專(zhuān)利名稱(chēng)：一種通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)呛瘫究?Gramineae)小麥屬(Tritucum) —年生或多年生草本植物，是世界上廣泛種植、總產(chǎn)量?jī)H次于玉米的重要糧食作物。目前小麥新品種的培育依然主要靠常規(guī)育種。由于常規(guī)雜交育種周期長(zhǎng)、手段單一、種間雜交困難，而且效率較低、預(yù)見(jiàn)性差，致使雜交后代遺傳背景狹窄、選育難度增大，使小麥育種水平難有突破性提高，育種進(jìn)展緩慢。利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥的品種改良是當(dāng)前小麥育種的一個(gè)新方向。其主要手段是指利用生物及物理化學(xué)等手段，將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞以獲得轉(zhuǎn)基因植物的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)。自1983年Zambryski獲得世界上第一株轉(zhuǎn)基因植株以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅猛發(fā)展，這也使得轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)育種成為了可能。它可以打破生殖隔離，使得不同物種間遺傳交流成為可能，為拓寬植物可利用基因庫(kù)創(chuàng)造了條件，彌補(bǔ)了常規(guī)雜交育種的不足， 加速了作物遺傳育種的發(fā)展。目前，幾乎所有的作物都開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究，已發(fā)展的方法有以原生質(zhì)體為受體的PEG法和電激法、離子束介導(dǎo)法、花粉管通道法、基因槍法及農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等。其中， 以農(nóng)桿菌作為媒介的方法由于其簡(jiǎn)單易行，不需昂貴的設(shè)備，成本低，轉(zhuǎn)化頻率高，拷貝數(shù)少，遺傳表達(dá)穩(wěn)定性較好等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到科研工作者的青睞。雙子葉植物是農(nóng)桿菌的天然寄主，利用農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導(dǎo)已經(jīng)將一些外源基因轉(zhuǎn)入雙子葉植物，并建立了多種雙子葉植物的基因轉(zhuǎn)移體系。但由于單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然寄主，加之單子葉植物的外植體再生能力低下、感受態(tài)細(xì)胞缺乏和遺傳轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定等，限制了這一方法在禾本科作物上的應(yīng)用。近年來(lái)對(duì)小麥轉(zhuǎn)基因的研究發(fā)展很快，也取得了一定的成就，但是與水稻、玉米等禾谷類(lèi)作物以及雙子葉植物相比，仍然存在較大的差距。小麥與其他作物相比進(jìn)行轉(zhuǎn)基因育種的特殊難點(diǎn)主要表現(xiàn)在缺乏一種高效的基因?qū)敕椒?。其次，原生質(zhì)體培養(yǎng)和植株再生只限于個(gè)別基因型，且再生植株的遺傳穩(wěn)定性尚不清楚。而且小麥本身是異源六倍體， 其基因組較大并且復(fù)雜，導(dǎo)入外源基因沉默與修飾現(xiàn)象嚴(yán)重。幼穗作為小麥遺傳轉(zhuǎn)化中優(yōu)良的外植體材料，其愈傷組織誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)質(zhì)量均優(yōu)于幼胚。然而，幼穗的遺傳轉(zhuǎn)化也需經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)，這就不可避免地要經(jīng)過(guò)由于單一的轉(zhuǎn)化細(xì)胞而進(jìn)行組織培養(yǎng)獲得再生植株的過(guò)程。為了避免此過(guò)程，將此法結(jié)合活體轉(zhuǎn)化便應(yīng)運(yùn)而生。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸染幼穗轉(zhuǎn)化方法是近年發(fā)展起來(lái)的一種簡(jiǎn)便、快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的非組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因方法。其最大的優(yōu)點(diǎn)在于能直接獲得轉(zhuǎn)化的種子，避開(kāi)了組織培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)，排除了組織培養(yǎng)中因體細(xì)胞變異給目的基因的正確表達(dá)及分子遺傳學(xué)研究帶來(lái)的極為不利的遺傳背景，同時(shí)為一些不易建立遺傳再生體系的作物類(lèi)型提供了基因轉(zhuǎn)移的新途徑。
何道一等將農(nóng)桿菌滴入小麥小花中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，通過(guò)PCR和Southern雜交進(jìn)行分子水平鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)化植株效率為2. 0% 3. 2%。hie等Q009)用農(nóng)桿菌浸泡幼穗的方法成功轉(zhuǎn)化了北美硬紅春小麥Crocus，并能穩(wěn)定表達(dá)外源基因。轉(zhuǎn)化效率為 0.44% 6.8%。然而葉興國(guó)等0011)參考^116等Q009)的方法對(duì)我國(guó)北方冬麥區(qū)輪選 987、科農(nóng)199等多個(gè)當(dāng)前主導(dǎo)冬小麥品種進(jìn)行農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化均未獲得轉(zhuǎn)化籽?；蛑仓辏?說(shuō)明hie等Q009)的方法可能并不適合對(duì)我國(guó)當(dāng)前主導(dǎo)冬小麥品種的遺傳轉(zhuǎn)化，需要依據(jù)我國(guó)小麥的特性進(jìn)行技術(shù)改良。而且，目前利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的幼穗法獲得轉(zhuǎn)基因小麥的轉(zhuǎn)化效率也并不理想，并且所用品種主要是春小麥。因此，迫切需要針對(duì)我國(guó)當(dāng)前主導(dǎo)小麥品種的一種穩(wěn)定、高效、簡(jiǎn)便的獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)包含載有目的基因的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株，用浸染培養(yǎng)基懸浮菌體，其中，用YEB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)到OD6tltl為1. 5 2. 0，離心，沉淀菌體后用浸染培養(yǎng)基懸浮菌體至0D_ = 0. 6 0. 8，所述YEB培養(yǎng)基為，酵母提取物lg/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨 5g/L，蔗糖 5g/L，MgS04 · 7H20 0. 5g/L，ρΗ7· 0 ；2)選取溫室或田間種植的抽穗期小麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，去掉幼穗頂端和末端未發(fā)育好的小穗，剪去小麥生長(zhǎng)錐頂端約1/3，將小麥幼穗浸入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基中1 2min，浸染后用玻璃紙?zhí)状瘢瑫r(shí)防止植株間雜交。選擇幼穗作為轉(zhuǎn)化受體在于能夠直接獲得轉(zhuǎn)化的種子，將小穗頂端剪去約1/3可以使菌液與幼穗小花中的雌蕊充分接觸，提高轉(zhuǎn)化成功率，同時(shí)保留有足夠的穎片也保證了籽粒不會(huì)脫落。根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其中，所述農(nóng)桿菌菌株為 EHA105 或 GV3101。根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其中，所述載體為 PBI121。根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其中，所述浸染培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，添加MES buffer 0. 5mM，乙酰丁香酮(AQ 200 μ M和表面活性劑 Silwet L-77 0. 04% 0. 06%, ρΗ5. 8 6. 0。根據(jù)本發(fā)明的通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其中，所述小麥為冬小麥品種冀麥38或周麥16。根據(jù)本發(fā)明的所述通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其中，所述抽穗期小麥為小麥生長(zhǎng)錐已部分露出且尚未完全從鞘中抽出時(shí)的小麥幼穗。用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥的研究表明T-DNA的插入是一種異源插入，這也就表明轉(zhuǎn)化可能發(fā)生在花發(fā)育的晚期且在胚充分發(fā)育完成之前，而在擬南芥的轉(zhuǎn)化方面，已獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株大都是在開(kāi)花前5-10d進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染的。經(jīng)過(guò)多次試驗(yàn)，我們選擇抽穗期的小麥幼穗，在其生長(zhǎng)錐已有部分露出且尚未完全從鞘中抽出時(shí)進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，不僅獲得了轉(zhuǎn)基因植株，而且大幅度提高了轉(zhuǎn)化效率。
本發(fā)明用農(nóng)桿菌浸染小麥幼穗，成功地將外源基因轉(zhuǎn)入冬小麥中，不需要經(jīng)過(guò)原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)以及植株再生等遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程，從而避免了其它方法的周期較長(zhǎng)、體細(xì)胞變異可能性大、愈傷組織胚再生能力差等缺點(diǎn)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單方便、節(jié)省人力物力，并且轉(zhuǎn)化效率高，可達(dá)26. 3% 82. 3%，浸染后的植株能夠正常生長(zhǎng)、結(jié)實(shí)，這對(duì)于小麥基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實(shí)踐具有重要的意義。


圖 1 為質(zhì)粒 pBI121-0sDREB2. 2 的 T-DNA 區(qū)域。圖2為浸染前的小麥。圖3為獲得的轉(zhuǎn)基因植株的成熟穗部。圖4為0sDREB2. 2轉(zhuǎn)基因植株Ttl代PCR檢測(cè)結(jié)果。1，DNA分子量標(biāo)記；16，陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照pBI121-0sDREB2. 2 ；17，陰性空載體對(duì)照pBI121 ； 15，未侵染野生型小麥品種植株； 14，PCR水；2-13，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Ttl代籽粒植株。箭頭所指為陽(yáng)性目的條帶。圖5為0sDREB2. 2轉(zhuǎn)基因植株T1代PCR檢測(cè)結(jié)果。1，DNA分子量標(biāo)記；14，陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照pBI121-0sDREB2. 2 ；15，陰性空載體對(duì)照pBI121 ； 13，未侵染野生型小麥品種植株； 12，PCR水；2，7-11，為分別來(lái)自不同Ttl代籽粒的T1代植株；3_4，5-6,為分別來(lái)自同一 Ttl代籽粒的不同T1代植株。箭頭所指為陽(yáng)性目的條帶。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)0sDREB2. 2轉(zhuǎn)錄因子基因小麥1.植物材料的準(zhǔn)備將冀麥38、周麥16小麥品種種植于實(shí)驗(yàn)室或大田，正常管理至開(kāi)始抽穗。2.農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化1)分別挑取根癌農(nóng)桿菌EHA105和GV3101單克隆于IOml的LB液體培養(yǎng)基(含相應(yīng)抗生素Rif30mg/ml)中，28°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。幻取過(guò)夜培養(yǎng)菌液2ml接種于50ml LB (含Rif30mg/ml)液體培養(yǎng)基中，28°C振蕩培養(yǎng)至OD6tltl為0. 6 0. 7。3)將菌液分裝至4個(gè)滅菌的IOml管中，冰浴lOmin。然后于4°C，5000rpm，離心 5min。去上清，沉淀用200μ1 20mM冰冷的CaCl2重懸，4°C，5000rpm，離心5min。沉淀用 200 μ 1 20mM冰冷的CaCl2再次重懸，按每管100 μ 1的體積分裝至8個(gè)預(yù)冷的1. 5ml離心管中。4)取重組質(zhì)粒(pBI121_0sDREB2.幻5 μ 1分別與100 μ 1農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 (ΕΗΑ105, GV3101)混勻，液氮速凍^iin后，立即置于37°C水浴中，溫育5min。其中，OsDREB2.2 (實(shí)驗(yàn)室命名)，GenBank Acession No. AY064403 (Oryza sativa DREBlmRNA)，具有抗非生物逆境脅迫功能。5)加入Iml不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基J8°C，150rpm，培養(yǎng)3h。4000rpm離心 30s，去大部分上清，留約IOOul菌液，重懸。6)將 100 μ 1 菌液全部涂于LB平板(30mg/ml Rif，100mg/ml Kan)，倒置培養(yǎng)。 2 3d后長(zhǎng)出單菌落。
3.陽(yáng)性克隆的鑒定挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基(30mg/ml Rif，IOOmg/ ml Kan)中，觀(guān)°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；小量提取質(zhì)粒DNA，以質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。根據(jù)pBI121載體上CaMV 35S啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì)上游引物35S，根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)下游引物0s2.2-R，擴(kuò)增片段496bp。將鑒定的陽(yáng)性克隆保菌于_70°C冰箱中。所用引物序列為，35S:5，-GACGCACAATCCCACTATCC-3，(SEQ ID NO. 1) ；0s2. 2-R :5，-GGGACCAT ACATTGCCCTTGCC-3，(SEQ ID NO. 2)。4.農(nóng)桿菌培養(yǎng)浸染小麥幼穗前3天從_70°C冰箱中取出含有目的基因的農(nóng)桿菌，于含有相應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)，活化培養(yǎng)2天，然后從培養(yǎng)基上挑取單克隆加入2ml含有相應(yīng)抗生素的YEB液體培養(yǎng)基中振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，第二天加入適量YEB液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 他。YEB培養(yǎng)基為，酵母提取物lg/L，牛肉膏5g/L，胰蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L， MgS04 · 7H20 0. 5g/L，調(diào)節(jié) ρΗ7· 0 后滅菌。5.小麥的遺傳轉(zhuǎn)化當(dāng)培養(yǎng)的農(nóng)桿菌OD6tltl達(dá)到1. 5左右時(shí)，4500rpm離心15min收集菌體，棄上清，用浸染培養(yǎng)基重懸沉淀，使最后的0D_達(dá)到0. 6 0. 8。其中，所述浸染培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，添加MES buffer 0. 5mM，乙酰丁香酮200 μ M和表面活性劑Silwet L-77 0.04% 0. 06%, ρΗ5. 8 6. 0。在小麥開(kāi)花前4 7天，去掉幼穗頂端和末端未發(fā)育好的小穗，剪去小麥生長(zhǎng)錐頂端約1/3，將已經(jīng)修剪好的小麥幼穗(圖2、浸入農(nóng)桿菌菌液中1 2min，然后用玻璃紙袋
套袋ο6.轉(zhuǎn)化后的小麥正常管理，收獲種子。種植后取葉片提取DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因植株，檢測(cè)結(jié)果如圖4，轉(zhuǎn)基因植株如圖3。7.對(duì)第二代種子進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證目的基因是否已穩(wěn)定遺傳。實(shí)施例2農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)0sDREB2. 2轉(zhuǎn)錄因子基因小麥的轉(zhuǎn)化率研究對(duì)實(shí)施例1所得植株及其第二代種子進(jìn)行目的基因鑒定，研究目的基因轉(zhuǎn)化和遺傳情況，結(jié)果如表1。可以看出，按轉(zhuǎn)化株數(shù)統(tǒng)計(jì)周麥16的轉(zhuǎn)化率達(dá)92. 3%，冀麥38的轉(zhuǎn)化率達(dá)65. 5% ；按轉(zhuǎn)化籽粒數(shù)統(tǒng)計(jì)目的基因陽(yáng)性率，周麥16為82. 3%，冀麥38為觀(guān).3%。 對(duì)轉(zhuǎn)基因植株各自對(duì)應(yīng)的T1代隨機(jī)抽樣進(jìn)行檢測(cè)均檢測(cè)到陽(yáng)性植株(圖幻，說(shuō)明轉(zhuǎn)化的目的基因得到穩(wěn)定遺傳。用本發(fā)明獲得的轉(zhuǎn)基因小麥轉(zhuǎn)化效率大大提高，并且獲得了較為滿(mǎn)意的遺傳穩(wěn)定性。實(shí)施例3農(nóng)桿菌浸染不同時(shí)期幼穗獲得轉(zhuǎn)0sDREB2. 2轉(zhuǎn)錄因子基因小麥用實(shí)施例1所述方法，在小麥幼穗抽穗期不同階段進(jìn)行農(nóng)桿菌浸染，結(jié)果如表2所示。從表2可知，在小麥幼穗未出鞘前進(jìn)行浸染，小麥發(fā)育異常，不能結(jié)籽；在幼穗部分出鞘時(shí)進(jìn)行浸染，小麥發(fā)育正常，結(jié)籽，并且可以獲得轉(zhuǎn)基因植株。表ITtl代轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于，包括以下步驟1)培養(yǎng)包含載有目的基因的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株，用浸染培養(yǎng)基懸浮菌體；2)選取抽穗期小麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，去掉幼穗頂端和末端未發(fā)育好的小穗，剪去小麥小穗頂端1/3，將小麥幼穗浸入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于，所述農(nóng)桿菌菌株為EHA105或GV3101。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于，所述表達(dá)載體為PBI121。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于，所述小麥為冬小麥品種冀麥38或周麥16。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于，所述浸染培養(yǎng)基為以MS為基本培養(yǎng)基，添加MES緩沖液0. 5mM,乙酰丁香酮200 μ M和表面活性劑 Silwet L-77 0. 04%~ 0. 06%, ρΗ5. 8 6. 0。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，其特征在于，所述抽穗期小麥為小麥生長(zhǎng)錐已部分露出且尚未完全從鞘中抽出時(shí)的小麥幼穗。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物轉(zhuǎn)基因工程領(lǐng)域，具體地，涉及一種通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法。本發(fā)明的通過(guò)農(nóng)桿菌浸染幼穗獲得轉(zhuǎn)基因小麥的方法，包括以下步驟1)培養(yǎng)包含載有目的基因的表達(dá)載體的農(nóng)桿菌菌株，用浸染培養(yǎng)基懸浮菌體；2)選取抽穗期小麥進(jìn)行轉(zhuǎn)化，去掉幼穗頂端和末端未發(fā)育好的小穗，剪去小麥小穗頂端約1/3，將小麥幼穗浸入含農(nóng)桿菌的浸染培養(yǎng)基中。本發(fā)明操作簡(jiǎn)單方便、節(jié)省人力物力，并且轉(zhuǎn)化效率高，可達(dá)26.3％～82.3％，浸染后的植株能夠正常生長(zhǎng)、結(jié)實(shí)，這對(duì)于小麥基因工程方面的理論研究以及遺傳育種實(shí)踐具有重要的意義。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102559746SQ201110418620
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月15日
發(fā)明者劉桂茹, 張貴友, 楊學(xué)舉, 溫樹(shù)敏, 王維, 郎明林 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)