專利名稱:一步法干粉化分子生物學(xué)試劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種在酶反應(yīng)混合物中加入真空干燥保護(hù)劑后進(jìn)行真空干燥，從而使反應(yīng)體系混合物干粉化的方法。
背景技術(shù)：
生命科學(xué)迅猛發(fā)展，其研究和成果應(yīng)用也相當(dāng)普遍。在生命科學(xué)研究領(lǐng)域，大至世界著名實(shí)驗(yàn)室，小至普通生命科學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室，都離不開有酶參與的實(shí)驗(yàn)。對(duì)酶的研究以及使用酶進(jìn)行的科學(xué)實(shí)驗(yàn)已相當(dāng)普遍，如限制性內(nèi)切酶、連接酶、與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)等的使用在普通的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已作為常規(guī)方法和試劑，消耗量極大。同時(shí)，在臨床診斷應(yīng)用中，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸診斷試劑盒在國(guó)內(nèi)外已大量應(yīng)用。據(jù)估計(jì)，PCR診斷市場(chǎng)在國(guó)內(nèi)有10億人民幣，使用的單位達(dá)數(shù)百家醫(yī)院。在現(xiàn)場(chǎng)使用方面，診斷方法的簡(jiǎn)單化和普及，使得現(xiàn)場(chǎng)使用有酶參與的診斷方法也大量出現(xiàn)。
在酶的應(yīng)用過(guò)程中，酶只能在低溫情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作、保存和運(yùn)輸。這給科研、臨床和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用帶來(lái)諸多不便，如購(gòu)置冷卻設(shè)備，增加了使用成本，特別是條件較差的地區(qū)和使用單位，在沒(méi)有冷卻的情況下，是無(wú)法完全普及使用酶反應(yīng)試劑。
此外，由于酶的使用是微量的，有時(shí)要求十分精確，如進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，而酶的保存濃度不可太低，造成了實(shí)驗(yàn)者在操作上極為不方便。而PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)生誤差最常見的原因之一是由試驗(yàn)員在將試劑盒稀釋成工作液時(shí)所造成的誤差。
其他一些生物大分子，如脫氧核苷酸、寡聚核苷酸、核苷酸探針、小牛血清等，在一些試劑盒中如以液態(tài)形式儲(chǔ)存，也會(huì)遇到必須在冷卻條件下儲(chǔ)存、運(yùn)輸?shù)葐?wèn)題，否則易于分解。
解決上述問(wèn)題的辦法之一是采用真空干燥技術(shù)，將上述試劑和生物大分子干粉化。在干粉狀態(tài)下，生物大分子由于缺少水分和必要的條件，其本身不會(huì)分解或分解量極少，其生物學(xué)活性不受影響或僅受極其微量的影響，因而，加水恢復(fù)反應(yīng)體系后，與同等的未經(jīng)干粉化的反應(yīng)體系比較，試驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有差異。同時(shí)，干粉化試劑可以在常溫下保存，便于運(yùn)輸。對(duì)使用者而言，方便操作，也降低了實(shí)驗(yàn)成本。同時(shí)還有利于降低實(shí)驗(yàn)誤差。
在生物制藥的真空干燥技術(shù)研究方面，已有較多的成果。對(duì)藥物成品的干粉化，保證主要成分的生物學(xué)活性干粉化后在常溫下長(zhǎng)期保存而不明顯改變。
而分子生物學(xué)試劑干粉化的實(shí)際應(yīng)用不多。中國(guó)專利“可常溫保存的固態(tài)全組份聚合酶鏈反應(yīng)體系”(申請(qǐng)?zhí)?6104872.7，公開號(hào)CN1165194A)涉及到二巰基蘇糖醇和牛血清白蛋白混合物對(duì)PCR反應(yīng)體系的保護(hù)作用。然而，其缺點(diǎn)是需要-10℃的冷凍。而且，此發(fā)明中所描述的PCR保護(hù)作用僅限于電泳PCR方法，而沒(méi)有證明此方法是否能夠適用于現(xiàn)代的熒光PCR方法。熒光PCR方法可以用于定量或定性檢測(cè)，而電泳PCR方法不能用于定量檢測(cè)。
中國(guó)專利“聚核苷酸組合物及其制備方法與用途”(申請(qǐng)?zhí)?9803874.1，公開號(hào)CN1294520A)公開了聚核苷酸組合物及其制備方法與用途，其中用糖醇、糖酸、和糖來(lái)維持核苷酸的空間結(jié)構(gòu)，從而提高聚核苷酸組合物的穩(wěn)定性。然而，所述的聚核苷酸組合物并不含有酶等蛋白質(zhì)類物質(zhì)，也不是為了提高PCR試劑的穩(wěn)定性。
綜上所述，本領(lǐng)域缺乏對(duì)含蛋白質(zhì)類物質(zhì)的生物制劑進(jìn)行凍干的有效而價(jià)廉的保護(hù)劑。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)新的蛋白質(zhì)類生物制劑(尤其是PCR試劑)的有效凍干保護(hù)劑和相關(guān)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種有效保護(hù)蛋白質(zhì)，從而避免凍干時(shí)蛋白活性下降的凍干保護(hù)劑。
本發(fā)明的另一目的是提供含有所述凍干保護(hù)劑的組合物以及用該凍干保護(hù)劑凍干生物制劑的方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種糖類物質(zhì)的用途，其中所述的糖類物質(zhì)選自聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其組合，所述糖類物質(zhì)被用作生物試劑制品的凍干保護(hù)劑，其中所述的生物試劑制品含有具生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。附加條件是所述的糖類物質(zhì)不是所述蛋白質(zhì)的底物。
在另一優(yōu)選例中，所述的糖類是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、或其組合。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種生物試劑制品，它含有以下成分(a)10-1000ug/ml的具生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)；(b)1-10重量％作為凍干保護(hù)劑的糖類物質(zhì)，所述的糖類物質(zhì)選自聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其組合；并且，所述蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)之重量比為0.1∶1至1-0.1。
在另一優(yōu)選例中，所述生物試劑制品是固態(tài)，其水分含量小于5wt％。
在另一優(yōu)選例中，所述生物試劑制品是液態(tài)，其水分含量為70-99.9wt％。
在另一優(yōu)選例中，所述的蛋白質(zhì)是酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的酶選自下組聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶。
在另一優(yōu)選例中，所述的糖類物質(zhì)是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖，或其組合。
在另一優(yōu)選例中，所述的糖類物質(zhì)是聚蔗糖，其分子量在20KD～800KD，較佳地為200KD～600KD，最佳為300KD～500KD。
在另一優(yōu)選例中，所述的糖類是聚蔗糖，更佳地聚蔗糖在液態(tài)反應(yīng)體系中的終濃度為0.01％～5％，較佳地為0.03％～1％，最佳為0.05％～0.3％。
在另一優(yōu)選例中，所述的生物試劑制品還含有選自下組的物質(zhì)(c)保護(hù)劑，選自選自250±50ug/ml白蛋白、10±5mM二硫蘇糖醇，(d)dNTP；(e)引物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種制備干粉化生物試劑制品的方法，包括步驟(i)混合蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)，形成液態(tài)混合物，其中所述液態(tài)混合物含有10-1000ug/ml的蛋白質(zhì)和(b)0.01-10重量％的糖類物質(zhì)，所述的糖類物質(zhì)選自聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其組合，而且所述的蛋白質(zhì)具有生物學(xué)活性；(ii)真空干燥步驟(i)的液態(tài)混合物，形成干粉化生物試劑制品。
在另一優(yōu)選例中，步驟(i)中液態(tài)混合物中，所述蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)之重量比為0.1∶1至1-0.1。



圖1HBV干粉化試劑與本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的凍干試劑的靈敏度比較。圖中，Well＝孔、type＝類型、name＝名稱、Primer/probe＝引物探針、Ct＝循環(huán)次數(shù)，StdDev Ct＝Ct的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖2HBV干粉化試劑與本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的凍干試劑的熒光值比較。橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別是相對(duì)熒光強(qiáng)度和循環(huán)次數(shù)。
圖3HCV干粉化試劑與本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的凍干試劑的靈敏度比較。Well＝孔、type＝類型、name＝名稱、Primer/probe＝引物探針、Ct＝循環(huán)次數(shù)，StdDev Ct＝Ct的標(biāo)準(zhǔn)差。
圖4HCV干粉化試劑與本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的凍干試劑的熒光值比較。橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)分別是相對(duì)熒光強(qiáng)度和循環(huán)次數(shù)。
具體實(shí)施方式
如本文所用，下列詞語(yǔ)/術(shù)語(yǔ)具有下列含義，除非另外說(shuō)明。
“生物大分子”分子量相對(duì)高的生物有機(jī)化合物，主要是指蛋白質(zhì)、核酸以及高相對(duì)分子量的碳?xì)浠衔铩?br> “蛋白質(zhì)”由一條或多條氨基酸鏈組成的復(fù)雜的大分子，在細(xì)胞中，蛋白質(zhì)完成多種生命活動(dòng)。
“酶”一種能促進(jìn)生化反應(yīng)的蛋白質(zhì)，通常能加快速反應(yīng)速度。如果沒(méi)有酶的存在生物將無(wú)法生存。
“生物學(xué)活性”生物大分子，包括蛋白質(zhì)、核酸以及高分子量的多糖類物質(zhì)，參加生命活動(dòng)的某一生命過(guò)程，具體地，它們各自參與一項(xiàng)或多項(xiàng)生化反應(yīng)。生物大分子具有一定的空間立體結(jié)構(gòu)，當(dāng)該結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞時(shí)，它可以參與并完成上述生化反應(yīng)，也即具有生物學(xué)活性，如其立體結(jié)構(gòu)破壞，則不能完成上述生化反應(yīng)，也即失活，沒(méi)有生物學(xué)活性。
“多糖”是由很多分子單糖以糖苷鍵形式結(jié)合而成的高分子碳水化合物。組成多糖的單糖可以相同，也可以不同。多糖不是一種純粹的化學(xué)物質(zhì)，而是聚合程度不同的物質(zhì)的混合物。
“糖類物質(zhì)”指醛糖、酮糖、氨基糖、糖醇、肌醇、醛糖酸、糖醛酸、糖醛二酸，或它們的混合物。糖也可以是單糖或多糖，例如二糖或多糖。合適的糖例如聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、蔗糖、海藻糖，或它們的衍生物。合適的多糖例如阿拉伯聚糖、果聚糖、巖藻聚糖、半乳聚糖、半乳糖醛酸聚糖、葡聚糖、甘露聚糖、木聚糖(例如土木香粉)、左聚糖、巖藻依聚糖、交叉菜聚糖、半乳糖卡諾糖(galactocarolose)、果膠、葡聚糖、石臍素、幾丁質(zhì)、瓊脂糖。特別有用的糖是蔗糖、葡萄糖、乳糖、海藻糖，和它們的混合物。
特別優(yōu)選的糖類物質(zhì)是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖，或其衍生物、及其組合。
“聚蔗糖”α-D-葡萄糖用C-1的半縮醛羥基與β-D-果糖C-2的半縮醛羥基脫水而組成的二糖。聚蔗糖分子中的苷鍵α-1，2苷鍵，又是β-2，1苷鍵。聚蔗糖為無(wú)色晶體，熔點(diǎn)186℃，易溶于水，在水中的比旋光度為+66.7℃。聚蔗糖水解后得到等分子的D-果糖和D-葡萄糖混合物，其比旋光度為-19.65℃，與水解前的旋光方向相反。
“真空干燥”又稱真空干燥或冷凍升華干燥，是真空技術(shù)與冷凍技術(shù)相結(jié)合的新型干燥脫水技術(shù)。它將含水物質(zhì)在低溫下凍結(jié)，然后在真空條件下通過(guò)對(duì)凍干物料加熱使冰升華，再除去物料中部分吸附水，得到干制品。如此，干制品中大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物學(xué)活性基本不變。
“保護(hù)劑”生物大分子，主要是蛋白質(zhì)，在真空干燥過(guò)程中，都會(huì)受到損傷，引起結(jié)構(gòu)改變，活性降低或喪失。在生物大分子及其反應(yīng)混合物的真空干燥工程中，一般都會(huì)加入保護(hù)劑，防止由于如蛋白質(zhì)表面的單層水分子破壞而引起蛋白質(zhì)的變性。低分子化合物如谷氨酸、天門冬氨酸、葡萄糖、肌醇、二巰基蘇糖醇、精氨酸、賴氨酸等；高分子化合物如白蛋白、明膠、蛋白胨、可溶性淀粉、糊精、藻類等均有一定的保護(hù)功能。
本發(fā)明所述的“反應(yīng)體系”，是指生物大分子發(fā)揮其功能作需要的工作環(huán)境，如水、離子濃度、pH值、溶液的緩沖能力。如PCR試劑中，除了DNA多聚酶為本發(fā)明所述的生物大分子，其活性需要加入聚蔗糖進(jìn)行保護(hù)，該酶如需要發(fā)揮其功能，除了反應(yīng)底物如DNA、RNA之外，其他需要一定濃度的多聚核苷酸引物、寡核苷酸、相應(yīng)的緩沖液、鎂離子、鉀離子，一定的酸堿環(huán)境，這些成分包括一定體積的水組成了本發(fā)明所述的反應(yīng)體系。
本發(fā)明所述的“生物學(xué)試劑”或“生物制品試劑”即指具有生物學(xué)活性的生物大分子及其反應(yīng)體系的總和。
本發(fā)明所述的干粉化試劑即指上述“生物學(xué)試劑”或“生物制品試劑”真空抽干或冷凍干燥后形成的干粉狀物。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入作為真空干燥保護(hù)劑(又稱為“干燥保護(hù)劑”)的糖類物質(zhì)(如聚蔗糖)并干燥后，具有生物學(xué)活性的生物大分子(如酶)在干粉狀態(tài)下常溫保存數(shù)月不被破壞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與冷凍保存的液態(tài)試劑相比無(wú)差異或無(wú)明顯差異。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的干粉化試劑是酶及其全組份反應(yīng)混合物，分裝到反應(yīng)容器中，譬如PCR反應(yīng)管。在使用時(shí)，加水補(bǔ)足到原有體系可恢復(fù)液態(tài)時(shí)的反應(yīng)體系。
此外，本發(fā)明所述的干粉化試劑在加入底物并加水補(bǔ)足體積后直接進(jìn)行酶反應(yīng)。
在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明干粉化試劑的制備方法包括以下步驟如下
(1)配制含蛋白質(zhì)的溶液，其內(nèi)有蛋白質(zhì)和任選的其他成分(如反應(yīng)體系的各組份)和一定濃度的真空干燥保護(hù)劑(如聚蔗糖)溶液；(2)按蛋白質(zhì)溶液和凍干保護(hù)劑溶液按一定比例混合，形成反應(yīng)混合物，然后再按一定體積分裝反應(yīng)混合物(分裝的目的在于實(shí)驗(yàn)時(shí)加入一定體積的液體底物即可進(jìn)行反應(yīng))；(4)真空抽干或冷凍干燥，制得干粉化試劑。通常，可先在-80℃左右冷凍，然后再真空抽干。當(dāng)然，也可不經(jīng)過(guò)冷凍步驟直接真空抽干；)本發(fā)明的干粉化試劑可置于室溫、或4℃、或-20℃長(zhǎng)期保存。干粉化試劑產(chǎn)品的使用者直接加入液態(tài)底物即可進(jìn)行酶促反應(yīng)。而且，干粉化的分子生物學(xué)試劑中的生物大分子的生物學(xué)活性保持不變，反應(yīng)體系中其它成份在加水補(bǔ)足體積后濃度不變，反應(yīng)體系的其它性質(zhì)如pH不變、溶液的緩沖能力不變。
作為凍干保護(hù)劑的糖類物質(zhì)的用量通常是為0.01％～5％，較佳地為0.03％～1％，最佳為0.05％～0.5％，按干燥前液態(tài)混合物的總重量計(jì)。
一種優(yōu)選的凍干保護(hù)劑是聚蔗糖，通常聚蔗糖終濃度為0.01％～3％，較佳地為0.03％～1％，最佳為0.05％～0.3％。使用時(shí)，聚蔗糖用純水配制成高濃度溶液，使用時(shí)按一定比例加入需要保護(hù)的反應(yīng)混合物中。
與常規(guī)的液體試劑盒和其他干粉化試劑盒比較，本發(fā)明具有明顯的優(yōu)點(diǎn)，主要包括(1)本發(fā)明的干粉化試劑中，已包含了除反應(yīng)底物之外的所有組分。而其他方法則不能做到這一點(diǎn)。如液體試劑將試劑組成分成若干組，單獨(dú)高濃度保存；其他干粉化試劑技術(shù)中，具有活性的生物大分子單獨(dú)高濃度保存。
(2)本發(fā)明的干粉化試劑已經(jīng)分裝到終反應(yīng)容器，譬如PCR反應(yīng)管，在實(shí)驗(yàn)前只需加入液態(tài)化的反應(yīng)底物，或再加水補(bǔ)足反應(yīng)體積即可進(jìn)行酶反應(yīng)。常規(guī)液體試劑須將分組保存的試劑組分按一定比例混合，然后再分裝，再加入底物和補(bǔ)水以組成完整的反應(yīng)體系；其他技術(shù)的干粉化試劑需要在每一反應(yīng)管中添加具有生物學(xué)活性的大分子(酶)。
(3)本發(fā)明所述的干粉化試劑在室溫(如25℃)或4℃或-20℃下可長(zhǎng)期保存，通?？杀４?-12個(gè)月，且試劑穩(wěn)定。而液態(tài)試劑則需在-20℃至-70℃條件下保存。
(4)本發(fā)明所述的干粉化試劑，不需要特殊的運(yùn)輸條件，只有在高溫時(shí)，需要冰袋。而液體試劑需要冰袋或干冰，其他方法制成的干粉化試劑需要冰袋運(yùn)輸。
(5)本發(fā)明的干粉化試劑可以大量多人份保存，使用時(shí)，加水溶解后分裝成更小體積或單人份使用。也可直接單人份保存，使用者只要加入被測(cè)樣品，即可進(jìn)行生化反應(yīng)和檢測(cè)。這樣，由于試驗(yàn)員在將試劑盒稀釋成工作液時(shí)所造成的誤差可以免除。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1干粉化的酶試劑將1μl含200U購(gòu)買的M-MLV酶按0.1∶1、1∶1、1-0.1的重量比分別添加聚蔗糖，在4℃保存72小時(shí)，然后通過(guò)測(cè)定擴(kuò)增反應(yīng)中的相對(duì)熒光強(qiáng)度來(lái)確定酶活性。對(duì)照為-20℃和4℃保存72小時(shí)的未添加聚蔗糖的M-MLV酶。
結(jié)果如下


這表明，加入聚蔗糖可極其顯著地有效延長(zhǎng)酶在常溫下保存的活性。當(dāng)制成干粉時(shí)，這種有益效果更明顯。
此外，還重復(fù)上述步驟，不同點(diǎn)在于用阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、或木糖替換聚蔗糖。結(jié)果表明，當(dāng)分別加入0.1∶1、1∶1、1-0.1的重量比的上述糖類物質(zhì)時(shí)，也可極其顯著地有效延長(zhǎng)酶在常溫下保存的活性。
實(shí)施例2干粉化RNA反轉(zhuǎn)錄(reverse transcription；RT)試劑一種RT-PCR Pre-Mix配方，其具體組成見表1。該混合物內(nèi)除了反轉(zhuǎn)錄引物和RNA外，具備進(jìn)行RT反應(yīng)所需的所有成分。制成干粉化試劑后，只需加入適量體積的樣品RNA，即可進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。
表1.用于RNA反轉(zhuǎn)錄的優(yōu)選反轉(zhuǎn)錄體系(真空干燥前)


配好上述試劑后，直接真空抽干，或先置于-80℃冷凍后再真空抽干，即可制成RT-PCR反應(yīng)干粉化試劑。
實(shí)施例3干粉化PCR試劑。
PCR配方的具體組成見表2。該P(yáng)CR體系中，除了缺少反應(yīng)底物DNA之外，其他成分俱全。當(dāng)加入底物DNA，并加水補(bǔ)足體積后，即可進(jìn)行PCR反應(yīng)。
表2.一種優(yōu)選的真空干燥前的PCR配方


配好上述試劑后，直接真空抽干，或先置于-80℃冷凍后再真空抽干，即可制成RT-PCR反應(yīng)干粉化試劑。
實(shí)施例4“一步法HBV熒光PCR的干粉”和液體試劑比較本實(shí)施例使用了一種HBV熒光PCR試劑盒，第一組試劑為原始的HBV熒光PCR試劑盒(上海申友生物工程有限公司生產(chǎn))，第二組為在HBV熒光PCR試劑盒的PCR試劑組分混合物中加入了終濃度為0.1的％聚蔗糖，第三組為在HBV熒光PCR試劑盒的PCR試劑組分混合物中加入了終濃度為0.5的％聚蔗糖。第二、三組試劑真空干燥制成干粉化試劑，并將干粉化試劑置于室溫下72小時(shí)。三組試劑進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。
對(duì)比試驗(yàn)有兩部分1、干粉化試劑的靈敏度；2、干粉化試劑的熒光信號(hào)值。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，HBV熒光試劑盒的實(shí)驗(yàn)按照其說(shuō)明書進(jìn)行，如抽提樣本DNA，PCR反應(yīng)液的配制，分裝，以及加入抽提的液態(tài)樣本DNA，加水補(bǔ)足反應(yīng)體積，最后進(jìn)行PCR反應(yīng)。干粉化試劑的實(shí)驗(yàn)與試劑盒實(shí)驗(yàn)比較，其抽提樣本DNA、加入DNA和PCR反應(yīng)步驟相同，不同的是不必配制反應(yīng)體系，直接在干粉中加入液態(tài)樣本DNA即可進(jìn)行PCR反應(yīng)，如體積不足，可加水補(bǔ)足。
結(jié)果1、靈敏度比較其結(jié)果見圖1。圖示如下hbv-a表示HBV試劑中加入了終濃度為0.1％的聚蔗糖，包括B7～B11；hbv-b表示HBV試劑中加入了終濃度為0.5％的聚蔗糖，包括C7～C11；hbv表示HBV本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的凍干試劑，包括D7～D11。
結(jié)論靈敏度沒(méi)有顯著差異。
2、熒光信號(hào)比較其結(jié)果見圖2。干粉化試劑的熒光值降低，最大值有0.1。
實(shí)施例5“一步法HCV熒光RT-PCR的干粉”和液體試劑比較本實(shí)施例使用了一種HCV熒光PCR試劑盒，第一組試劑為原始的HCV熒光RT-PCR試劑盒(上?？迫A生物工程有限公司)，第二組為在HCV熒光RT-PCR試劑盒的試劑組分混合物中加入了終濃度為0.15％的聚蔗糖，第三組為在HCV熒光PCR試劑盒的PCR試劑組分混合物中加入了終濃度為0.5％的聚蔗糖。第二、三組試劑真空干燥制成干粉化試劑，并將干粉化試劑置于室溫下72小時(shí)。三組試劑進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。
對(duì)比試驗(yàn)有兩部分1、干粉化試劑的靈敏度；2、干粉化試劑的熒光信號(hào)值。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，HCV熒光試劑盒的實(shí)驗(yàn)按照其說(shuō)明書進(jìn)行，如抽提樣本RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)液的配制，分裝，以及加入反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，加水補(bǔ)足反應(yīng)體積，最后進(jìn)行PCR反應(yīng)。干粉化試劑的實(shí)驗(yàn)與試劑盒實(shí)驗(yàn)比較，其RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄、加入cDNA和PCR反應(yīng)步驟相同，不同的是不必配制反應(yīng)體系，直接在干粉中加入cDNA即可，如體積不足，可加水補(bǔ)足。
結(jié)果1、靈敏度比較其結(jié)果見圖3。圖示如下hcv+a表示HCV試劑中加入了終濃度為0.1％的聚蔗糖，包括B2～B6；hcv+b表示HCV試劑中加入了終濃度為0.5％的聚蔗糖，包括C2～C6；hcv表示HCV本發(fā)明一個(gè)實(shí)例中的凍干試劑，包括D2～D6。
結(jié)論靈敏度沒(méi)有顯著差異。
2、熒光信號(hào)比較其結(jié)果見圖4。熒光信號(hào)，沒(méi)有顯著差異。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種糖類物質(zhì)的用途，其中所述的糖類物質(zhì)選自聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、葡糖酸、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、異抗壞血酸、抗壞血酸、內(nèi)酯、山梨糖、葡糖二酸、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其組合，其特征在于，所述糖類物質(zhì)被用作生物試劑制品的凍干保護(hù)劑，其中所述的生物試劑制品含有具生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。
2.一種生物試劑制品，其特征在于，它含有以下成分(a)10-1000ug/ml的具生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)；(b)1-10重量％作為凍干保護(hù)劑的糖類物質(zhì)，所述的糖類物質(zhì)選自聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其組合；并且，所述蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)之重量比為0.1∶1至1-0.1。
3.如權(quán)利要求
2所述的生物試劑制品，其特征在于，所述生物試劑制品是固態(tài)，其水分含量小于5wt％。
4.如權(quán)利要求
2所述的生物試劑制品，其特征在于，所述生物試劑制品是液態(tài)，其水分含量為70-99.9wt％。
5.如權(quán)利要求
2所述的生物試劑制品，其特征在于，所述的蛋白質(zhì)是酶。
6.如權(quán)利要求
5所述的生物試劑制品，其特征在于，所述的酶選自下組聚合酶、限制性內(nèi)切酶、連接酶。
7.如權(quán)利要求
2所述的生物試劑制品，其特征在于，所述的糖類物質(zhì)是聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、或其組合。
8.如權(quán)利要求
2所述的生物試劑制品，其特征在于，還含有選自下組的物質(zhì)(c)保護(hù)劑，選自選自250±50ug/ml白蛋白、10±5mM二硫蘇糖醇，(d)dNTP；(e)引物。
9.一種制備干粉化生物試劑制品的方法，其特征在于，包括步驟(i)混合蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)，形成液態(tài)混合物，其中所述液態(tài)混合物含有10-1000ug/ml的蛋白質(zhì)和(b)0.01-10重量％的糖類物質(zhì)，所述的糖類物質(zhì)選自聚蔗糖、甘油醛、阿拉伯糖、來(lái)蘇糖、戊糖、核糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、己糖、甘露糖、塔羅糖、庚糖、葡萄糖、果糖、山梨醇、乳糖、甘露醇、甲基α吡喃葡糖苷、麥芽糖、內(nèi)酯、山梨糖、赤蘚糖、蘇糖、阿拉伯糖、阿洛糖、阿卓糖、蔗糖、古羅糖、艾杜糖、塔羅糖、赤蘚酮糖、核酮糖、阿洛酮糖、塔格糖、或海藻糖、或其組合，而且所述的蛋白質(zhì)具有生物學(xué)活性；(ii)真空干燥步驟(i)的液態(tài)混合物，形成干粉化生物試劑制品。
10.如權(quán)利要求
9所述的方法，其特征在于，步驟(i)中液態(tài)混合物中，所述蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)之重量比為0.1∶1至1-0.1。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種干粉化分子試劑及其制備方法。在液體試劑中加入本發(fā)明的凍干保護(hù)劑，通過(guò)真空干燥方法，將試劑中具有生物活性的蛋白質(zhì)與其參與反應(yīng)的所有組分組成的混合物干粉化。干粉化的試劑可常溫下長(zhǎng)期保存，便于運(yùn)輸，可直接加入液態(tài)反應(yīng)底物即可進(jìn)行生化反應(yīng)，結(jié)果穩(wěn)定可靠。適用于生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)、臨床診斷和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用等。
文檔編號(hào)C12N9/98GKCN1715405SQ200410025497
公開日2006年1月4日 申請(qǐng)日期2004年6月28日
發(fā)明者曹衛(wèi) 申請(qǐng)人:曹衛(wèi)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan