專利名稱:柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙高純度分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥有效成分的分離純化方法，更具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及一種高純度柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高速逆流色譜分離制備方法。
背景技術(shù)：
枳殼為蕓香科Rulaceae植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，是臨床上常用的理氣藥之一，具有理氣開胸、行滯消脹等功效。所含化學(xué)成分主要有三大類揮發(fā)油、黃酮和生物堿類，其中柚皮甙(Naringin)、柚皮蕓香甙(Narirutin)、橙皮甙(Hesperidin)和新橙皮甙(Neohesperidin)是其黃酮的主要成分，結(jié)構(gòu)如下。
柚皮甙 新橙皮甙 柚皮蕓香甙 橙皮甙現(xiàn)代藥理研究表明，枳殼黃酮具有廣泛的藥理活性，如抗氧化、抗炎、抗癌等，為了對(duì)枳殼黃酮進(jìn)行更深入的藥理活性與作用機(jī)制等研究，同時(shí)需要黃酮等指標(biāo)性成份對(duì)枳殼類藥材和相關(guān)中藥制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，這就需要大量的單體化合物。因此，如何快速、高效的從枳殼等中藥中分離純化柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙，對(duì)開發(fā)具有特殊療效的現(xiàn)代中藥制劑和充分利用我國(guó)的藥材資源等具有重要意義。
采用普通柱色譜法、重結(jié)晶和高效液相色譜法等傳統(tǒng)的分離制備方法分離植物中的有效單體，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力、污染環(huán)境[C.L Ky，M.Noirot，S.Hamon，J.Agric.Food.Chem.1997，45786；W.M.Yan，Acta BotanicaSinica，1979，2054；J.J Liu，G.L. Zhao，H.Wang，X.H.Zhang，J.Cent.South.Univ.T.2002，9246]，而且所用固定相對(duì)樣品有不可逆性吸附作用，這就需要一種新型的分離技術(shù)來(lái)解決上述問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從粗提物中分離純化高純度柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題。
本發(fā)明是從粗提物中分離純化高純度單體化合物，具體包括1.粗提物的制備粗提物可以由中藥枳殼、枳實(shí)、橙皮、青皮或飲料橙汁為原料，采用乙醇提取后萃取或過(guò)大孔吸附樹脂等方法獲得。原料粗粉用60％乙醇回流提取，減壓濃縮至無(wú)醇味后，加到1300型大孔吸附樹脂上，用水和不同濃度乙醇剃度洗脫，接收70％乙醇洗脫物，減壓濃縮后真空干燥即得粗提物。
2.粗提物的的分離純化應(yīng)用高速逆流色譜分離純化，它包括步驟(1)配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，其溶劑體系由乙酸乙酯、正丁醇、水組成，根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成份，分離得到“I”、“II”、“III”三個(gè)部分。
步驟(2)，由步驟(1)得到的分離物“I”、“II”這兩部分再以高速逆流色譜作分離純化，其溶劑體系由氯仿、脂肪醇、水組成。脂肪醇為甲醇、正丁醇，遂根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成份。
其中，乙酸乙酯、正丁醇、水體系的用量體積比為2∶1∶3，氯仿、甲醇、正丁醇、水體系的用量體積比為4∶3∶0.5-1∶2-3。
3.分離物的純度檢測(cè)與結(jié)構(gòu)鑒定采用高效液相色譜法對(duì)分得組分進(jìn)行純度檢測(cè)(峰面積歸一化法)，揮干溶劑后溶于DMSO進(jìn)行1HNMR和13CNMR分析，根據(jù)核磁數(shù)據(jù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn)。
本發(fā)明是采用高速逆流色譜儀，配以適宜的溶劑體系對(duì)粗提物進(jìn)行分離純化，由于不用固態(tài)支撐體，完全排除了支撐體對(duì)樣品組分的吸附、沾染、變性、失活等不良影響，避免了不可逆吸附所造成的溶質(zhì)色譜峰拖尾現(xiàn)象，提高了回收率；由于分配分離是在旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)中完成的，兩相溶劑都被劇烈振動(dòng)的離心力場(chǎng)依其界面特征甩成極微小的顆粒，樣品各組分會(huì)在兩相微粒的極大表面上分配，并且能在顆粒振蕩與對(duì)流的環(huán)境中有效地傳遞，所以，它就象是把通常的溶劑萃取過(guò)程成千上萬(wàn)地、高效地、自動(dòng)連續(xù)地予以完成；沒(méi)有填料在柱內(nèi)的占空體積，逆流色譜的分離柱又容易做得容積大些，柱內(nèi)空間全部是有效空間，所以，它的樣品負(fù)載能力很強(qiáng)，制備量較大，而且重現(xiàn)性很好；由于不用填料，分離過(guò)程不是淋洗或洗脫過(guò)程，而是對(duì)流穿透過(guò)程，所以，能節(jié)省昂貴的材料消耗和溶劑消耗，運(yùn)行使用的后續(xù)投入較低，而它對(duì)于樣品預(yù)處理?xiàng)l件的放松以及它的回收率高、制備量大的優(yōu)點(diǎn)，作為特定部位的特定組分的分離純化與制備則是十分可取的?？朔藗鹘y(tǒng)制備方法操作繁瑣、分離周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)，并具有制備量大、分離效率高、產(chǎn)品純度好、簡(jiǎn)便易行等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣使用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。



圖1為枳殼粗提物半制備型高速逆流色譜(HSCCC)的色譜圖圖2為分離圖1中“I”部分的高速逆流色譜(HSCCC)的色譜圖圖3為分離圖1中“II”部分的高速逆流色譜(HSCCC)的色譜圖圖4為枳殼粗提物及各分離部分的高效液相色譜(HPLC)的色譜圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例11.稱取200g枳殼生藥，磨成粗粉，置2000ml圓底燒瓶中，加入60％乙醇1600ml，回流提取2次，每次1.5h，過(guò)濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮去乙醇(溫度60℃)，得水混懸物。
2.取500g 905型大孔吸附樹脂，用95％的藥用乙醇浸泡，使其充分溶漲后再換液數(shù)次直到取1ml乙醇浸泡液加5ml水不顯白色渾濁為止。再將此樹脂裝柱(6.0×70cm)，用蒸餾水沖洗樹脂直到無(wú)醇味。
3.將枳殼提取得到的水混懸物加到預(yù)處理好的層析柱上，吸附一段時(shí)間后，依次用水、20％乙醇、70％乙醇洗脫，接收70％乙醇洗脫物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮成浸膏，濃縮溫度60℃，再減壓干燥，干燥溫度60℃，得到粗提物20.6g，提取率10.3％。
4.應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)分離純化枳殼粗提物。
a溶劑體系及用量體積比為乙酸乙酯∶正丁醇∶水＝2∶1∶3，逆流色譜柱體積為300ml，上樣量500mg，轉(zhuǎn)速800rpm，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率45％，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，在此情況下記錄的色譜圖見圖1。
具體的操作步驟是按上述溶劑體積比配制溶劑體系，在分液漏斗中充分振搖后靜止分層，分取上下相，上相為固定相，下相為流動(dòng)相。先使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機(jī)轉(zhuǎn)動(dòng)，再泵入流動(dòng)相，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)器譜圖接收目標(biāo)成份，結(jié)果分離得到三個(gè)部分。
高效液相色譜分析表明“I”部分為一未知成份與橙皮甙的混合物，“II”部分為柚皮蕓香甙和新橙皮甙的混合物，“III”部分為柚皮甙，峰純度大于99％。
b將a分離得到的“I”部分應(yīng)用高速逆流色譜儀再次分離純化。
柱體積300ml，轉(zhuǎn)速800rpm，所用溶劑體系為氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶1∶3，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，操作同a，固定相保留率為50％，分離見圖2，其中1號(hào)峰為橙皮甙，2號(hào)峰為未知成份。
c將a分離得到的“II”部分應(yīng)用高速逆流色譜儀再次分離純化。
柱體積300ml，轉(zhuǎn)速800rpm，溶劑體系為氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.5∶2，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，操作方法同a，固定相保留率為75％，分離見圖3，其中3號(hào)峰為新橙皮甙，4號(hào)峰為柚皮蕓香甙。
對(duì)分離得到的1、3、4號(hào)峰再進(jìn)行峰純度檢測(cè)，
按上述條件得到的柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的純度用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果都高達(dá)99％以上(峰面積歸一化法)。
HPLC分析條件色譜柱Lichrospher C18(6.0×150mm i.d.5μm)，流動(dòng)相為CH3CN∶H20∶HAC＝20∶80∶1，流速0.8ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)280nm，在此條件下枳殼粗提物及各分離部分的色譜圖見圖4，其中①為枳殼粗提物色譜圖，②為“I”部分色譜圖，③為“II”部分色譜圖，④為“III”部分即柚皮甙的色譜圖，⑤為橙皮甙的色譜圖，⑥為柚皮蕓香甙的色譜圖，⑦為新橙皮甙的色譜圖。
結(jié)構(gòu)鑒定對(duì)分離得到的柚皮蕓香甙、柚皮甙、橙皮甙和新橙皮甙在Varian INOVA-400型核磁共振儀上，以DMSO為溶劑進(jìn)行1HNMR和13CNMR分析，核磁數(shù)據(jù)如下。
柚皮蕓香甙1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.06(1H，s，5-OH)，9.64(1H，s，4′-OH)，7.36(2H，d，J＝9.1Hz，H-2′，6′)，6.74(1H，d，J＝1.8Hz，H-3′，5′)，6.14(1H，d，J＝2.2Hz，H-8)，6.07(1H，d，J＝1.8Hz，H-6)，5.49(1H，m，H-2)，3.05(1H，m，H-3).13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)δC2-C10147.88，135.45，177.56，161.31，98.81，164.24，93.76，156.94，104.28；C1″-C6′121.58，129.4，115.47，159.36，115.53，129.55；C1″-C6″98.42，77.28，77.15，70.14，76.77，60.90；C1-C6:100.47，70.32，70.68，72.01，68.14，17.68.
柚皮甙1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.01(1H，s，5-OH)，9.59(1H，s，4′-OH)，7.32(2H，d，J＝9.0Hz，H-2′，6′)，6.78(2H，d，J＝2.0Hz，H-3′，5′)，6.11(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)，6.07(1H，d，J＝2.0Hz，H-6)，5.32(1H，d，J＝6.0Hz，H-1″)，5.15(1H，d，J＝2.0Hz，H-1)，3.13(1H，m，H-3)，2.78(1H，m，H-6).13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)δC2-C10(79.01，42.12，197.29，163.21，96.51，164.79，95.22，163.13，103.51)，128.81(C-1′)，115.54(C-3′)，157.93(C-4′)，115.44(C-5′)，128.62(C-2′，6′)，97.78(C-1″)，77.34(C-2″)，77.03(C-3″)，69.79(C-4″)，76.54(C-5″)，60.72(C-6″)，100.54(C-1)，70.61(C-2)，70.69(C-3)，71.91(C-4)，68.38(C-5)，18.09(C-6).
橙皮甙1用NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.02(1H，s，5-OH)，9.12(1H，s，3′-OH)，6.91(3H，m，H-2′，5′，6′)，6.13(1H，H-8)，5.47(1H，m，H-2)，3.15(2H，dd，H-3)，6.11(1H，H-6)，4.97(1H，d，J＝6.8Hz，H-1″)，4.51(1H，H-1)，1.11(3H，d，J＝6.2Hz，CH3).13C-NMR(400Mz，DMSO-d6)δ196.81(C-4)，164.80(C-7)，162.89(C-5)，162.18(C-9)，147.80(C-4′)，146.27(C-3′)，130.78(C-1′)，117.88(C-6′)，114.05(C-2′)，111.20(C-5′)，103.24(C-10)，96.31(C-6)，95.50(C-8)，78.34(C-2)，42.07(C-3)，55.68(C-4)，99.30(C-1″)，76.20(C-3″)，75.48(C-5″)，73.01(C-2″)，69.56(C-4″)，66.10(C-6″)，100.56(C-1)，70.28(C-2)，70.68(C-3)，72.05(C-4)，68.32(C-5)，17.95(C-6).
新橙皮甙1HNMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.03(1H，s，OH-5)，9.13(1H，S，OH-3′)，6.95(1H，d，J＝8.1Hz，H-5′)，6.91(1H，d，J＝2.7Hz，H-2′)，6.88(1H，dd，J＝8.1，2.7Hz，H-6′)，6.12(1H，d，J＝0.9Hz，H-6)，6.10(1H，d，J＝0.9Hz，H-8)，5.49(1H，dd，J＝12.0，1.2Hz，H-2)，5.30(1H，d，J＝4.8Hz，OH)，5.12(1H，d，J＝5.1HZ，H-1″)，5.10(1H，d，J＝2.0Hz，H-1)，4.72((1H，d，J＝.2Hz，OH)，4.66(1H，d，J＝4.2Hz，OH)，4.58(1H，m，OH)，4.48(1H，d，J＝6.0Hz，OH)，3.75(3H，s，4′-OCH3)，3.68(3H，m)，3.45(4H，m)，3.16(1H，dd，J＝17.1，12.0Hz，H-3a)，3.12(1H，m)，2.74(1H，dd，＝17.1，1.2Hz，H-3β)，1.14(3H，d，J＝6.0Hz，H-6).13C-NMR(400MHz，DMSO-d6)δ196.87(C-4)，164.65(C-7)，163.01(C-5)，162.37(C-9)，147.80(C-4′)，146.31(C-3′)，130.75(C-1′)，117.70(C-6′)，113.97(C-5′)，111.90(C-2′)，103.22(C-10)，100.30(C-1″)，97.31(C-1)，96.18(C-6)，95.07(C-8)，78.35(C-2)，77.08(C-3″)，76.86(C-5″)，75.99(C-2″)，71.70(C-4)，70.39(C-3)，70.30(C-2)，69.54(C-4″)，68.25(C-5)，60.38(C-6″)，55.65(4′-OCH3)，42.17(C-3)，18.12(C-6).
實(shí)施例21.稱取200g青皮生藥，磨成粗粉，置2000ml圓底燒瓶中，加入60％乙醇1600ml，回流提取2次，每次1.5h，過(guò)濾，合并濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓揮去乙醇(溫度60℃)，得浸膏。
2.取青皮浸膏物加500ml水混懸后，用石油醚脫脂兩次，每次500ml，分取水層，再用正丁醇萃取3次，每次500ml，減壓回收正丁醇萃取液至浸膏，將所得浸膏真空干燥，得淺黃色粉末，稱重15.8g，提取率為7.9％。
3.應(yīng)用高速逆流色譜(深圳同田生化有限公司)分離純化青皮正定丁醇萃取物。
a粗提物分離所用溶劑體系及用量體積比與分離結(jié)果同“實(shí)施例1”。
b將a分離得到的“I”部分應(yīng)用高速逆流色譜儀再次分離純化，所用溶劑體系為氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶1∶2，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率為48％。
c將a分離得到的“II”部分應(yīng)用高速逆流色譜儀再次分離純化，溶劑體系為氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水＝4∶3∶0.5∶3，上相為固定相，下相為流動(dòng)相，流速2.0ml/min，固定相保留率為55％。
具體操作基本上同“實(shí)施例1”。所得流份經(jīng)液相色譜和核磁分析表明產(chǎn)物純度高于98％。
權(quán)利要求
1.一種柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高純度分離純化方法，由粗提物的制備和粗提物的分離純化兩部分組成，其特征在于粗提物的分離純化應(yīng)用高速逆流色譜，它包括步驟(1)配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)入制備好的粗提物樣品，所構(gòu)成的兩相溶劑體系由乙酸乙酯、正丁醇和水組成，它們的用量體積比為2∶1∶3，以上相為固定相，下相為流動(dòng)相，根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成份，分離得到“I”、“II”、“III”三個(gè)部分，步驟(2)由步驟(1)得到的分離物“I”、“II”這兩部分再以高速逆流色譜作分離純化，溶劑體系為氯仿、甲醇、正丁醇和水，它們的用量體積比為4∶3∶0.5-1∶2-3，根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成份。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高純度分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述的制備好的粗提物樣品以中藥枳殼、枳實(shí)、橙皮、青皮或飲料橙汁為原料制備，粗提物的制備采用乙醇提取后萃取或過(guò)大孔吸附樹脂方法獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高純度分離純化方法，其特征在于步驟(1)中所述的制備好的粗提物樣品是以枳殼為原料經(jīng)乙醇提取后過(guò)大孔吸附樹脂獲得。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高純度分離純化方法，其特征在于步驟(1)所述的溶劑體系乙酸乙酯、正丁醇、水的用量比為2∶1∶3，所述步驟(2)中，從步驟(1)得到的分離物“I”再以高速逆流色譜作分離純化，所用的溶劑體系中氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水的用量體積比為4∶3∶1∶3。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙的高純度分離純化方法，其特征在于步驟(1)所述的溶劑體系乙酸乙酯、正丁醇、水的用量比為2∶1∶3，所述步驟(2)中，從步驟(1)得到的分離物“II”再以高速逆流色譜作分離純化，所用的溶劑體系中氯仿∶甲醇∶正丁醇∶水的用量體積比為4∶3∶0.5∶2。
專利摘要
應(yīng)用高速逆流色譜分離純化高純度柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙；它包括(1)配制構(gòu)成固定相、流動(dòng)相的溶劑體系，使逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使柱子轉(zhuǎn)動(dòng)，再將流動(dòng)相泵入柱內(nèi)，由進(jìn)樣閥進(jìn)樣，根據(jù)檢測(cè)譜圖接收目標(biāo)成份。所構(gòu)成的兩相溶劑體系由乙酸乙酯、脂肪醇和水組成，(2)，由(1)得到的部分分離物再以高速逆流色譜作分離純化，溶劑體系為氯仿、脂肪醇和水。該方法適用于以各種途徑獲得的各種含柚皮甙、柚皮蕓香甙、橙皮甙和新橙皮甙中的一種或幾種成份的天然產(chǎn)物、天然產(chǎn)物的提取物為原料制備高純度單體，并且制備量大，分離效率高，簡(jiǎn)便易行，易于推廣使用。
文檔編號(hào)C07H17/07GKCN1262555SQ200410053284
公開日2006年7月5日 申請(qǐng)日期2004年7月29日
發(fā)明者范國(guó)榮, 彭金詠, 吳玉田, 洪戰(zhàn)英, 柴逸峰, 汪學(xué)昭 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan