專利名稱:一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域中一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法及其應(yīng)用，特別涉及一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，是人類食物和營(yíng)養(yǎng)的基本來源。目前全世界小麥播種面積約2.26億公頃，總產(chǎn)量約5.5億噸。在我國(guó)北方，小麥?zhǔn)欠N植面積最大的糧食作物。但目前我國(guó)小麥的生產(chǎn)面臨著干旱、鹽堿和病蟲害的威脅，同時(shí)還存在著加工品質(zhì)欠佳的問題。這些難題的解決有賴于小麥基因工程的進(jìn)展。
由于小麥的遺傳背景較其它作物復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化困難，因此是三個(gè)重要的禾本科作物中最后一個(gè)獲得轉(zhuǎn)基因成功的。盡管從1992年以來利用基因槍法、花粉管通道法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEG法、電激法和激光微束法分別獲得了轉(zhuǎn)基因小麥，但其轉(zhuǎn)化率均未超過6％。由基因槍法等物理轉(zhuǎn)化方法獲得的轉(zhuǎn)基因小麥存在外源基因的拷貝數(shù)多、再生困難和不育等缺陷。小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)已成為限制小麥基因工程研究發(fā)展的重要因素。由于這種限制，至今已獲得的有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的轉(zhuǎn)基因小麥極其有限。與其它轉(zhuǎn)化方法相比，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化具有操作簡(jiǎn)便、不需特殊的儀器、比較短的培養(yǎng)周期、更重要的是外源基因插入的低拷貝性和完整性以及轉(zhuǎn)基因植株可育植株比例高等優(yōu)點(diǎn)。因此建立一套農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效小麥轉(zhuǎn)化系統(tǒng)以突破小麥基因工程的瓶頸具有重要的意義和巨大的應(yīng)用價(jià)值。
以往人們認(rèn)為單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主而不能被其轉(zhuǎn)化。然而90年代以來，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化在水稻、玉米、大麥等農(nóng)作物中的成功表明這種轉(zhuǎn)化技術(shù)有希望成為常規(guī)的技術(shù)。特別是最近的研究揭示，T-DNA從農(nóng)桿菌到單子葉植物的轉(zhuǎn)移與到雙子葉植物的轉(zhuǎn)移具相同的分子機(jī)制。這便為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化其它目前尚未成功的單子葉植物，如小麥等提供了理論依據(jù)。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化一直是國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。1997年Monsanto公司的Cheng等在世界上首次報(bào)道了以小麥幼胚和胚性愈傷組織為外植體獲得了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因(nptII)再生植株。他們對(duì)影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的一些因素，如外植體類型、農(nóng)桿菌細(xì)胞濃度、接種和共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)所用培養(yǎng)基、表面活性劑應(yīng)用、共培養(yǎng)誘導(dǎo)化合物、轉(zhuǎn)化體選擇等方面進(jìn)行了研究，提出了一套較為成熟的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。1999年2月17日公開的公開號(hào)為1208437，名稱為“農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的可育小麥的方法及其相關(guān)組分”的中國(guó)專利申請(qǐng)中，提供的外植體包括新鮮分離或預(yù)培養(yǎng)的未成熟胚、胚發(fā)生性愈傷組織及懸浮細(xì)胞。1999年我國(guó)的夏光敏也報(bào)道了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將nptII基因?qū)胄←溣着吆团咝杂鷤M織，得到轉(zhuǎn)基因植株，轉(zhuǎn)基因頻率達(dá)到3.7-5.9％，明顯高于其它小麥轉(zhuǎn)化研究。但這些轉(zhuǎn)化方法均需經(jīng)過組織培養(yǎng)再生植株。已有的研究表明小麥不同基因型的受體材料對(duì)植株再生有顯著影響。目前已知小麥幼胚和胚性愈傷組織的再生能力較高，但受基因型的限制很大，而我國(guó)多數(shù)生產(chǎn)用小麥當(dāng)家品種，由愈傷組織分化再生非常困難，這限制了需經(jīng)組織培養(yǎng)途徑進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的應(yīng)用。
轉(zhuǎn)基因植物在美國(guó)已形成產(chǎn)業(yè)，而且產(chǎn)值增長(zhǎng)迅速，如2001年美國(guó)種植業(yè)中已有超過40％的面積種植的是轉(zhuǎn)基因植物。這說明轉(zhuǎn)基因植物有巨大的市場(chǎng)需求潛力。在目前已形成的生產(chǎn)能力中，易于被農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的植物如馬鈴薯、番茄和油菜等的產(chǎn)值占據(jù)了主要份額，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化困難的作物如小麥至今仍未得到有生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因品種。研制小麥等重要糧食作物的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)單、快速、實(shí)用的培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，利用該方法培育轉(zhuǎn)基因小麥不需經(jīng)過組織培養(yǎng)和植株再生的過程。
本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，是通過農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將外源基因?qū)胄←溕L(zhǎng)點(diǎn)，通過非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法得到轉(zhuǎn)基因小麥。
生長(zhǎng)點(diǎn)可為根尖生長(zhǎng)點(diǎn)、莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，優(yōu)選為莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。
所述遺傳轉(zhuǎn)化的外植體為小麥種子23-27℃萌發(fā)48-72小時(shí)得到的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。
攜帶有外源基因的農(nóng)桿菌需先在80-120μM乙酰丁香酮中培養(yǎng)1-3小時(shí)，再在0.03-0.05Mpa真空度下，感染外植體8-12分鐘。然后將被感染的外植體轉(zhuǎn)入合適培養(yǎng)基中，如MS培養(yǎng)基，在22-25℃、14-16/10-8小時(shí)光周期下共培養(yǎng)2-4天得到轉(zhuǎn)基因小麥幼苗。
本發(fā)明的方法與其它培育轉(zhuǎn)基因小麥方法的顯著區(qū)別在于采用小麥生長(zhǎng)點(diǎn)作為農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化的外植體，而不是未成熟胚或胚性愈傷組織或懸浮細(xì)胞，不需經(jīng)過組織培養(yǎng)和植株再生的過程，從根本上克服了由于小麥基因型對(duì)轉(zhuǎn)化后形成可育再生植株的限制。
本發(fā)明通過對(duì)局部人工損傷的小麥生長(zhǎng)點(diǎn)采用真空滲入技術(shù)進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得了表達(dá)報(bào)告基因的轉(zhuǎn)基因小麥，生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化率達(dá)到60-70％，成苗率平均90％，T0代種子卡那霉素抗性陽(yáng)性率為16-21％，T1代幼苗報(bào)告基因表達(dá)陽(yáng)性率占所測(cè)植株的81％。尤為重要的是克服了小麥遺傳轉(zhuǎn)化的瓶頸問題-基因型的限制。本發(fā)明所試材料的品種包括小麥金花、小麥京411、小麥4071，均獲得上述效果。
本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化效率高、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、不依賴于受體的基因型。
本發(fā)明的方法可以培育出各種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和/或抗逆性強(qiáng)的小麥新種質(zhì)；非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法可應(yīng)用到其它受基因型限制大難以獲得轉(zhuǎn)基因植株的單子葉農(nóng)作物中，可以培育高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)的新型農(nóng)作物。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、轉(zhuǎn)基因小麥的培育1、小麥外植體的處理(1)將金花、京411和京4071三種小麥品種的小麥種子用10％的次氯酸消毒5分鐘，再用70％的乙醇處理10分鐘，然后用無菌水沖洗3次。在一無菌大平皿中墊三層以無菌水浸濕的紗布，將經(jīng)消毒處理的小麥種子置于平皿中25℃黑暗中萌發(fā)48小時(shí)，得到待轉(zhuǎn)化的小麥萌發(fā)種子。
(2)在無菌條件下用解剖針將待轉(zhuǎn)化的小麥萌發(fā)種子胚芽鞘劃開，盡量暴露其生長(zhǎng)點(diǎn)，以便于外源基因的導(dǎo)入。
2、轉(zhuǎn)化用農(nóng)桿菌的培養(yǎng)(1)將過夜培養(yǎng)的農(nóng)桿菌菌株LBA4404/3301，其中含CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因，1ml接種于100ml含鏈霉素100mg/L，卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的YEB培養(yǎng)基中，28℃，300rpm振蕩培養(yǎng)至菌液濃度為OD600nm＝0.7。
(2)在轉(zhuǎn)化前向菌液中加入乙酰丁香酮至100μM，繼續(xù)在28℃，300rpm振蕩培養(yǎng)2小時(shí)。將上述菌液分裝于50ml的無菌三角瓶中，每瓶20ml。
3、轉(zhuǎn)化(1)將步驟1的(2)中的小麥生長(zhǎng)點(diǎn)浸入步驟2的(2)中的菌液中，侵染20分鐘后，置于負(fù)壓條件下，真空度0.04Mpa，滲透10分鐘。
(2)真空滲透處理后，倒除菌液，用無菌吸水紙將小麥外植體表面的菌液吸凈，轉(zhuǎn)入含羧芐基青霉素的MS培養(yǎng)基中，22-25℃、16/8小時(shí)光周期下共培養(yǎng)3天。
4、生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化后3天報(bào)告基因的瞬時(shí)表達(dá)及轉(zhuǎn)化率檢測(cè)(1)GUS基因表達(dá)的組織化學(xué)檢測(cè)將轉(zhuǎn)化3天的小麥幼苗置于含1％甲醛、50mM pH7.0的磷酸鈉緩沖液和0.05％Triton X-100的固定液中，室溫下溫和搖動(dòng)30分鐘；倒掉固定液，再以50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)洗3次；將幼苗轉(zhuǎn)入含2mM X-Glue，50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)和0.05％Triton X-100的染色液中，37℃保溫8小時(shí)；之后轉(zhuǎn)移至75％乙醇中脫色4小時(shí)，然后在解剖鏡下觀察。
(2)報(bào)告基因表達(dá)結(jié)果小麥金花、小麥京411、小麥4071三種小麥品種轉(zhuǎn)化后均有GUS基因表達(dá)的藍(lán)色顯色反應(yīng)。如表1所示，小麥金花、小麥京411和小麥4071的表達(dá)率分別為61.3％、64.3％和65.8％。
表1、三種小麥品種GUS基因表達(dá)情況


5、生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)化后的培育和成苗將共培養(yǎng)3天后的小麥幼苗移入以铚?zhǔn)癁榛|(zhì)的花盆中，在25℃、60％相對(duì)濕度、16/8小時(shí)光周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)3-4周后成苗，然后轉(zhuǎn)入自然光溫室中栽種，約90％的苗正常結(jié)實(shí)。
6、T0代種子的篩選以50mg/L卡那霉素對(duì)T0代種子進(jìn)行篩選，經(jīng)4小時(shí)浸泡后置于平皿中25℃黑暗中萌發(fā)48小時(shí)，結(jié)果如表2所示，小麥金花、小麥京411和小麥4071的表達(dá)率分別為61.3％、64.3％和65.8％。
表2 三種小麥品種的T0代種子萌發(fā)情況


7、T1代報(bào)告基因表達(dá)的檢測(cè)經(jīng)卡那霉素篩選后萌發(fā)的種子轉(zhuǎn)移到以铚?zhǔn)粸榛|(zhì)的花盆中，在25℃、60％相對(duì)濕度、16/8小時(shí)光周期的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。待長(zhǎng)出第三片葉時(shí)，取第一片葉按照步驟4的(1)中的方法檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)，報(bào)告基因表達(dá)陽(yáng)性率占所測(cè)植株的81％(22/27)。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，是通過農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將外源基因?qū)胄←溕L(zhǎng)點(diǎn)，通過非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法得到轉(zhuǎn)基因小麥。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述生長(zhǎng)點(diǎn)為根尖生長(zhǎng)點(diǎn)或莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述遺傳轉(zhuǎn)化的外植體為小麥種子23-27℃萌發(fā)48-72小時(shí)得到的莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1或2所述的方法，其特征在于所述攜帶有外源基因的農(nóng)桿菌先在80-120μM乙酰丁香酮中培養(yǎng)1-3小時(shí)，再轉(zhuǎn)染外植體。
5.根據(jù)權(quán)利要求
4所述的方法，其特征在于所述先在80-120μM乙酰丁香酮中培養(yǎng)1-3小時(shí)的農(nóng)桿菌在0.03-0.05Mpa的真空度下，感染外植體8-12分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求
5所述的方法，其特征在于所述被感染的外植體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基中，在22-25℃、14-16/10-8小時(shí)光周期下共培養(yǎng)2-4天得到轉(zhuǎn)基因小麥幼苗。
7.根據(jù)權(quán)利要求
6所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。
8.非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法在培育高產(chǎn)和/或優(yōu)質(zhì)小麥種質(zhì)中的應(yīng)用。
9.非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法在培育抗逆小麥種質(zhì)中的應(yīng)用。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法及其應(yīng)用。其目的是提供一種不需經(jīng)過組織培養(yǎng)和植株再生過程的培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法。本發(fā)明所提供的培育轉(zhuǎn)基因小麥的方法，是通過農(nóng)桿菌的介導(dǎo)將外源基因?qū)胄←溕L(zhǎng)點(diǎn)，通過非組培遺傳轉(zhuǎn)化方法得到轉(zhuǎn)基因小麥。用本發(fā)明的方法可以培育出各種高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和/或抗逆性強(qiáng)的小麥新種質(zhì)。
文檔編號(hào)A01H1/00GKCN1580257SQ03153280
公開日2005年2月16日 申請(qǐng)日期2003年8月13日
發(fā)明者麻密, 李江川, 王劍虹, 朱至清, 屈貴平 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院植物研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan