專利名稱:使用屬于埃希氏菌屬的細菌生產l－蘇氨酸的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術，特別涉及一種通過發(fā)酵生產L-氨基酸的方法以及更加特別地涉及一個源自大腸桿菌(Escherichia coli)的基因。該基因對于提高L-氨基酸，例如L-蘇氨酸的生產率是有益的。
背景技術：
傳統(tǒng)上L-氨基酸一直是利用微生物菌株通過發(fā)酵的方法進行工業(yè)生產的，這些菌株得自自然來源或相同菌株經特別修飾以提高L-氨基酸生產率的突變體。
為了提高L-氨基酸的生產率曾經使用過，例如，通過由重組DNA對微生物進行轉化而擴增生物合成基因(參見例如美國專利號4,278,765)。這些技術是基于增強參與氨基酸合成的酶的活性和/或使靶酶對于由所產生的L-氨基酸或其副產品的反饋抑制不敏感(參見例如日本公開申請?zhí)?6-18596(1981)，WO95/16042或美國專利號5,661,012和6,040,160)。
用作通過發(fā)酵生產L-蘇氨酸的各種菌株是已知的。存在具有增強活性的參與L-蘇氨酸生物合成的酶的菌株(美國專利5,175,107；5,661,012；5,705,371；5,939,307；EP0219027)、耐一些化合物如L-蘇氨酸及其類似物的菌株(WO0114525A1、EP301572A2、US5,376,538)、具有對于由所產生的L-氨基酸或其副產物的反饋抑制不敏感的靶酶的菌株(美國專利5,175,107；5,661,012)、具有失活的蘇氨酸降解酶的菌株(美國專利5,939,307、6,297,031)。
已知的蘇氨酸生產菌VKPM B-3996(美國專利5,175,107和5,705,371)是目前最好的蘇氨酸生產菌。為了構建菌株VKPM B-3996，在親本菌株E.coli K-12(VKPM B-7)中引入了幾個突變和一個如下所述的質粒。突變的thrA基因(突變thrA442)編碼耐蘇氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I。突變的ilvA基因(突變ilvA442)編碼低活性的蘇氨酸脫氨酶從而導致低的異亮氨酸生物合成速率以及異亮氨酸饑餓滲漏表型。在具有ilvA442突變的細菌中thrABC操縱子的轉錄并不被異亮氨酸所抑制，因而對于蘇氨酸生產非常有效。tdh基因的失活導致蘇氨酸降解的阻抑。將蔗糖同化的遺傳決定子轉移至所述菌株中(scrKYABR基因)。將含有突變蘇氨酸操縱子thrA442BC的質粒PVIC40導入中間菌株TDH6中，以提高控制蘇氨酸生物合成的基因的表達。菌株發(fā)酵過程中積累的L-蘇氨酸量達到85克/L。
本發(fā)明人針對E.coli K-12獲得了具有一個突變的突變體，與高濃度蘇氨酸或高絲氨酸耐性相關的thrR(這里指rhtA23)(Astaurova，O.B.等，Appl.Bioch.AND Microbiol.，21，611-616(1985))。突變通過各個大腸桿菌生產菌株如菌株VKPM B-3996提高了L-蘇氨酸(前蘇聯(lián)專利號974817)、高絲氨酸和谷氨酸(Astaurova，O.B.等，Appl.Bioch.AND Microbiol.，27，556-561，1991，EP 1013765)的生產。另外，本發(fā)明人揭示了rhtA基因存在于大腸桿菌染色體上編碼谷氨酰胺轉移系統(tǒng)組分的glnHPQ操縱子附近的18min處，以及rhtA基因等同于位于pexB和ompX基因之間的ORF1(ybiF基因，CenBank登記號AAA218541，gi440181764至1651號)。表達由ORF1編碼的蛋白的單位已被指定為rhtA(rht耐高絲氨酸和蘇氨酸)基因。本發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)rhtA23突變是針對ATG起始密碼子在-1位處用一個A替換G(第17屆生物化學和分子生物學國際會議暨美國生物化學和分子生物學協(xié)會1997年會摘要，舊金山，加利福尼亞8月24-29，1997，摘要No.457，EP 1013765 A)。
在研究蘇氨酸生物合成途徑主要路徑和優(yōu)化至一個很高程度的條件下，可以通過給細菌補充增加量的蘇氨酸遠前體如天冬氨酸來進一步改進生產蘇氨酸的菌株。
