專利名稱：一種以小麥花藥為受體的轉(zhuǎn)基因方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以小麥花藥為受體的轉(zhuǎn)基因方法。
背景技術(shù)：
1991年Vasil等利用基因槍介導(dǎo)法將bar基因?qū)肓诵←?，獲得了世界上第一例小麥轉(zhuǎn)基因植株。次年，Weeks等利用基因槍介導(dǎo)法將gus基因、bar基因?qū)肓诵←?，并通過對(duì)基因槍轉(zhuǎn)化過程中不同參數(shù)的優(yōu)化，建立了更為成熟的基因槍轉(zhuǎn)化小麥幼胚的技術(shù)體系。之后，小麥基因轉(zhuǎn)化取得了明顯的進(jìn)展，利用不同方法將多種基因?qū)肓诵←溣着撸?獲得了一批小麥轉(zhuǎn)基因植株，為外源基因的遺傳研究提供了資料。但與水稻、玉米等作物相比，小麥屬于遺傳轉(zhuǎn)化最為困難的糧食作物，而且小麥的轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，從目前研究進(jìn)程看，小麥的基因工程育種進(jìn)程明顯落后于其他主要農(nóng)作物?；驑尫?、農(nóng)桿菌法和花粉管通道法是目前應(yīng)用于小麥基因轉(zhuǎn)化最廣泛的方法。 在獲得小麥轉(zhuǎn)基因植株的報(bào)道中，基因槍法占90%左右，其它方法僅占10%。而在其他作物上相當(dāng)成熟的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，在小麥基因轉(zhuǎn)化中遇到了很大的困難，主要問題是侵染后的愈傷組織褐化死亡、再生困難。因此，基因槍法仍然是小麥基因轉(zhuǎn)化的主要方法?；驑屴D(zhuǎn)化小麥的受體有幼胚及胚性愈傷組織、懸浮細(xì)胞、盾片組織、成熟胚、幼穗、莖尖組織等，大多采用授粉后13 14d的幼胚及其愈傷組織為受體材料。但是，小麥?zhǔn)侨旧w組成復(fù)雜的異源六倍體，其基因組是水稻和玉米的近40倍，以幼胚、成熟胚和莖尖分生組織等雙倍體為受體的轉(zhuǎn)基因后代穩(wěn)定慢，容易形成嵌合體。以小麥花藥作為轉(zhuǎn)基因受體，得到的單倍體通過染色體人工加倍，直接得到基因型純合的個(gè)體，減少了了嵌合體的產(chǎn)生幾率，縮短育種年限，因此，以單倍體為受體的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種非常有前途的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以小麥花藥為受體的轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明提供的方法，包括以下步驟1)以植物花藥為受體用基因槍法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后的花藥；2)將步驟1)得到的轉(zhuǎn)化后的花藥培養(yǎng)，得到胚狀體，然后將所述胚狀體培養(yǎng)，得到單倍體再生苗。其中步驟1)中，所述基因轉(zhuǎn)化包括如下步驟a)將單核靠邊期的植物花藥浸入0. 2-0. 4mol/L的作為粘附劑的甘露醇水溶液中保存，得到基因轉(zhuǎn)化用的受體；所述保存的溫度是2-6°C，所述保存的時(shí)間是16至M小時(shí)；b)用基因槍將子彈針對(duì)步驟a)中得到的受體進(jìn)行轟擊；所述轟擊步驟中，所述受體與所述基因槍的距離為6-9cm，所述轟擊的壓力為900-1300psi。上述步驟b)中，所述子彈的制備方法包括如下步驟用粒徑為0. 6-1. Omm的金粉包被DNA，得到DNA包裹體溶液；將所述DNA包裹體溶液置于冰上1_5分鐘，然后離心取沉淀 (將該沉淀記為沉淀A)；往所述沉淀A中加無水乙醇振蕩，得到懸浮液，將懸浮液置于冰上1-5分鐘，然后離心取沉淀(將該沉淀記為沉淀B)；往所述沉淀B中加無水乙醇得到子彈。進(jìn)一步，上述金粉的粒徑為0. 6mm ；所述DNA包裹體溶液置于冰上的時(shí)間以及所述懸浮液置于冰上的時(shí)間均為2分鐘。上述步驟a)中，所述粘附劑是0.3mol/L的甘露醇水溶液；所述保存的溫度是 4°C，所述保存的時(shí)間是16小時(shí)。上述步驟b)中，所述轟擊步驟中，所述受體與所述基因槍的距離為6cm，所述轟擊的壓力為1300psi ；所述轟擊步驟中每一槍的金粉的量是lOOug。進(jìn)一步，上述方法中還包括在步驟2~)之后的染色體加倍處理，得到雙倍體轉(zhuǎn)基因植物；所述染色體加倍處理是將步驟幻中得到的單倍體再生苗的根部浸泡在加倍液中；所述浸泡步驟中，單倍體再生苗根部是通氣的。上述浸泡步驟中氣溫是恒溫18°C。上述加倍液的配置方法如下先配制0.4% (質(zhì)量百分比)的秋水仙素母液，取上述母液40ml，加Iml的二甲基亞砜(DMSO)，加水定容到80ml，得到加倍液。上述植物是雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選是小麥，特別適合小麥品系K35。實(shí)驗(yàn)證明當(dāng)金粉粒度0.6mm、每槍金粉用量lOOug、轟擊距離6cm、轟擊壓力 1300psi時(shí)轉(zhuǎn)化效率高。將花藥為受體轉(zhuǎn)化后得到108個(gè)單倍體植株，經(jīng)過上述加倍處理， 有103株正常結(jié)實(shí)，加倍效率達(dá)到95%。本發(fā)明建立了以花藥為受體的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，對(duì)花藥的離體保濕、基因槍轟擊過程中的花藥粘附固定、制備子彈的金粉粒度、子彈包被效果、轟擊距離以及單倍體染色體加倍等過程進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，可以在當(dāng)代得到基因型純合的植株，加速了轉(zhuǎn)基因后代的純合過程，提高資源創(chuàng)新效率，本發(fā)明不僅對(duì)于小麥基因轉(zhuǎn)化是一個(gè)突破，其中有關(guān)花藥轉(zhuǎn)化的技術(shù)細(xì)節(jié)對(duì)于其他植物的單倍體轉(zhuǎn)化技術(shù)提供了良好的技術(shù)參考。


圖1:pBxl7Gus質(zhì)粒的物理圖譜。
圖2單核靠邊期的花藥。
圖3花藥的預(yù)處理。
圖4轉(zhuǎn)化后的花藥回轉(zhuǎn)培養(yǎng)。
圖5胚狀體的再生。
圖6單倍體的保濕移栽。
圖7加倍后的單倍體植株。
圖8轉(zhuǎn)PCAMBIA1301的小麥籽粒的Gus組織染色，左邊的CK對(duì)照是未轉(zhuǎn)化的K35
花培后代籽粒，右邊是轉(zhuǎn)PCAMBIA1301的K35花培后代籽粒。圖9 轉(zhuǎn)pBxl7Gus (A)和轉(zhuǎn)pCAMBIA1301 (B)的小麥根部Gus組織染色。圖10 轉(zhuǎn)pCAMBIA1301 (A)和轉(zhuǎn)pBxl7Gus (B)的小麥葉片Gus組織染色圖11 轉(zhuǎn)pBxl7Gus質(zhì)粒的小麥籽粒⑶S組織染色，左邊的CK對(duì)照是未轉(zhuǎn)化的K35 花培后代籽粒，右邊是轉(zhuǎn)pBxl7Gus的K35花培后代籽粒。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。 下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。本實(shí)驗(yàn)所用的質(zhì)粒DNA 為 pCAMBIA1301 和 pBxl7Gus，其中 pCAMBIA1301 (GenBank AF234297)購自澳大利亞pCAMBIA公司。pBxl7Gus是由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建完成的具有胚乳特異表達(dá)活性的載體，其構(gòu)建過程如下利用Bxl7啟動(dòng)子的參考序列(Genbank DQ537336)設(shè)計(jì)PCR引物Bxl7F和 Bxl7R，從含有Bxl7亞基的小麥品種煙農(nóng)19中擴(kuò)增得到Bxl7啟動(dòng)子序列，正向引物 Bxl7F堿基組成為AAGTCGACGAGCTCTCCCATCCAATTGA ；反向引物Bxl 7R的堿基組成為 GCACTAGTTCAGTGAACTGTCAGTTGAAT, Bxl7F 的 5/ 端添加 SalI 酶切位點(diǎn)，Bxl7R 的 5/ 端添加SpeI位點(diǎn)。將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證后，用SalI和SpeI完全雙酶切，電泳回收酶切片段與經(jīng)過同樣酶切的pCAMBIA1381Xb (Genbank AF234304)相連接，構(gòu)建完成的載體命名為 pBxl7Gus，具體圖譜見圖1。質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生物，培養(yǎng)基配制所需的無機(jī)鹽購自國藥集團(tuán)，維生素和抗生素以及激素Gus染色所需的藥品購自Sigema公司。金粉及基因槍轉(zhuǎn)化過程中所需的耗材均購自伯樂公司。小麥品系K35是山東省農(nóng)科院作物所自行選育的具有良好花藥培養(yǎng)能力的新種質(zhì)，該材料曾在2007年第1期的山東農(nóng)業(yè)科學(xué)上有過詳細(xì)的介紹，公眾可從山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所獲得。實(shí)驗(yàn)例1、基因槍轉(zhuǎn)化花藥一、花藥的分離與預(yù)處理1,0. 3M甘露醇預(yù)處理液的配制稱取54. 65克分析純甘露醇，溶于IOOOml超純水中，高壓滅菌后，每升加入已經(jīng)抽濾滅菌的頭孢霉素200mg。2、花藥愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配制固體培養(yǎng)基提前三天倒板，每升加入200mg頭孢霉素，倒在3. 5mm培養(yǎng)皿中，檢查培養(yǎng)基平板有無污染，具體配方見表2。3、小麥花藥供體品種為K35，在顯微鏡下觀察花藥發(fā)育時(shí)期，取圖2所示單核靠邊期的花藥(此時(shí)手摸穗部頂端離旗葉葉耳約IOcm)，放入盛有0. 3M甘露醇預(yù)處理液的培養(yǎng)皿中，每皿放置花藥500粒，4°C保存約16小時(shí)。4.在倒好平板的培養(yǎng)皿下邊放上畫有基因槍轟擊圈的白紙，將浸泡完全的花藥從 0. 3M甘露醇預(yù)處理液轉(zhuǎn)移到轟擊圈內(nèi)，見圖3，每皿放500粒花藥，準(zhǔn)備基因槍轉(zhuǎn)化。二、子彈制備及基因槍轉(zhuǎn)化花藥1.金粉母液的制備取0. 6mm和1. Omm的金粉各10mg，分別用70%的乙醇洗3次， 每次IOOOOrpm離心1分鐘，加Iml滅菌水振蕩2分鐘，制成不同粒度、終濃度10ug/ul的金粉貯藏液。2.不同金粉用量的子彈制備將金粉貯藏液充分渦旋，從中分別取30ul、60ul和 lOOul，放入3個(gè)硅化的1. 5ml離心管中，14000rpm離心30秒，棄上清。分別加入50ul的水將金粉懸浮，在震蕩器上邊輕微震蕩邊往里加入lug/ul的質(zhì)粒DNAlOul，再加入新配制的 20ul的0. IM亞精胺，再加入50ul 2. 5M的CaC12，高速蝸旋3分鐘，將離心管放在冰上約2 分鐘讓金粉自動(dòng)沉淀一會(huì)兒，IOOOOrpm離心10秒，去掉上清，加100%酒精750ul，高速蝸旋，然后將離心管放在冰上約2分鐘讓金粉自動(dòng)沉淀一會(huì)兒，IOOOOrpm離心10秒，去掉上清，分別用IOOul無水乙醇懸浮，插到冰上或 放入-20°C冰箱暫時(shí)保存，準(zhǔn)備打槍。每管子彈可打10槍，根據(jù)所取的金粉貯藏液30ul、60ul和IOOul的不同，每槍金粉用量分別為30ug、 60ug 禾口 IOOug03.耗材準(zhǔn)備大載體、阻擋網(wǎng)、可裂片(900psi、IlOOpsi和1300psi)以及實(shí)驗(yàn)所用各種槍頭鑷子在實(shí)驗(yàn)的前一天高壓滅菌消毒，使其充分干燥。基因槍提前半小時(shí)用75% 酒精噴灑消毒，并將大超凈臺(tái)上的通風(fēng)并打開紫外對(duì)操作環(huán)境消毒。4.子彈涂布將預(yù)先制備好的子彈，在高速渦旋器上充分混勻后，取IOul均勻涂布到大載體上，讓其自然干燥5分鐘左右，使酒精完全揮發(fā)。5.基因槍轟擊將氦氣壓力罐打開，根據(jù)表1中的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，調(diào)節(jié)轟擊壓力至所需要的值，將擺放好的花藥放到所需的位置，使花藥正好位于轟擊圈的正下方。放入可裂片、 阻擋網(wǎng)以及涂布子彈后的大載體。關(guān)閉艙門，打開真空機(jī)抽真空，按下基因槍上的vaccum 按鈕，使槍膛里的壓力達(dá)到28，按下shot按鈕，待可裂膜爆裂后，按下Vent按鈕至槍膛里的壓力為零時(shí)，打開艙門，蓋上培養(yǎng)皿的蓋子，將轟擊后的花藥取出。(1)金粉用量和轟擊壓力的確定本實(shí)驗(yàn)首先設(shè)計(jì)3個(gè)轟擊壓力和3個(gè)不同金粉濃度，進(jìn)行九個(gè)處理的實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理轉(zhuǎn)化花藥2000個(gè)，具體轉(zhuǎn)化結(jié)果見表1。從表1的數(shù)據(jù)可以看出，900psi的轟擊壓力下，每槍金粉用量30ug、60ug和IOOug 都沒有得到陽性植株；在轟擊花藥數(shù)目相同的情況下，使用IlOOpsi的轟擊壓力，每槍金粉用量為60ug時(shí)得到3個(gè)陽性植株；每槍金粉用量為IOOug時(shí)，得到5個(gè)陽性植株，其轉(zhuǎn)化效率分別為0. 15%和0. 25% ；而在1300psi的轟擊壓力下，3個(gè)梯度的金粉用量都得到陽性植株，其中每槍用IOOug時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到0. 6%。表1 不同每槍金粉用量和轟擊壓力下的花藥轉(zhuǎn)化效率
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟1)以植物花藥為受體用基因槍法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后的花藥；2)將步驟1)得到的轉(zhuǎn)化后的花藥培養(yǎng)，得到胚狀體，然后將所述胚狀體培養(yǎng)，得到單倍體再生苗。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟1)中，所述基因轉(zhuǎn)化包括如下步驟a)將單核靠邊期的植物花藥浸入0.2-0. 4mol/L的作為粘附劑的甘露醇水溶液中保存，得到基因轉(zhuǎn)化用的受體；所述保存的溫度是2-6°C，所述保存的時(shí)間是16至M小時(shí)；b)用基因槍將子彈針對(duì)步驟a)中得到的受體進(jìn)行轟擊；所述轟擊步驟中，所述受體與所述基因槍的距離為6-9cm，所述轟擊的壓力為900-1300psi。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟b)中，所述子彈的制備方法包括如下步驟用粒徑為0. 6-1. Omm的金粉包被DNA，得到DNA包裹體溶液；將所述DNA包裹體溶液置于冰上1-5分鐘，然后離心取沉淀A ；往所述沉淀A中加無水乙醇振蕩，得到懸浮液，將懸浮液置于冰上1-5分鐘，然后離心取沉淀B ；往所述沉淀B中加無水乙醇得到子彈。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述金粉的粒徑為0.6mm ；所述DNA包裹體溶液置于冰上的時(shí)間以及所述懸浮液置于冰上的時(shí)間均為2分鐘。
5.如權(quán)利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于步驟a)中，所述粘附劑是0.3mol/ L的甘露醇水溶液；所述保存的溫度是4°C，所述保存的時(shí)間是16小時(shí)。
6.如權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于步驟b)中，所述轟擊步驟中，所述受體與所述基因槍的距離為6cm，所述轟擊的壓力為1300psi ；所述轟擊步驟中每一槍的金粉的量是lOOug。
7.如權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中還包括在步驟2)之后的染色體加倍處理，得到雙倍體轉(zhuǎn)基因植物；所述染色體加倍處理是將步驟幻中得到的單倍體再生苗的根部浸泡在加倍液中；所述浸泡步驟中，單倍體再生苗根部是通氣的。
8.如權(quán)利要求7中所述的方法，其特征在于所述浸泡步驟中氣溫是恒溫18°C。
9.如權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述加倍液的配置方法如下先配制 0.4% (質(zhì)量百分比)的秋水仙素母液，取上述母液40ml，加Iml的二甲基亞砜(DMSO)，加水定容到80ml，得到加倍液。
10.如權(quán)利要求1-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物是雙子葉植物或單子葉植物，優(yōu)選是小麥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種以小麥花藥為受體的轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明提供的方法，包括以下步驟1)以植物花藥為受體用基因槍法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化，得到轉(zhuǎn)化后的花藥；2)將步驟1)得到的轉(zhuǎn)化后的花藥培養(yǎng)，得到胚狀體，然后將所述胚狀體培養(yǎng)，得到單倍體再生苗。本發(fā)明建立了以花藥為受體的小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系，對(duì)花藥的離體保濕、基因槍轟擊過程中的花藥粘附固定、制備子彈的金粉粒度、子彈包被效果、轟擊距離以及單倍體染色體加倍等過程進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，可以在當(dāng)代得到基因型純合的轉(zhuǎn)基因植株。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102277385SQ20101020450
公開日2011年12月14日 申請(qǐng)日期2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者何中虎, 夏先春, 李根英, 李玉蓮, 樊慶琦, 郭鳳芝, 隋新霞, 高潔, 黃承彥 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所