一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑒定方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑒定方法，試劑盒包括三對SSR引物和標(biāo)準(zhǔn)圖譜，一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其步驟：1）DNA提?。翰杉郎y鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度；2）DNA片段擴(kuò)增：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增待測樣品基因組DNA；3）PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定：對PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，常規(guī)銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果；4）與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比。本發(fā)明可顯著提高鱖亞科重要經(jīng)濟(jì)、稀有種類間鑒定的效率和準(zhǔn)確性，有助于鱖亞科魚類遺傳資源的保護(hù)和鱖魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。
【專利說明】—種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒及鑒定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖魚種及水產(chǎn)動物天然種質(zhì)資源鑒定【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，同時還涉及一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類分子的鑒定方法。

【背景技術(shù)】
[0002]鱖亞科隸屬鱸形目，自然僅分布于東亞(俄羅斯、日本、韓國、中國和越南(紅河))?？儊喛浦?，翅嘴績(Siniperca chuatsi Basilewsky)、大眼績(Siniperca kneri Garman)和斑鱖(S iniperca scherzeri Steindachner)為我國主要養(yǎng)殖名貴魚類，它們生活習(xí)性基本相同，外形特征相似。以上三種經(jīng)濟(jì)鱖魚在育種過程中，育苗階段無法根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒別，尤其翹嘴鱖與大眼鱖即使在魚種和成魚階段，形態(tài)學(xué)手段亦不易鑒別。中國少鱗鱖(Coreoperca whiteheadi Boulenger)和波紋績(Siniperca undulate Fang&Chong)為繼亞科中珍稀種類，肉質(zhì)細(xì)嫩、味道鮮美，苗種階段均不易鑒別。
[0003]微衛(wèi)星是由2-6個核苷酸組成的具有高度變異性的簡單重復(fù)DNA序列。它分布于真核生物的整個基因組中，具有等位基因數(shù)目多、重復(fù)性好、呈共顯性遺傳等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種鑒定和基因定位等方面的研究。目前除翹嘴鱖與斑鱖外，尚缺乏采用微衛(wèi)星分子鑒定法進(jìn)行五種鱖亞科魚類鑒定的相關(guān)報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明目的是在于提供了一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，可顯著提高鱖亞科重要經(jīng)濟(jì)、稀有種類間鑒定的效率和準(zhǔn)確性，有助于鱖亞科魚類遺傳資源的保護(hù)和鱖魚養(yǎng)殖業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。運(yùn)用本試劑盒，可彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足，解決了水產(chǎn)養(yǎng)殖中三種常見養(yǎng)殖鱖類(翹嘴鱖、大眼鱖和斑鱖)苗種鑒定的難題，解決了鱖亞科珍稀種類(中國少鱗鱖和波紋鱖)種屬鑒別的問題，從而促進(jìn)鱖亞科遺傳資源的合理保護(hù)和養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。
[0005]本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類分子的鑒定方法，方法易行，操作簡便，鑒定效率高、準(zhǔn)確性好。該方法運(yùn)用微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒別鱖亞科主要養(yǎng)殖種類(翹嘴鱖、大眼鱖和斑鱖)及珍稀種類(中國少鱗鱖和波紋鱖)，以利于鱖亞科養(yǎng)殖群體的合理管理以及野生資源的保護(hù)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
[0007]—種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，它包括三對SSR引物和標(biāo)準(zhǔn)圖譜，其中用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的三對引物序列分別為:
[0008]引物I 正向序列:5’ TACATGCACACCAGTACGG3’，
[0009]引物I 反向序列:5’ ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’ ;
[0010]引物2 正向序列:5 ’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3 ’，
[0011]引物2 反向序列:5 ’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3 ’ ;
[0012]引物3 正向序列:5 ’ ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3 ’，
[0013]引物3 反向序列:5，GCATGGATGCCAGCGTGA3 ’ ;
[0014]用于鑒別五種鱖亞科魚類的標(biāo)準(zhǔn)圖譜為:
[0015]一種引物I擴(kuò)增的部分物種鱖亞科魚類的微衛(wèi)星帶譜示意圖(圖1);一種引物2擴(kuò)增的部分物種鱖亞科魚類的微衛(wèi)星帶譜示意圖(圖2)種引物3擴(kuò)增的部分物種鱖亞科魚類的微衛(wèi)星帶譜示意圖(圖3)。
[0016]一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其步驟是:
[0017]I )DNA提取:采集待測鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度；本步驟中測得DNA的A26Q/A28Q比值為1.82-1.97。
[0018]2) DNA片段擴(kuò)增:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增待測樣品基因組DNA，擴(kuò)增引物序列為:
[0019]引物I 正向序列:5’ TACATGCACACCAGTACGG3’，
[0020]引物I 反向序列:5’ ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’ ;
[0021 ]引物 2 正向序列:5，TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3，，
[0022]引物2 反向序列:5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’ ;
[0023]引物3 正向序列:5 ’ ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3 ’，
[0024]引物3 反向序列:5’ GCATGGATGCCAGCGTGA3’ ;
[0025]本步驟中測得DNA的濃度范圍為585.5-3210.4ng/y I。
[0026]本步驟中PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min，然后按以下條件進(jìn)行35個循環(huán):940C 30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸1min結(jié)束，4°C中保存。
[0027]3) PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定:對PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，常規(guī)銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果；
[0028]本步驟中PCR反應(yīng)體系為:

【權(quán)利要求】
1.一種用于五種鱖亞科魚類分子的試劑盒，它包括三對SSR引物和標(biāo)準(zhǔn)圖譜，其中用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的三對引物序列分別為: 引物 I 正向序列:5’ TACATGCACACCAGTACGG3’， 引物 I 反向序列:5’ ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’ ; 引物 2 正向序列:5’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’， 引物 2 反向序列:5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’ ; 引物 3 正向序列:5’ ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’， 引物 3 反向序列:5’ GCATGGATGCCAGCGTGA3’ ; 用于鑒別五種鱖亞科魚類的標(biāo)準(zhǔn)圖譜為: 一種引物I擴(kuò)增的部分物種鱖亞科魚類的微衛(wèi)星帶譜；一種引物2擴(kuò)增的部分物種鱖亞科魚類的微衛(wèi)星帶譜；一種引物3擴(kuò)增的部分物種鱖亞科魚類的微衛(wèi)星帶譜。
2.權(quán)利要求1所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其步驟是:1)DNA提取:采集待測鱖魚樣品的鰭條或者肌肉組織，提取基因組DNA并測定其純度和濃度；測得DNA的A260A280比值為1.82-1.97 ； 2)DNA片段擴(kuò)增:采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增待測樣品基因組DNA，擴(kuò)增引物序列為: 引物 I 正向序列:5’ TACATGCACACCAGTACGG3’， 引物 I 反向序列:5’ ACCCCGTTAAGTCCACGTC3’ ; 引物 2 正向序列:5’ TAAGTGTACAAAGAACTTTTCGC3’， 引物 2 反向序列:5’ ACAATGTAAAAGTTTGGTTCAGC3’ ; 引物 3 正向序列:5’ ATCAGCTCAACCCCTCTGCA3’， 引物 3 反向序列:5’ GCATGGATGCCAGCGTGA3’ ; 本步驟中測得DNA的濃度范圍為585.5-3210.4 ng/ μ I; PCR反應(yīng)程序?yàn)?94°C預(yù)變性4min，然后按以下條件進(jìn)行35個循環(huán):94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸lmin，循環(huán)結(jié)束后72°C延伸1min結(jié)束，4°C中保存； 3)PCR產(chǎn)物的電泳及銀染色鑒定:對PCR產(chǎn)物用非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離，常規(guī)銀染法染色后，拍照記錄電泳結(jié)果；采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠； 4)與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行對比:使用引物1，樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)Marker的300bp位置擴(kuò)增出I條DNA條帶，則鑒定為中國少鱗鱖；使用引物1，在靠近標(biāo)準(zhǔn)Marker的180bp位置擴(kuò)增出I條特異性條帶，鑒定為斑鱖；使用引物2，樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)Marker的200bp位置擴(kuò)增出I條或2條DNA條帶，鑒定為波紋鱖；使用引物3，樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)Marker的120bp位置擴(kuò)增出I條DNA條帶，鑒定為翹嘴鱖；使用引物3，樣品在靠近標(biāo)準(zhǔn)Marker的120bp位置擴(kuò)增出I條DNA條帶，鑒定為大眼鱖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其特征在于:所述的步驟(3)中PCR反應(yīng)體系為:
根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其特征在于:所述的步驟(4)中使用引物I和引物2，待測樣品為五種鱖亞科魚類:翹嘴鱖、大眼鱖、斑鱖、中國少鱗鱖及波紋鱖中的任意一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種試劑盒用于五種鱖亞科魚類的分子的鑒定方法，其特征在于:所述的步驟(4)中使用引物3時，待測樣品為翹嘴鱖或大眼鱖任意一種。
【文檔編號】C12Q1/68GK104073547SQ201310096677
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2013年3月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月25日
【發(fā)明者】梁旭方, 田昌緒, 楊敏, 鄭荷子, 趙程, 竇亞琪, 黃威 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)