專利名稱:冬蟲夏草無性階段固體發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及冬蟲夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)無性階段的固體發(fā)酵工藝，特別是中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)的固體發(fā)酵工藝。
技術(shù)背景冬蟲夏草是一種名貴的菌類中藥材，是麥角菌科蟲草屬的一個種，寄生于蝙蝠蛾科幼蟲體上完成的有性階段。由于冬蟲夏草是嗜低溫菌，寄生于只生長在3500-5000公尺高原草甸的蟲草蝙蝠蛾幼蟲，故難以人工培養(yǎng)。自二十世紀八十年代以來，對冬蟲夏草的研究逐漸增多，1984年陳慶濤先生認為中國擬青霉Paeciomyces sinensis Chen，Xiao et Shi.是冬蟲夏草的無性階段(陳慶濤等1984，中國擬青霉新種與蟲草的關系。真菌學報324-28)，沈南英認為冬蟲夏草頭孢菌(Cephalospores DongchongxiacaeSp.nev)是冬蟲夏草的無性階段(沈南英＜人工培養(yǎng)冬蟲夏草)申請?zhí)?5101971)通過無性階段的人工發(fā)酵，也得到了成分與野生冬蟲夏草類似的物質(zhì)。
本發(fā)明人在公開號為1031393的專利文件中公開了冬蟲夏草無性階段中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)，其保藏號為CCTCCNo.M87101，還公開了其培養(yǎng)方法，并在文獻中公開了該菌株的菌學特征(劉錫琎等，冬蟲夏草無性階段的分離和鑒定，真菌學報，1988，8(1)，35-40)。
現(xiàn)有的冬蟲夏草發(fā)酵工藝多采用液體發(fā)酵工藝，如本發(fā)明人在公告號為CN 1036531C的“冬蟲夏草深層發(fā)酵工藝”專利公開了冬蟲夏草無性階段中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)的發(fā)酵工藝等。
在液體發(fā)酵工藝中，出罐的發(fā)酵液經(jīng)板框壓濾后，菌絲體部分(固體部份)經(jīng)干燥、粉碎后，作為生產(chǎn)制劑的原料。所得的固體菌絲體部分除了冬蟲夏草的代謝產(chǎn)物外，還含有非活性物質(zhì)，即真菌尚未利用的培養(yǎng)基和菌絲體的細胞壁；而經(jīng)板框壓濾后的液體部分目前多數(shù)生產(chǎn)廠家是以廢液形式排放。由于冬蟲夏草真菌的代謝產(chǎn)物一部份在菌絲體的細胞內(nèi)，另一部份溶解于發(fā)酵液菌絲體外的水中，這些水溶液中含有活性成分，因而如將壓濾后的溶液全部作為廢液排放，將會導致了冬蟲夏草菌絲體的胞外功效成分全部損失。同時，未經(jīng)處理的發(fā)酵液中尚含有發(fā)酵菌株的孢子、菌絲體及殘留的培養(yǎng)基，含有以上物質(zhì)的發(fā)酵液的排放將污染環(huán)境?，F(xiàn)有對發(fā)酵液進行處理的方法主要有兩種一種方法為增加膜提取設備，其原理為當膜孔徑小于溶解于發(fā)酵液溶劑水中的功效物質(zhì)分子時，水分子能通過膜，功效物質(zhì)由于不能通過而被截留。另一種方法為增加污水處理設備。無論是用膜設備還是用污水處理設備都要增加投資，從而增加原料成本。
此外，液體發(fā)酵工藝得率低，一般是1.5-2.0％左右；液體發(fā)酵的后處理為出罐、板框壓濾(發(fā)酵液或用膜設備處理，或經(jīng)污水處理)、制粒、干燥、粉碎備用，因而存在工藝復雜，工序繁多，容易污染，消耗能量大，設備投資大的缺點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服冬蟲夏草無性階段液體發(fā)酵菌絲體功效成分損失大，得率低，工藝復雜，工序繁多，容易污染，消耗能量和設備投資大的缺陷。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為提供冬蟲夏草無階段菌株的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于包括a、以中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)保藏號為CCTCC No.M87101的菌株為發(fā)酵菌種進行發(fā)酵培養(yǎng)；b、固體發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)；c、菌絲體出罐。
上述固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，步驟a所述的菌種培養(yǎng)由菌種斜面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)、液體擴大培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐培養(yǎng)組成。
上述固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，步驟b所述的固體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)料為蔗糖60-70％，酵母15-25％，蠶蛹粉汁10-15％，0.5‰硫酸鎂(重量比)和1.0‰磷酸二氫鉀(重量比)，所述百分比為重量百分比。
上述固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝步驟b所述的固體發(fā)酵罐生產(chǎn)的接種量與培養(yǎng)料的重量百分比為10-15％，優(yōu)選為10％；發(fā)酵溫度為18±2℃；通氣量體積比為1∶1-2，優(yōu)選為1∶1；轉(zhuǎn)速為2-20rpm，優(yōu)選為2rpm；發(fā)酵時間為96-144小時，優(yōu)選為96小時。
本發(fā)明的有益效果是液體發(fā)酵得率一般為1.5-2.0％，固體發(fā)酵工藝產(chǎn)品得率增加非常明顯，達到20-40％；同時固體發(fā)酵無發(fā)酵液排放，不存在污染環(huán)境的問題，既節(jié)省了排污設備的費用，又提高了發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量；并且固體發(fā)酵的后處理非常簡單，菌絲體出罐后僅需干燥粉碎即可。
具體實施方式
冬蟲夏草無性階段固體發(fā)酵工藝具體說明1、斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為麩皮30g、蛋白胨10g、奶粉10g、蠶蛹粉3g、維生素10mg、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1.0g、瓊脂20克、H2O 1000ml，pH6.5。
將中國被毛孢菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，在15-18℃的條件下培養(yǎng)15-40天。
2、液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基麩皮30g、奶粉10g、蠶蛹粉汁3g、牛肉汁10g、維生素10mg、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1.0g、水1000ml。培養(yǎng)液pH6.5。
培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，體積為三角瓶的1/3左右，滅菌放置于搖床中，在18±2℃的溫度下，100-150次/分鐘搖床上振動培養(yǎng)120-160小時，再進行擴大培養(yǎng)。
3、液體擴大培養(yǎng)條件同上述的液體培養(yǎng)。
4、種子罐培養(yǎng)液體培養(yǎng)基麩皮30Kg、奶粉10Kg、蠶蛹粉汁3Kg、酵母10Kg、維生素10g、硫酸鎂0.5Kg、磷酸二氫鉀1Kg、水10001Kg，培養(yǎng)料PH為6.5-7.0，接種量與培養(yǎng)料的的重量百分比為1-5％，溫度18±2℃，通氣量的體積百分比為1∶0.8-1.5的條件下，連續(xù)發(fā)酵96小時。此時菌絲體生長旺盛，經(jīng)鏡檢無雜菌污染，可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐生產(chǎn)。
5、發(fā)酵罐生產(chǎn)培養(yǎng)基蔗糖60-70％，酵母15-25％，蠶蛹粉汁10-15％，硫酸鎂0.5‰(重量比)和磷酸二氫鉀1.0‰(重量比)，pH值為6.5-7.0，所述百分比為重量百分比。
接種量與培養(yǎng)料的重量百分比10-15％，溫度18±2℃，通氣量的體積比為1∶1-2(V/V)，轉(zhuǎn)速為2-20rpm的條件下，連續(xù)發(fā)酵96-144小時。
中間檢驗當發(fā)酵48小時后每隔16小時進行一次中間檢驗，主要檢測還原糖，氨態(tài)氮及有否雜菌污染；還原糖下降到1％(重量百分比)濃度以下，氨態(tài)氮0.1％(重量百分比)以下，無雜菌污染的情況下，鏡檢發(fā)酵菌已產(chǎn)生大量分生孢子梗及分生孢子時，就可以出罐。
顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細說明。但不應將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
實施例冬蟲夏草菌種菌種保藏號為CCTCC No.M87101的中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.)。
1、斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基為麩皮30g、蛋白胨10g、奶粉10g、蠶蛹粉3g、維生素10mg、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1.0g、瓊脂20克、H2O 1000ml，pH6.5。
將中國被毛孢菌株接種于斜面培養(yǎng)基上，在15-18℃的條件下培養(yǎng)15-40天。
2、液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)基麩皮30g、奶粉10g、蠶蛹粉汁3g、牛肉汁10g、維生素10mg、硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1.0g、水1000ml。培養(yǎng)液pH6.5。
培養(yǎng)基分裝于三角瓶中，體積為三角瓶的1/3左右，滅菌放置于搖床中，在18±2℃的溫度下，100-150次/分鐘搖床上振蕩培養(yǎng)120-160小時，再進行擴大培養(yǎng)。
3、液體擴大培養(yǎng)條件同上述的液體培養(yǎng)。
4、種子罐培養(yǎng)液體培養(yǎng)基麩皮30Kg、奶粉10Kg、蠶蛹粉汁3Kg、酵母10Kg、維生素10g、硫酸鎂0.5Kg、磷酸二氫鉀1Kg、水1000Kg，培養(yǎng)料PH為6.5-7.0，接種量與培養(yǎng)料的重量百分比為1-5％，溫度18±2℃，通氣量的體積比為1∶0.8-1.5的條件下，連續(xù)發(fā)酵96小時。此時菌絲體生長旺盛，經(jīng)鏡檢無細菌污染，可轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐生產(chǎn)。
5、固體罐發(fā)酵(1)配置培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分蔗糖66.85％，酵母20％，蠶蛹粉汁13％，硫酸鎂0.5‰(重量比)，磷酸二氫鉀1.0‰(重量比)，pH值為6.5-7.0，所述百分比為重量百分比。
將上述培養(yǎng)基放置于固體發(fā)酵罐內(nèi)。
(2)培養(yǎng)料高壓滅菌在壓力為0.15Mpa，溫度為126℃的條件下持續(xù)滅菌30分鐘。
(3)接種滅菌后培養(yǎng)基冷卻至22℃左右，用火焰接種法接入液體菌種，接種量與培養(yǎng)料的重量百分比為10％。
(4)發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵溫度18±2℃；轉(zhuǎn) 速2rpm；通氣量的體積比為1∶1；發(fā)酵時間96小時。
中間檢驗當發(fā)酵48小時后每隔16小時進行一次中間檢驗，主要檢測還原糖，氨態(tài)氮及有否雜菌污染；當PH下降至4.5-5.0，還原糖1％(重量百分比)以下，氨態(tài)氮0.1％(重量百分比)以下，無雜菌污染的情況下，鏡檢發(fā)酵菌已產(chǎn)生大量分生孢子梗及分生孢子時，就可以出罐。
(5)后處理發(fā)酵完成后將菌絲體取出發(fā)酵罐，然后菌絲體經(jīng)干燥、粉碎、檢驗、包裝備用。
本實施例固體發(fā)酵工藝產(chǎn)品得率為40％；同時固體發(fā)酵無發(fā)酵液排放，不存在污染環(huán)境的問題，既節(jié)省了使用排污設備的費用，又提高了發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量。
權(quán)利要求
1.一種蟲草的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于包括a、以中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et zeng.)保藏號為CCTCC No.M87101的菌株為發(fā)酵菌種，進行菌種培養(yǎng)；b、固體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；c、菌絲體出罐。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟a所述菌種培養(yǎng)由菌種斜面培養(yǎng)、液體振蕩培養(yǎng)、液體擴大培養(yǎng)和種子發(fā)酵罐培養(yǎng)組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟b所述固體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)料為蔗糖60-70％，酵母15-25％，蠶蛹粉汁10-15％，0.5‰硫酸鎂(重量比)和1.0‰磷酸二氫鉀(重量比)，所述百分比為重量百分比。
4.根據(jù)權(quán)利要求
3所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的固體發(fā)酵罐培養(yǎng)的培養(yǎng)料的PH值為6.5-7.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟b所述固體發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量與培養(yǎng)料的重量百分比為10-15％。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟b所述固體發(fā)酵罐培養(yǎng)的發(fā)酵溫度為18±2℃。
7.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的中固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟b所述固體發(fā)酵罐培養(yǎng)的通氣量體積比為1∶1-2。
8.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟b所述固體發(fā)酵罐培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為2-20rpm。
9.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于步驟b所述固體發(fā)酵罐培養(yǎng)的時間為96-144小時。
專利摘要
本發(fā)明提供了一種蟲草的固體發(fā)酵生產(chǎn)工藝，其特征在于以中國被毛孢(Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et zeng.)保藏號為CCTCC No.M87101的菌株為發(fā)酵菌種，進行菌種培養(yǎng)；再經(jīng)固體發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；最后，發(fā)酵完成后菌絲體出罐。本發(fā)明發(fā)酵工藝產(chǎn)品得率為20－40％；同時固體發(fā)酵無發(fā)酵液排放，不存在污染環(huán)境的問題，既節(jié)省了排污設備的費用，又提高了發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量；并且固體發(fā)酵的后處理非常簡單，菌絲體出罐后僅需干燥粉碎即可。
文檔編號C12N1/14GKCN1513976SQ03135622
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月19日
發(fā)明者俞永信 申請人:成都思摩納米技術(shù)有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan