專利名稱：鼻咽癌分子標(biāo)志物—brd7試劑盒的制作方法
專利說(shuō)明鼻咽癌分子標(biāo)志物-BRD7試劑盒 本發(fā)明涉及一種用于診斷鼻咽癌的分子標(biāo)志物。鼻咽癌是我國(guó)南方高發(fā)的一種惡性腫瘤，湖南省是鼻咽癌高發(fā)省之一。目前鼻咽癌篩查所用的檢測(cè)方法，多為EB病毒的血清學(xué)檢查和EB病毒檢測(cè)。由于EB病毒產(chǎn)生抗體需要一段相對(duì)較長(zhǎng)的時(shí)間，且檢測(cè)方法的敏感性和特異性并不理想，因此尚不能做到真正意義上的早期診斷。
隨著腫瘤分子機(jī)制的深入研究，腫瘤分子標(biāo)志物的檢測(cè)將成為21世紀(jì)腫瘤(癌)篩檢的方向。SNP是基因組核苷酸水平上的變異引起的DNA序列多態(tài)性，包括單堿基的轉(zhuǎn)換、顛換以及單堿基的插入/缺失等，據(jù)估計(jì)基因組中大約平均每1000bp就會(huì)有一個(gè)SNP。SNP可以劃分兩種形式一即基因編碼區(qū)(Coding Region)的功能性變異，二遍布于整個(gè)基因組的非編碼區(qū)(調(diào)控區(qū)、內(nèi)含子和剪接連接區(qū)等)的單核苷酸變異。SNP作為第三代遺傳標(biāo)記不僅用于致病基因的搜尋和進(jìn)化、種群多樣性研究，更重要的是，SNP尤其是cSNP與人類各種遺傳特征相關(guān)。本發(fā)明的目的是利用BRD7基因編碼區(qū)C450T和A737G的多態(tài)性，提供一種鼻咽癌分子標(biāo)志物-BRD7試劑盒。
研究表明BRD7基因是鼻咽癌良好的候選抑瘤基因。本發(fā)明采用PCR-SSCP技術(shù)和直接測(cè)序法對(duì)BRD7基因的編碼區(qū)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(Coding-region Single Nucleotide Polymorphism，cSNP)分析，并對(duì)鼻咽癌家系的高危成員、散發(fā)性鼻咽癌病人和正常人進(jìn)行BRD7基因等位基因分型。在BRD7基因的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)了2個(gè)cSNP(C450T和A737G)，T450與G737多態(tài)性偶聯(lián)發(fā)生在87.7％的鼻咽癌活檢組織和配對(duì)外周血、所有的鼻咽癌家系的患者及易感成員中，僅存在于22％的正常人血標(biāo)本中。T450和G737偶聯(lián)的多態(tài)性改變是鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的重要的遺傳易感風(fēng)險(xiǎn)之一(P＜0.01)，可以作為鼻咽癌的分子標(biāo)志物，用于鼻咽癌高危人群的篩選和早期診斷。
運(yùn)用BRD7基因編碼區(qū)的C450T和A737G多態(tài)性制作診斷試劑盒。
1.RNA抽提與差異RT-PCR
按照TRIzolTM試劑盒(Gibco BRL公司)操作程序提取鼻咽癌活檢組織RNA；后用DNase-I消化RNA中痕量DNA，PCR擴(kuò)增GADPH檢測(cè)無(wú)特異擴(kuò)增條帶以保證DNA消化完全。RNA取量約為2μg按RT試劑盒(Promega)操作步驟進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。采用下列參數(shù)進(jìn)行差異PCR擴(kuò)增BRD7基因的cDNA編碼區(qū)94℃變性50s；55℃復(fù)性50s；72℃延伸1min；30個(gè)循環(huán)終止。
2.SSCP為了檢測(cè)BRD7基因在鼻咽癌中有無(wú)突變，5μl PCR產(chǎn)物加等量的加樣緩沖液，95℃，3min后冰浴5min，其5μl上樣于9％的非變性聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE電泳緩沖液，10mM電泳3～5h。取下凝膠按下列程序銀染10％乙醇固定10min；1％HNO310min，雙蒸水洗一次；0.2％AgNO320min，洗兩次；3％的Na2CO3(0.05％甲醛)顯色至條帶清晰為止。
3.基因組DNA提取抽提50例鼻咽癌活檢組織及配對(duì)血標(biāo)本、50例正常人外周血淋巴細(xì)胞和2個(gè)家系永生化淋巴細(xì)胞基因組DNA。
4.特異性PCR和測(cè)序根據(jù)上述多態(tài)性結(jié)果，選擇擴(kuò)增多態(tài)性高發(fā)區(qū)的兩端引物(5’-GAACAGACACCCCTTCAAG-3’和5’-TGTGAGGTGTCTGTTCCA-3’)。根據(jù)其位于在同一個(gè)外顯子，直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。模板量取1μg，參數(shù)同上。PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、純化后，用ABI公司的377型DNA自動(dòng)測(cè)序儀直接測(cè)序分析。
5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理對(duì)BRD7等位基因型在鼻咽癌人群和正常人分布，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
該試劑盒的制作可以通過(guò)如下步驟進(jìn)行收集鼻咽癌病人的外周血淋巴細(xì)胞，抽提病人外周血淋巴細(xì)胞的DNA，就BRD7基因編碼區(qū)同一外顯子兩個(gè)偶聯(lián)的cSNP等位基因型T450和G737多態(tài)性的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物約500bp，直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，模版量取1ug，參數(shù)為94℃變性50s；55℃復(fù)性50s；72℃延伸1min；30個(gè)循環(huán)終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、純化后測(cè)序分析，檢測(cè)鼻咽癌患者BRD7基因兩個(gè)SNP的基因型。
利用BRD7基因編碼區(qū)同一外顯子兩個(gè)偶聯(lián)的cSNP等位基因型T450和G737多態(tài)性，制成價(jià)廉簡(jiǎn)便的鼻咽癌早期基因診斷試劑盒。該試劑盒的使用將提高鼻咽癌的早期診斷、改善鼻咽癌的預(yù)后，提高鼻咽癌的生存率，這將是一個(gè)成本低，但具有潛伏巨大的市場(chǎng)的診斷試劑盒，具有明顯的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

圖1BRD7基因的等位基因純合子AA；圖2BRD7基因的等位基因純合子AC；圖3BRD7基因的等位基因純合子CC；圖4BRD7基因的等位基因純合子CT；圖5BRD7基因的等位基因純合子TT；圖6BRD7基因的等位基因純合子AA；圖7BRD7基因的等位基因純合子AG；圖8BRD7基因的等位基因純合子GG。
權(quán)利要求
1.鼻咽癌分子標(biāo)志物-BRD7試劑盒，其特征在于本發(fā)明通過(guò)收集鼻咽癌病人的外周血淋巴細(xì)胞，抽提病人外周血淋巴細(xì)胞的DNA，就BRD7基因編碼區(qū)同一外顯子兩個(gè)偶聯(lián)的cSNP等位基因型T450和G737多態(tài)性的兩側(cè)設(shè)計(jì)引物約500bp，直接對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，模版量取1ug，參數(shù)為94℃變性50s；55℃復(fù)性50s；72℃延伸1min；30個(gè)循環(huán)終止，PCR產(chǎn)物經(jīng)低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠分離后QIAQUIK Gel Extraction Kit回收、純化后測(cè)序分析，檢測(cè)鼻咽癌患者BRD7基因兩個(gè)SNP的基因型。
全文摘要
鼻咽癌分子標(biāo)志物—BRD7試劑盒。本發(fā)明通過(guò)PCR技術(shù)和直接測(cè)序法對(duì)BRD7基因的編碼區(qū)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性(Coding－region Single Nucleotide Polymorphism，cSNP)分析，并計(jì)算基因型在對(duì)鼻咽癌患者和正常人群中的分布。利用BRD7基因編碼區(qū)同一外顯子兩個(gè)偶聯(lián)的cSNP等位基因型T450和G737多態(tài)性，制成價(jià)廉簡(jiǎn)便的鼻咽癌早期基因診斷試劑盒。該試劑盒的使用將提高鼻咽癌的早期診斷、改善鼻咽癌的預(yù)后，提高鼻咽癌的生存率，這將是一個(gè)成本低，但具有潛伏巨大的市場(chǎng)的診斷試劑盒，具有明顯的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1482256SQ0213960
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2002年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月13日
發(fā)明者李桂源, 余鷹, 熊煒, 曾朝陽(yáng), 李小玲, 朱詩(shī)國(guó), 張必成, 周鳴 申請(qǐng)人:中南大學(xué)