬0^Ka^/2aenb ^A/^"M12，該真菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫中均有保存。 本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題之二是公開一種以真菌5o^vo^/2^n'a ^^/nVfeaM12生產(chǎn)纖維素酶(包括CMC酶、濾紙酶等)的方法。
1. 該菌種具有如下的性質(zhì)
形態(tài)生理生化特征
形態(tài)特征絲狀真菌，'菌落呈白色，圓柱形菌絲體，不透明。 生理生化特征產(chǎn)纖維素酶。
2. 本發(fā)明提供了一種真菌的篩選培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟
將沒有完全腐爛的蘋果切成小塊置于密封容器中，于20-3(TC培養(yǎng)40-60 天，生成白色絨毛狀菌體，挑取單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上20-40。C培養(yǎng) 48-72小時(shí)并保存于4'C冰箱；斜面保存培養(yǎng)基組成為NaN03 2; K2HP04 1; KC1 0.5; MgS04 0.5; FeS04
0.01;蔗糖30;瓊脂15-20;其余為去離子水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，
用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3'C滅菌30分鐘；
將冰箱保存的菌株無菌條件下用接種環(huán)接于纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng) 基，20-4(TC培養(yǎng)48-72小時(shí)，并保存于4。C冰箱；
纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基組成為NaN03.2; K2HP041; KC10.5; MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纖維素鈉10;瓊脂15-20;其余為去離子 水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C 滅菌30分鐘； -
對(duì)該真菌提取總DNA后，使用FTGENE5D型PCR儀在ITS4-ITS5區(qū)域 PCR擴(kuò)增，進(jìn)行測(cè)序后得到如下序列
CTTCAGTTTGGTTCCTACTGATCCGAGGTCACCTTAGAAAAATAAA GTTGGGTGTCGGCTGGCGCCGGCCGGGCCTACAGAGCAGGTGACAAAG CCCCATACGCTCGAGGACCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGC
AAGCAACAAGGTACGATAGACACGGGTGGGAGGTTGGACCCAGAGGG
TACGACTTTTTACTTCCC
測(cè)序所得序列經(jīng)NCBI上BLAST (http:〃www.ncbi.nim.nih.gov)同源 性檢索和分析，得到GeneBank中與之親緣關(guān)系最近的菌種Sofo/o^/^er/a t/of/2/^a，同源性達(dá)99%;
可確定該真菌為Bo^yo^/zaeWai/oAWea,并按照菌種篩選分離的順序命 名為Bo/o^ypteen'a^^^feaM12，該真菌是已知現(xiàn)有菌種，各大菌種保藏庫 中均有保存。3.本發(fā)明利用Bo^vosp/iaer/fl必決i&a M12制備纖維素酶的方法，其步驟 順序如下
(1) 斜面培養(yǎng)將上述菌株于無菌條件下用接種環(huán)接于液體富集培養(yǎng)基 中，20-4(TC條件下，搖床振蕩培養(yǎng)48-72小時(shí)，制得種子液。其中液體富集 培養(yǎng)基包括NaN03 2; K2HP041; KC1 0. 5;蔗糖30;以上均為質(zhì)量/體積 比g/L，溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C 滅菌30分鐘；
(2) 搖瓶培養(yǎng)將種子液接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，20-4(TC有氧條件下， 搖床振蕩培養(yǎng)48-120小時(shí)，制得發(fā)酵液；其中液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為玉米 皮纖維粉20;小麥麩皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸鈣5;吐溫-80 2，以上數(shù)
據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于Mandds無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；.
(3) 粗酶液制備取步驟(2)溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液后的發(fā)酵液以 5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘收集上清液，得到粗酶液；
其中Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液的組成為KH2P04 3.0 g/L; (NH4)2S04 2.0 g/L; MnS04'H20 0.0025 g/L; CaCl20.5g/L; CoCl2 0.003 g/L; FeS04'7H20 0.0075 g/L;尿素0.5g/L; MgSO4'5H2O0.5g/L; ZnS04'7H20 0.002 g/L;其余為去離 子水。
4.酶活的測(cè)定方法
(1) 纖維素酶活(CMC酶活)測(cè)定取0.5 mL稀釋10倍的酶液，加入1.5mL 0.625。/。CMC溶液，于50。C保溫30min，加入2mL 10%的氫氧化鈉溶液終止反 應(yīng)，再加入3mLDNS試劑，于沸永中煮15min，使用UV-2000型紫外可見分 光光度計(jì)在550nm處比色。以酶液每分鐘產(chǎn)生lpmol還原糖所需的酶量為1 個(gè)酶活單位IU。
(2) 濾紙酶活力(FF'A)的測(cè)定方法取lmL稀釋10倍的酶液，加入lmg 濾紙條，再加入lmL檸檬酸緩沖溶液于55。C保溫60min再加入3mL DNS試 劑，于沸水中煮15min，使用UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)在550nm處比 色。以每分鐘酶液產(chǎn)生l^imol還原糖所需的酶量為1個(gè)酶活單位IU。
(3) 在上述方法中，DNS試劑的配制取200g酒石酸鉀鈉溶于一定量的 水中加熱溶解后添加10.0g3,5-二硝基水楊酸，10.0g氫氧化鈉溶解后加入2.0g
6苯酚，0.5g無水亞硫酸鈉，加熱溶解后冷卻至室溫，定容至1000mL。用之前 一周配制。
(4) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制用電子天平準(zhǔn)確稱取0.2750g葡萄糖，用蒸 餾水溶解定容至250mL制成1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液5、 10、 15、 20、 25mL于50mL容量瓶中，稀釋定容。取2mL配制好的溶 液以蒸餾水作空白參比，分別加入1.5mLDNS試劑在10(TC水浴鍋中加熱 15min顯色后，使用UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)在554nm處測(cè)定吸光值， 以吸光值為縱坐標(biāo)，糖濃度為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。葡萄糖 標(biāo)準(zhǔn)曲線是所有的實(shí)施例所共用的，數(shù)據(jù)和曲線相同，見圖l。
(5) 酶活的結(jié)果計(jì)算分別按照(l)、 (2)的方法進(jìn)行纖維素酶活和濾紙酶活 的測(cè)定，在550nm處測(cè)得比色值，根據(jù)曲線擬合方程y=0.7692x得到測(cè)定樣 品中的葡萄糖含量，由纖維素酶活和濾紙酶活的定義可得到最終的酶活數(shù)值。


圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
具體實(shí)施例方式
將沒有完全腐爛的蘋果切成小塊置于密封容器中，于2(TC培養(yǎng)40天，生 成白色絨毛狀菌體，挑取單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上，在THZ-C恒溫振 蕩器中2(TC培養(yǎng)72小時(shí)并保存于4"冰箱；
斜面保存培養(yǎng)基組成為NaN032; K2HP04 1; KC1 0.5; MgSO40.5; FeS04
0.01;蔗糖30;瓊脂15-20;其余為去離子水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，
用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；
將冰箱保存的菌株無菌條件下用接種環(huán)接于纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)
基，在THZ-C恒溫振蕩器中20。C培養(yǎng)72小時(shí)，并保存于4。C冰箱；
纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基組成為NaNO30.2; K2HP041; KC10.5;
MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纖維素鈉10;瓊脂15-20;其余為去離子
水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C
滅菌30分鐘；
篩選后的菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Bo^;a^/2fleWa ^^Vfe化 斜面培養(yǎng)將上述菌株于無菌條件下用接種環(huán)接于液體富集培養(yǎng)基中，2(TC條件下，在THZ-C恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，制得種子液。其中 液體富集培養(yǎng)基包括NaN032; K2HP041; KC10.5;蔗糖30;以上均為質(zhì) 量/體積比g/L，溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"滅菌30分鐘；
搖瓶培養(yǎng)將種子液接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，2(TC有氧條件下，在 THZ-C恒溫振蕩器中振蕩培養(yǎng)120小時(shí)，制得發(fā)酵液。其中液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基
組成為玉米皮纖維粉20;小麥麩皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸鈣5;吐溫
-80 2，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸 調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；
粗酶液制備取上步搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液使用 ALC PK121R型冷凍離心機(jī)以5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘收集上清液， 得到粗酶液；
酶活測(cè)定結(jié)果在該條件下獲得的酶液其纖維素酶活(CMC酶活)為2.215 IU/mL，濾紙酶活(FPA)為2.263 IU/mL。
實(shí)施例2:
將沒有完全腐爛的蘋果切成小塊置于密封容器中，在THZ-C恒溫振蕩器 中于25'C培養(yǎng)50天，生成白色絨,狀菌體，挑取單菌落保存在斜面保存培養(yǎng) 基上25T:培養(yǎng)56小時(shí)并保存于4。C冰箱；
斜面保存培養(yǎng)基組成為NaN03 2; K2HP04 1; KC1 0.5; MgS04 0.5; FeS04
0.01;蔗糖30;瓊脂15-20;其余為去離子水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，
用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2, 121.3。C滅菌30分鐘；
將冰箱保存的菌株無菌條件下用接種環(huán)接于纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)
基，在THZ-C恒溫振蕩器中25'C培養(yǎng)56小時(shí)，并保存于4。C冰箱；
纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基組成為NaNO30.2; K2HP041; KC10.5;
MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纖維素鈉10;瓊脂15-20;其余為去離子
水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C
滅菌30分鐘； '
篩選后的菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為5c^70^/2aw/ac/o決/^a，并命名為 5o吵05p/we由(ioA/cfefl Ml 2;斜面培養(yǎng)將上述菌株于無菌條件下用接種環(huán)接于液體富集培養(yǎng)基中，
在THZ-C恒溫振蕩器中25'C條件下振蕩培養(yǎng)56小時(shí)，制得種子液。其中液 體富集培養(yǎng)基包括NaN032; K2ttP04l; KC10.5;蔗糖30;以上均為質(zhì)量 /體積比g/L，溶于Mandds無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"滅菌30分鐘；
搖瓶培養(yǎng)將種子液接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在THZ-C恒溫振蕩器中 25t:有氧條件下振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，制得發(fā)酵液。其中液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為
玉米皮纖維粉20;小麥麩皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸鈣5;吐溫-80 2，以
上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至 5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；
粗酶液制備..取上步搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液溶于Mandds無機(jī)營養(yǎng)鹽液，使 用ALC PK121R型冷凍離心機(jī)50Q0-10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘收集上清液， 得到粗酶液；
酶活測(cè)定結(jié)在該條件下獲得的酶液其纖維素酶活(CMC酶活)為 3.407 IU/mL，濾紙酶活(FPA)為4.039 IU/mL。
實(shí)施例3:
將沒有完全腐爛的蘋果切成小塊置于密封容器中，在THZ-C恒溫振蕩器 中4(TC培養(yǎng)60天，生成白色絨毛狀菌體，挑取單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基 上4(TC培養(yǎng)48小時(shí)并保存于4X:冰箱；
斜面保存培養(yǎng)基組成為NaN03 2; K2HP04 1; KC1 0.5; MgS04 0.5; FeS04
0.01;蔗糖30;瓊脂15-20;其余為去離子水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，
用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；
將冰箱保存的菌株無菌條件下用接種環(huán)接于纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)
基，在THZ-C恒溫振蕩器中20。C培養(yǎng)72小時(shí)，并保存于4。C冰箱；
纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基組成為NaNO30.2; K2HP041; KC10.5;
MgSO40.5; FeS04 0.01;羧甲基纖維素鈉10;瓊脂15-20;其余為去離子
水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3°C
滅菌30分鐘；篩選后的菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為萬o^70^^aen'a Af/2zWea，并命名為 5o吵osp/wfm'fl M12;
斜面培養(yǎng)將上述菌株于無菌條件下用接種環(huán)接于液體富集培養(yǎng)基中，
在THZ-C恒溫振蕩器中2(TC條件下振蕩培養(yǎng)72小時(shí)，制得種子液。其中液 體富集培養(yǎng)基包括NaN032; K2HP041; KC10.5;蔗糖30;以上均為質(zhì)量 /體積比g/L，溶于Mandds無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"C滅菌30分鐘；
搖瓶培養(yǎng)將種子液接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，在THZ-C恒溫振蕩器中 4(TC有氧條件下，振蕩培養(yǎng)48小時(shí)，制得發(fā)酵液。其中液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成
為玉米皮纖維粉20;小麥麩皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸鈣5;吐溫-80 2，
以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于Mandds無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；
粗酶液制備取上步搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液溶于Mandds無機(jī)營養(yǎng)鹽液，使 用ALC PK121R型冷凍離心機(jī)5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘收集上清液， 得到粗酶液；
酶活測(cè)定結(jié)果在該條件下獲得的酶液其纖維素酶活(CMC酶活)為 3.166 IU/mL，濾紙酶活(FPA)為3.058 IU/mL。
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權(quán)利要求
1. 一種真菌Botryosphaeria dothidea M12的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟將沒有完全腐爛的蘋果切成小塊置于密封容器中，于20-30℃培養(yǎng)40-60天，生成白色絨毛狀菌體，挑取單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上20-40℃培養(yǎng)48-72小時(shí)并保存于4℃冰箱；斜面保存培養(yǎng)基組成為NaNO3 2；K2HPO4 1；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；蔗糖30；瓊脂15-20；其余為去離子水，以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘；將冰箱保存的菌株無菌條件下用接種環(huán)接于纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基，20-40℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，并保存于4℃冰箱；纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基組成為NaNO3 0.2；K2HPO41；KCl 0.5；MgSO4 0.5；FeSO4 0.01；羧甲基纖維素鈉10；瓊脂15-20；其余為去離子水，以上數(shù)據(jù)單位均為質(zhì)量/體積比g/L，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0；1.05kg/cm2，121.3℃滅菌30分鐘；篩選后的菌株經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為Botryosphaeria dothidea，并命名為Botryosphaeria dothidea M12。
2. —種以BWo^/ /jaen'a cfof/n'tfea M12菌為菌種生產(chǎn)纖維素酶的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)斜面培養(yǎng)將篩選后的菌株萬o^70sp/2"en'a do^/dea M12 于無菌條件下用接種環(huán)接于液體富集培養(yǎng)基中，20-40。C條件下， 搖床振蕩培養(yǎng)48-72小時(shí)，制得種子液；其中液體富集培養(yǎng)基包括NaN032; K2HP041; KC10.5; 蔗糖30;以上數(shù)據(jù)均為質(zhì)量/體積比g/L，溶于Mandels無機(jī)營 養(yǎng)鹽液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3"滅菌30分 鐘；(2) 搖瓶培養(yǎng)以上述種子液和液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基體積比為5%的接種量將種子液接種于液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，20-4(TC有氧條 件下，搖床振蕩培養(yǎng)48-120小時(shí)，制得發(fā)酵液；其中液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為玉米皮纖維粉20;小麥麩皮浸出液5;蛋白胨1;碳酸鈣5;吐溫-80 2，以上數(shù)據(jù)單位均為質(zhì)量/體積比g/L，將發(fā)酵液溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液，用鹽 酸調(diào)節(jié)pH至5.0; 1.05kg/cm2， 121.3。C滅菌30分鐘；(3) 粗酶液制備取上述溶于Mandels無機(jī)營養(yǎng)鹽液后的發(fā) 酵液以5000-10000轉(zhuǎn)/分鐘離心3-5分鐘收集上清液，得到粗酶 液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種真菌的篩選方法以及采用該菌種生產(chǎn)纖維素酶的方法。菌種培養(yǎng)方法將沒有完全腐爛的蘋果切成小塊置于密封容器中，于20-30℃培養(yǎng)40-60天，生成白色絨毛狀菌體，挑取單菌落保存在斜面保存培養(yǎng)基上20-40℃培養(yǎng)48-72小時(shí)并保存于4℃冰箱；將冰箱保存的菌株無菌條件下用接種環(huán)接于纖維素降解菌固體篩選培養(yǎng)基，20-40℃培養(yǎng)48-72小時(shí)，并保存于4℃冰箱。本發(fā)明還公開一種采用該菌種生產(chǎn)纖維素酶的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK101463384SQ20091007629
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2009年1月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月9日
發(fā)明者劉潔麗, 安明泉, 靖 王 申請(qǐng)人:中國石油大學(xué)(北京)