已知天冬氨酸為天冬氨酸家族(蘇氨酸、蛋氨酸、賴氨酸)，以及作為細菌細胞壁的一種組分化合物二氨基庚二酸合成的碳供體。這些合成可以通過一個有幾個分枝點和具有一個極敏感的調節(jié)模式的復雜途徑來進行。在天冬氨酸、天冬氨酸半醛、高絲氨酸的分枝點處，有與得自這一生物合成步驟的氨基酸等量的同工酶。由thrABC操縱子的-部分編碼的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I進行蘇氨酸生物合成的第一和第三反應。蘇氨酸和異亮氨酸調節(jié)天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的表達，蘇氨酸抑制催化上述兩個反應的活性[大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)，第二版，主編F.C.Neidhardt，ASM出版社，華盛頓特區(qū)，1996]。
兩個基因參與天冬氨酸的形成-由aspC基因編碼的天冬氨酸轉氨酶以及aspA基因的產物天冬氨酸酶。天冬氨酸轉氨酶將草酰乙酸酯轉變?yōu)樘於彼?。天冬氨酸酶將延胡索酸轉變?yōu)樘於彼帷?br> aspC基因的擴增對于L-賴氨酸-天冬氨酸家族的一種氨基酸生產的影響已經被披露。aspC基因的擴增用于大腸桿菌生產L-賴氨酸上(美國專利6,040,160)。具有天冬氨酸激酶以及編碼包括天冬氨酸轉氨酶在內的幾種酶的增強的DNA序列的棒狀細菌(Coryneformbacteria)被用于L-賴氨酸的生產(美國專利6,004,773)。
已經注意到天冬氨酸轉氨酶對于由棒狀菌生產L-蘇氨酸和L-賴氨酸可以是有益的(美國專利4,980,285)。
到目前為止還沒有報道使用具有增強的天冬氨酸轉氨酶活性的屬于埃希氏菌屬(Escherichia)的細菌來進行L-蘇氨酸的生產。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目標是提高L-蘇氨酸生產菌株的生產率并提供一種使用這些菌株生產L-蘇氨酸的方法。
通過發(fā)現(xiàn)克隆于一個低拷貝質粒上的編碼天冬氨酸轉氨酶的aspC基因能夠提高L-蘇氨酸的生產而使該目標得以實現(xiàn)。因此本發(fā)明已經完成。
本發(fā)明如下(1)一種屬于埃希氏菌屬的L-蘇氨酸生產細菌，其中細菌已被改性而提高了天冬氨酸轉氨酶的活性。
(2)根據(jù)(1)的細菌，其中通過提高天冬氨酸轉氨酶基因的表達量而使天冬氨酸轉氨酶的活性得以增強。
(3)根據(jù)(1)的細菌，其中通過增加天冬氨酸轉氨酶基因的拷貝數(shù)或修飾基因的表達控制序列而增強基因表達，從而使天冬氨酸轉氨酶的活性得以提高。
(4)根據(jù)(3)的細菌，其中通過用一種含所述基因的低拷貝質粒轉化細菌而使拷貝數(shù)得到提高。
(5)根據(jù)(2)到(4)的細菌，其中所述的天冬氨酸轉氨酶基因源于一種屬于埃希氏菌屬的細菌。
(6)根據(jù)(5)的細菌，其中所述的天冬氨酸轉氨酶基因編碼下列蛋白(A)或(B)(A)一種包含序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質；(B)一種包含包括在序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列中刪除、替換、插入或添加一個或幾個氨基酸的氨基酸序列的蛋白質，并且其具有天冬氨酸轉氨酶活性。
(7)根據(jù)(5)的細菌，其中所述的天冬氨酸轉氨酶基因包含下列DNA(a)或(b)(a)一種包含SEQ ID NO1中核苷酸1-1196的核苷酸序列的DNA；或(b)一種可與SEQ ID NO1中核苷酸1-1196的核苷酸序列雜交或與可在嚴格條件下從該核苷酸序列制得的探針雜交并編碼一種具天冬氨酸轉氨酶活性蛋白的DNA。
(8)根據(jù)(7)的細菌，其中所述的嚴格條件是指其中在60℃及相應于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行洗滌的條件。
(9)根據(jù)(1)到(8)的細菌，其中所述的細菌已被進一步的改性以增強一個或多個選自下列的基因的表達編碼耐蘇氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因；編碼高絲氨酸激酶的thrB基因；編碼蘇氨酸合酶的thrC基因；和編碼推定的跨膜蛋白質的rhtA基因。
(10)根據(jù)(9)的細菌，其中細菌已經被改性以提高突變thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表達量。
(10)一種生產L-蘇氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)(1)至(10)的細菌以在培養(yǎng)基中生產并積累L-蘇氨酸，以及從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。
下面對本發(fā)明進行詳細地解釋。
本發(fā)明的細菌是一種屬于埃希氏菌屬的生產L-蘇氨酸的細菌，其中該細菌已經被改性而提高了天冬氨酸轉氨酶的活性。
但是能夠用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的細菌并不受特別限制，例如，包括Neidhardt，F(xiàn).C.等描述的細菌[大腸桿菌和鼠傷寒桿菌(Salmonella typhimurium)，美國微生物協(xié)會，華盛頓特區(qū)，1208，表1]。
在本發(fā)明中，“生產L-蘇氨酸的細菌”意指一種細菌，當該細菌在一種培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，具有在這種培養(yǎng)基中積累L-蘇氨酸的能力。生產L-蘇氨酸的能力可以通過培育獲得或提高。
短語“天冬氨酸轉氨酶活性”意指催化使用吡哆醛5’-磷酸由草酰乙酸酯和谷氨酸形成天冬氨酸并釋放α-酮戊二酸的反應的活性。
短語“經改性而提高了天冬氨酸轉氨酶的活性”意即每個細胞的活性變得高于未改性的菌株，例如野生型菌株。例如，一種情況下每個細胞中的天冬氨酸轉氨酶分子數(shù)增加了，一種情況下每個天冬氨酸轉氨酶的特定活性增加了等等這樣的情況被包括在內。此外，作為一個用作參照物的野生型菌株，大腸桿菌K-12被包括在其中。作為細胞內天冬氨酸轉氨酶活性提高的結果，獲得了在培養(yǎng)基中L-蘇氨酸累積量增加的效應。
可以通過提高編碼天冬氨酸轉氨酶基因的表達量來獲得在細菌細胞中天冬氨酸轉氨酶活性的提高。任何源自屬于埃希氏菌屬細菌的基因和源自其它細菌如棒狀細菌的基因都能夠用作天冬氨酸轉氨酶的基因。其中，優(yōu)選源自屬于埃希氏菌屬細菌的基因。
作為大腸桿菌的編碼天冬氨酸轉氨酶的基因，aspC基因已得到闡明(GenBank登記號NC_000913.1，gi16128895中核苷酸號983742至984932)。因此，aspC基因可以通過PCR(polymerase chainreaction；參考White，T.J.等，Trends Genet.，5，185(1989))利用基于該核酸序列制得的引物而獲得。其它微生物的編碼天冬氨酸轉氨酶的基因可以用相似的方式得到。
源自大腸桿菌的aspC基因例如為編碼下列蛋白質(A)或(B)的DNA(A)一種包含序列表中SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白質；(B)一種包含包括在序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列中刪除、替換、插入或添加一個或幾個氨基酸的氨基酸序列的蛋白質，并且其具有天冬氨酸轉氨酶活性。
“幾個”氨基酸的數(shù)量因所述蛋白質三維結構中氨基酸殘基的位置及類型而異。對于所述蛋白質(A)，“幾個”可以是2至30個，優(yōu)選2至15個，更加優(yōu)選地為2至5個。這是因為下列原因。一些氨基酸相互之間具有高度的同源性并且在這樣的氨基酸上的差異并不顯著地影響蛋白質的三維結構及其活性。因而，蛋白質(B)可以是對于組成天冬氨酸轉氨酶的完整氨基酸殘基具有不少于30至50％同源性，優(yōu)選不少于50至70％同源性的蛋白質，并且其具有天冬氨酸轉氨酶活性。
編碼與上述天冬氨酸轉氨酶基本相同的蛋白質的DNA，可以例如通過例如定點誘變的方式修飾編碼天冬氨酸轉氨酶(SEQ ID NO1)的DNA核酸序列來獲得，從而在一個特定位點上涉及一個或多個氨基酸殘基的刪除、替換、插入或添加。上述修飾的DNA可以通過傳統(tǒng)公知的突變處理獲得。這些處理包括以羥胺處理編碼本發(fā)明所述蛋白的DNA或以紫外線輻照或用試劑如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理含有所述DNA的細菌。
編碼與天冬氨酸轉氨酶基本相同的蛋白質的DNA能夠通過使具有上述突變的DNA在一種適當?shù)募毎斜磉_，并研究表達產物的活性而獲得。編碼與天冬氨酸轉氨酶基本相同蛋白質的DNA也能夠通過從具有突變的編碼天冬氨酸轉氨酶的DNA或含有它的細胞中分離一種DNA而獲得，該DNA可與具有包含例如，序列表中如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的核苷酸序列的探針在嚴格的條件下雜交，并編碼一種具天冬氨酸轉氨酶活性的蛋白。這里所提到的“嚴格的條件”是一種在其下形成所謂的特異雜交，而不形成非特異雜交的條件。難以通過任何數(shù)值來清楚地表示這種條件。然而，例如這種嚴格條件可以通過一種條件舉例說明，在該條件下，例如具有不小于50％同源性的DNA，優(yōu)選不小于70％，更加優(yōu)選不小于90％的DNA相互雜交，但具有小于上述同源性的DNA相互間不雜交?；蛘?，這種嚴格條件可以以一種條件舉例說明，在該條件下DNA在與Southern雜交一般洗滌條件相應的鹽濃度下相互雜交，即1×SSC，0.1％SDS，優(yōu)選0.1×SSC，0.1％SDS，于60℃下。
SEQ ID NO1核酸序列的部分序列也能夠用作探針。這樣的探針可以使用基于SEQ ID NO1核酸序列生產的寡核苷酸作為引物，用包含SEQ ID NO1的核酸序列的DNA片段作為模板，通過PCR來制備。當使用一個長度為300bp的DNA片段為探針時，雜交的洗滌條件由，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS構成。
上述核酸的取代、刪除、插入或添加也包括自然發(fā)生的突變(突變體或變異體)，例如，在具有天冬氨酸轉氨酶的細菌的個體差異或物種或屬的差異的基礎上。
用編碼蛋白的DNA轉化細菌意味著例如通過傳統(tǒng)方法將DNA導入細菌細胞中，以提高編碼本發(fā)明蛋白的基因表達并增強細菌細胞中該蛋白的活性。
增強基因表達的方法包括提高基因拷貝數(shù)。將一個基因導入能夠在屬于埃希氏菌屬的細菌中發(fā)揮作用的載體內提高了該基因的拷貝數(shù)。為了這樣的目的可以優(yōu)選使用低拷貝載體。低拷貝載體的例子為pSC101、pMW118、pMW119及諸如此類。
增強基因表達也能夠通過用例如，同源重組法或諸如此類的方法，將基因的多個拷貝導入細菌染色體中而實現(xiàn)。作為轉化的方法，任何迄今為止曾報道的公知方法都可以使用。例如，可以使用一種以氯化鈣處理受體細胞以提高DNA通透性的方法，此方法曾被報道過用于大腸桿菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。
另一方面，增強基因表達也能夠通過將本發(fā)明的DNA置于一個強啟動子的控制下而實現(xiàn)。例如，lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子、λ噬菌體的PR、PL啟動已知為強啟動子。強啟動子的使用可以結合以基因拷貝的增加。
或者，啟動子可以通過例如，將一個突變導入啟動子上以提高位于該啟動子下游基因的轉錄水平來增強。此外，已知在核糖體的結合位點(RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)和特別是緊接起始密碼子上游的序列的幾個核苷酸的取代深遠地影響mRNA的翻譯能力。例如，發(fā)現(xiàn)20倍的表達水平范圍依賴于起始密碼子之前的三個核苷酸的本性(Gold等，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等，EMBOJ，3，623-629，1984)。更早地，本發(fā)明的發(fā)明人顯示了rhtA23突變?yōu)樵谙鄬τ贏TG起始密碼子-1位上的一個A替換了G(第17屆生物化學和分子生物學國際會議暨美國生物化學和分子生物學協(xié)會1997年會摘要，舊金山，加利福尼亞8月24-29，1997，摘要號457)。因此，可以提示rhtA23突變增強了rhtA基因的表達并且，因而提高對蘇氨酸、高絲氨酸和一些其它運輸?shù)郊毎馕镔|的耐性。
此外，將核苷酸取代引入天冬氨酸轉氨酶的啟動子區(qū)從而將其改性為一個更強的啟動子也是可能的。對表達控制序列的改造能夠例如，利用如在國際專利公開WO00/18935和日本專利公開號1-215280中公開的一個溫度敏感質粒，以與基因取代相同的方式來進行。
增加天冬氨酸轉氨酶基因的拷貝數(shù)也能夠通過將天冬氨酸轉氨酶基因的多個拷貝導入細菌染色體DNA中而實現(xiàn)。為了將天冬氨酸轉氨酶基因的多個拷貝導入細菌染色體中，通過使用一個有多個拷貝存在于染色體DNA中的序列作為靶對象來進行同源重組。作為有多個拷貝存在于染色體DNA中的序列，可以使用重復的DNA、存在于轉座元件未端的反向重復序列。同樣，如在日本專利公開號2-109985中披露的，可以將天冬氨酸轉氨酶基因整合至轉座子中，并使其轉移以將該基因的多個拷貝導入染色體DNA中。
質粒DNA的制備方法、DNA的消化和連接、轉化、選擇一個寡核苷酸作為引物及諸如此類的方法對于本領域技術人員來說是普通的方法。這些方法例如，在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.，和Maniatis，T.，“分子克隆實驗指南(Molecular Cloning A LaboratoryManual)，第二版”，冷泉實驗室出版社(1989)中得到了描述。
本發(fā)明的細菌能夠通過將上述DNA導入天然具有生產L-蘇氨酸能力的細菌中而獲得?；蛘撸景l(fā)明的細菌能夠通過給予已具有這些DNA的細菌生產L-蘇氨酸的能力而獲得。
對于aspC基因編碼的天冬氨酸轉氨酶活性得以提高的親本菌株，可以使用屬于埃希氏菌屬的生產蘇氨酸的細菌如大腸桿菌株VKPM B-3996(美國專利5,175,107，美國專利5,705,371)、大腸桿菌株NRRL-21593(美國專利5,939,307)、大腸桿菌株FERM BP-3756(美國專利5,474,918)、大腸桿菌株FERM BP-3519和FERM BP-3520(美國專利5,376,538)、大腸桿菌株MG442(Gusyatiner等，Genetika(俄語)，14，947-956(1978))、大腸桿菌株VL643和VL2055(EP 1149911A)及諸如此類。
菌株B-3996缺少thrC基因并同化蔗糖，其中ilvA基因具有一個滲漏突變。該菌株在rhtA基因上具有一個突變，此基因賦予了對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的耐性。菌株B-3996含有pVIC40質粒，該質粒通過將thrA*BC操縱子插入到RSF1010源載體中而獲得，所述的操縱子包括編碼對蘇氨酸反饋抑制基本脫敏的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因。菌株B-3996于1987年4月7日以編號B-3996保藏于俄羅斯工業(yè)微生物國家保藏中心(VKPM)(Dorozhnyproezd.1，Moscow 113545，俄羅斯聯(lián)邦)。
優(yōu)選地將本發(fā)明的細菌改性以增強一個或多個下列基因和aspC基因的表達編碼耐蘇氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因；編碼高絲氨酸激酶的thrB基因；編碼蘇氨酸合成酶的thrC基因；該細菌的另一個優(yōu)選實施方案是除了增強aspC基因之外還增強rhtA基因，該基因編碼推定的跨膜蛋白。細菌的最優(yōu)選實施方案是經改性而提高了aspC基因、thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表達量。
本發(fā)明的生產L-蘇氨酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細菌以使L-蘇氨酸得以生產并在培養(yǎng)基中積累，以及從培養(yǎng)中收集L-蘇氨酸的步驟。
在本發(fā)明中，從培養(yǎng)基中培養(yǎng)、收集和純化L-氨基酸以及諸如此類可以用一種與其中用一種微生物生產一種氨基酸的傳統(tǒng)的發(fā)酵方法相似的方式進行。
培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可以是一種合成培養(yǎng)基或是一種天然培養(yǎng)基，只要該培養(yǎng)基包括碳源和氮源和礦物質以及如果必要的話，微生物生長所需要的適量營養(yǎng)物質。碳源可以包括各種糖類如葡萄糖和蔗糖以及各種有機酸。依賴于所用微生物同化作用的模式，可以使用醇類包括乙醇和丙三醇。作為氮源，使用各種銨鹽如氨和硫酸銨、其它氮化合物如胺、天然氮源如蛋白胨、大豆水解產物以及經消化的發(fā)酵微生物。作為礦物質，使用磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣以及諸如此類。作為維生素，使用硫胺素、酵母提取物以及諸如此類。
優(yōu)選地培養(yǎng)在有氧環(huán)境下，如搖動的培養(yǎng)，以及通風攪拌的培養(yǎng)，在20到40℃下，優(yōu)選30-38℃的溫度下進行。培養(yǎng)物的pH通常在5和9之間，優(yōu)選在6.5和7.2之間。培養(yǎng)物的pH可以用氨、碳酸鈣、各種酸、各種堿以及緩沖劑進行調節(jié)。典型地，1到5天的培養(yǎng)物導致目標L-氨基酸在液體培養(yǎng)基中的累積。
培養(yǎng)后，可以通過離心或膜過濾從液體培養(yǎng)基中除去固體如細胞，隨后可以通過離子交換、濃縮以及結晶方法收集并純化L-蘇氨酸。
實施本發(fā)明的最佳方式下面將結合實施例對本發(fā)明進行更加具體的解釋。
實施例1從大腸桿菌中克隆aspC基因至pMW119載體通過PCR使用序列表中SEQ ID NOs3和4所示的引物從大腸桿菌株K-12的染色體DNA獲得aspC基因。將獲得的DNA片段以限制性內切酶PvuII和EcoRI處理并連接至事先以限制性內切酶HincII和EcoRI處理的在Plac啟動子控制下的穩(wěn)定的低拷貝質粒pMW119(復制子pSC101)。這樣，就獲得了pMW-Plac-aspC質粒。
同樣地，將aspC基因置于λ噬菌體的強PR啟動子而非Plac啟動子的控制下。使用序列表中SEQ ID NO5和6中所示的化學合成的5’-磷酸化的寡核苷酸形成含PR啟動子的DNA雙鏈。隨后，將DNA雙鏈連接至事先以限制性內切酶PvuII和HindII處理的pMW-Plac-aspC質粒。這樣就構建了pMW-PR-aspC質粒。
非調控的aspC基因的高水平表達能夠用這些質粒來實現(xiàn)。質粒pMW-Plac-aspC和pMW-PR-aspC與質粒Pvic40(復制子1010)兼容，因而兩個質粒Pvic40和pMW-Plac-aspC或Pvic40和pMW-PR-aspC能夠同時保持在細菌中。
將pMW-Plac-aspC和pMW-PR-aspC質粒中的每一個都導入耐鏈霉素的蘇氨酸生產者大腸桿菌株B-3996(美國專利5,175,107)中。這樣就獲得了菌株B-3996(pMW-Plac-aspC)和B-3996(pMW-PR-aspC)。
實施例2 aspC基因擴增對蘇氨酸生產的影響將大腸桿菌株B-3996(pMW-Plac-aspC)和B-3996(pMW-PR-aspC)在含鏈霉素(100μg/ml)的L-瓊脂培養(yǎng)盤上于37℃生長18-24小時。隨后將一環(huán)細胞轉移至50ml的具有下列成分的L-肉湯中色氨酸-10g/l、酵母提取物-5g/l、NaCl-5g/l。在搖床上(240rpm)于37℃下讓細胞生長(50ml，OD540-20.u.)5小時，用于為450ml發(fā)酵培養(yǎng)基接種。批發(fā)酵在具有1.0L容積的實驗室發(fā)酵罐中于37℃在通風下(1/1vvm)在1200rpm的攪拌速度下進行。用8％氨水將pH值自動保持在6.6。
結果見表1。
發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(g/l)蔗糖 100.0NH4Cl 1.75KH2PO41.0MgSO4.7H2O 0.8FeSO4.7H2O 0.01MnSO4.5H2O 0.01Mameno(TN) 0.15甜菜堿 1.0L-異亮氨酸 0.2單獨對蔗糖和硫酸鎂進行滅菌。將pH調至6.6。
表1


工業(yè)適用性根據(jù)本發(fā)明，可以有效地生產蘇氨酸。
序列表SEQUENCE LISTING<110>Ajinomoto Co.，Inc.
<120>使用屬于埃希氏菌屬的細菌生產L-蘇氨酸的方法<130>C042AYOP1313<140>
<141>2003-02-25<150>RU 2002104983<151>2002-02-27<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1191<212>DNA<213>大腸桿菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1191)<400>1atg ttt gag aac att acc gcc gct cct gcc gac ccg att ctg ggc ctg 48Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu1 5 10 15gcc gat ctg ttt cgt gcc gat gaa cgt ccc ggc aaa att aac ctc ggg 96Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly20 25 30att ggt gtc tat aaa gat gag acg ggc aaa acc ccg gta ctg acc agc 144Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser35 40 45gtg aaa aag gct gaa cag tat ctg ctc gaa aat gaa acc acc aaa aat 192Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn50 55 60tac ctc ggc att gac ggc atc cct gaa ttt ggt cgc tgc act cag gaa 240Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu65 70 75 80
ctg ctg ttt ggt aaa ggt agc gcc ctg atc aat gac aaa cgt gct cgc 288Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg85 90 95acg gca cag act ccg ggg ggc act ggc gca cta cgc gtg gct gcc gat 336Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp100 105 110ttc ctg gca aaa aat acc agc gtt aag cgt gtg tgg gtg agc aac cca 384Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro115 120 125agc tgg ccg aac cat aag agc gtc ttt aac tct gca ggt ctg gaa gtt 432Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val130 135 140cgt gaa tac gct tat tat gat gcg gaa aat cac act ctt gac ttc gat 480Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp145 150 155 160gca ctg att aac agc ctg aat gaa gct cag gct ggc gac gta gtg ctg 528Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu165 170 175ttc cat ggc tgc tgc cat aac cca acc ggt atc gac cct acg ctg gaa 576Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu180 185 190caa tgg caa aca ctg gca caa ctc tcc gtt gag aaa ggc tgg tta ccg 624Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro195 200 205ctg ttt gac ttc gct tac cag ggt ttt gcc cgt ggt ctg gaa gaa gat 672Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp210 215 220gct gaa gga ctg cgc gct ttc gcg gct atg cat aaa gag ctg att gtt 720Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val225 230 235 240gcc agt tcc tac tct aaa aac ttt ggc ctg tac aac gag cgt gtt ggc 768Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly245 250 255gct tgt act ctg gtt gct gcc gac agt gaa acc gtt gat cgc gca ttc 816Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe260 265 270agc caa atg aaa gcg gcg att cgc gct aac tac tct aac cca cca gca 864Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala275 280 285cac ggc gct tct gtt gtt gcc acc atc ctg agc aac gat gcg tta cgt 912His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg290 295 300gcg att tgg gaa caa gag ctg act gat atg cgc cag cgt att cag cgt 960Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg
305 310 316 320atg cgt cag ttg ttc gtc aat acg ctg cag gaa aaa ggc gca aac cgc 1008Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg325 330 335gac ttc agc ttt atc atc aaa cag aac ggc atg ttc tcc ttc agt ggc 1056Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly340 345 350ctg aca aaa gaa caa gtg ctg cgt ctg cgc gaa gag ttt ggc gta tat 1104Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr355 360 365gcg gtt gct tct ggt cgc gta aat gtg gcc ggg atg aca cca gat aac 1152Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn370 375 380atg gct ccg ctg tgc gaa gcg att gtg gca gtg ctg taa 1191Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu385 390 395<210>2<211>396<212>PRT<213>大腸桿菌<400>2Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu1 5 10 15Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly20 25 30Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser35 40 45Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn50 55 60Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu65 70 75 80Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg85 90 95Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp100 105 110Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro115 120 125Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val130 135 140Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp145 150 155 160Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu
165 170 175Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu180 185 190Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro195 200 205Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp210 215 220Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val225 230 235 240Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly245 250 255Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe260 265 270Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala275 280 285His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg290 295 300Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg305 310 315 320Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg325 330 335Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly340 345 350Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr355 360 365Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn370 375 380Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu385 390 395<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3gctacttacg aattccgttt gtcatcagtc tcagcc 36<210>4<211>36<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>4cctagatcac agctgatgtt tgagaacatt accgcc 36<210>5<211>36<212>DNA<213>人工序列<400>5ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gtccca 36<210>6<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>6agcttgggac cattatcacc gccagaggta aaatagtcaa 40
權利要求
1.一種屬于埃希氏菌屬的生產L-蘇氨酸的細菌，其中該細菌已經被改性而增強了天冬氨酸轉氨酶的活性。
2.權利要求
1的細菌，其中通過提高天冬氨酸轉氨酶基因的表達量來增強所述天冬氨酸轉氨酶的活性。
3.權利要求
1的細菌，其中通過提高天冬氨酸轉氨酶基固的拷貝數(shù)或通過修飾該基因的表達控制序列以增強所述基因的所述表達來提高所述天冬氨酸轉氨酶的活性。
4.權利要求
3的細菌，其中通過用含有所述基因的低拷貝載體轉化所述細菌來提高所述的拷貝數(shù)。
5.權利要求
2至4中任意一項的細菌，其中所述的天冬氨酸轉氨酶基因源自一種屬于埃希氏菌屬的細菌。
6.權利要求
5的細菌，其中所述的天冬氨酸轉氨酶基因編碼下列蛋白(A)或(B)(A)一種包含序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列的蛋白質；(B)一種包含包括在序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列中刪除、替換、插入或添加一個或幾個氨基酸的氨基酸序列的蛋白質，并且其具有天冬氨酸轉氨酶活性。
7.權利要求
5的細菌，其中所述的天冬氨酸轉氨酶基因包含下列DNA(a)或(b)(a)一種包含SEQ ID NO1中核苷酸1-1196的核苷酸序列的DNA；或(b)一種可與SEQ ID NO1中核苷酸1-1196的核苷酸序列雜交或可與在嚴格條件下從所述核苷酸序列制得的探針雜交并編碼一種具天冬氨酸轉氨酶活性蛋白的DNA。
8.權利要求
7的細菌，其中所述的嚴格條件是指其中洗滌在60℃及相應于1×SSC和0.1％SDS的鹽濃度下進行洗滌的條件。
9.權利要求
1至8中任意一項的細菌，其中所述細菌已經被進一步改性而增強了一個或多個選自下列的基因的表達編碼耐蘇氨酸反饋抑制的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA基因；編碼高絲氨酸激酶的thrB基因；編碼蘇氨酸合酶的thrC基因；編碼推定的跨膜蛋白質的rhtA基因。
10.權利要求
9的細菌，其中所述細菌已經被改性而提高了所述的突變thrA基因、thrB基因、thrC基因和rhtA基因的表達量。
11.一種生產L-蘇氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權利要求
1-10中任意一項的細菌以在培養(yǎng)基中生產并積累L-蘇氨酸，以及從培養(yǎng)基中收集L-蘇氨酸。
專利摘要
一種利用屬于埃希氏菌屬的細菌生產L－蘇氨酸的方法，其中該細菌具有L－蘇氨酸生產能力并經過改性而提高了天冬氨酸轉氨酶的活性。
文檔編號C12P13/08GKCN1639341SQ03804683
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月25日
發(fā)明者V·Z·阿克維迪安, E·A·薩拉索瓦, A·M·卡普蘭, A·O·洛巴納夫, Y·I·科滋洛夫 申請人:味之素株式會社導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan