專利名稱:微囊藻毒素檢測芯片、試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微囊藻毒素檢測芯片，本發(fā)明還涉及具有該檢測芯片的試劑盒及應(yīng)用該試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測的方法。
背景技術(shù)：
藍(lán)藻又名“藍(lán)綠藻”，在一些營養(yǎng)豐富的水體中，某些藍(lán)藻常于夏季大量繁殖形成 “水華”。在引起水質(zhì)惡化的同時，某些“水華”種類還會產(chǎn)生具有生物毒性的次生代謝產(chǎn)物， 稱為“藍(lán)藻毒素”。這些藍(lán)藻毒素的釋放直接對魚類、人畜產(chǎn)生危害。藍(lán)藻毒素依據(jù)其最終導(dǎo)致的病癥的不同可以分為四大類神經(jīng)毒素、肝毒素、細(xì)胞毒素以及刺激性毒素(irritant toxins) 0在這四類毒素中，肝毒素即微囊藻毒素(microcystin)對公眾的健康危害最大， 嚴(yán)重的會引起其死亡。因此，圍繞如何檢測、控制和消除藍(lán)藻毒素，各國的科學(xué)工作者開展了大量的研究工作。
對于微囊藻毒素的檢測，早期通過構(gòu)建相應(yīng)的生物模型進(jìn)行生物毒性實驗以檢測水體中是否有藍(lán)藻毒素存在。然而，較低的靈敏度、較高的實驗耗費以及生物毒性實驗帶來的一系列倫理問題，使得人們不得不選擇別的方法來對毒素進(jìn)行診斷。隨著微量樣品分析儀器(如，HPLC、MALDI-T0F)的發(fā)展，依托這些儀器開發(fā)出多種用于檢測自然水體中藍(lán)藻毒素的方法。這些方法分析過程簡單快捷并且具有很高的靈敏度。然而，由于分析儀器對樣品的前處理有著很高的要求，因此在實際運用中，樣品的處理變得既費時又費力，并且昂貴的分析儀器和標(biāo)準(zhǔn)品也使得許多實驗室無法開展對藍(lán)藻毒素的診斷。同時，依靠免疫學(xué)和生物化學(xué)的方法開發(fā)出的診斷手段也逐漸運用于實驗室或自然環(huán)境水體中藍(lán)藻毒素的檢測。 如，對肝毒素(microcystin和nodularin)進(jìn)行檢測的ELISA方法、比色法(蛋白磷酸酶抑制劑)和細(xì)胞毒性診斷。然而，前述多種診斷方法，均以釋放至水體中的微囊藻毒素為檢測對象，不能在毒素從藻細(xì)胞內(nèi)釋放到水體之前對其進(jìn)行預(yù)判斷。無法通過這些方法對潛在的產(chǎn)毒微囊藻進(jìn)行預(yù)檢。從而降低了生物監(jiān)測的時效性，大大影響有害藻華的監(jiān)測/預(yù)警。 類似的公開文獻(xiàn)可以參考專利號為ZL200310109105. 2的中國發(fā)明專利《水中痕量微囊藻毒素的檢測方法》(授權(quán)公告號CN100387985C)；申請?zhí)枮?00710070274. 8的中國發(fā)明專利申請公開《水體中微囊藻毒素的檢測方法》(公開號101169414A)；還可以參考《水生生物學(xué)報》2003年04期，第27卷第4期中王曉峰等所著的“用蛋白磷酸酶抑制法比色法檢測水中微囊藻毒素類物質(zhì)”。
近年來，隨著生物芯片技術(shù)的日趨成熟，高效、快速、準(zhǔn)確、靈敏的生物芯片被應(yīng)用到越來越多的領(lǐng)域如基因序列分析、雜交、基因突變檢測及多態(tài)性分析、基因分型、疾病檢測、食品微生物檢測等；該技術(shù)可同時將大量不同的探針固定于同一支持物上，因而可以一次性對同一樣品進(jìn)行大量序列檢測和核酸分析；運用生物芯片技術(shù)可以克服其它常用傳統(tǒng)技術(shù)存在的問題，滿足在實際檢測工作中的快速、高通量、自動化檢測的要求；鑒于生物芯片的這些優(yōu)點，國內(nèi)外已經(jīng)先后開發(fā)了多種生物芯片用于基因突變及多態(tài)性分析、基因插入或缺失、臨床診斷、微生物鑒別等多個領(lǐng)域。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對上述的技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種具有特異性探針的微囊藻毒素檢測芯片。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種具有特異性探針的微囊藻毒素檢測芯片的試劑盒。
本發(fā)明所要解決的又一個技術(shù)問題是提供一種高通量、高靈敏度的微囊藻毒素檢測方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為一種微囊藻毒素檢測芯片，包括基片及結(jié)合于基片上的探針，其特征在于所述的探針為六條，分別包括如下基因序列
g、5，_TTTTTTTTTTTTTTTGTTCCTGTGCCRTGAGCTTC_-3，；[0010]h、5，_TTTTTTTTTTTTTTTTGACCAAGTAATCCCAGAAC_-3，；[0011]i、5，_TTTTTTTTTTTTTTTCTTGAGTCATTTCGGGTTGG_-3，；[0012]j、5，_TTTTTTTTTTTTTTTATTCGGGACGATTGAGGTAT_-3，；[0013]k、5，_TTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAACGGATTGGAGA_3，；[0014]1、5，_TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAAGGATTAGGCACA_-3，。
一種具有上述的微囊藻毒素檢測芯片的試劑盒。該試劑盒還具有核酸提取劑、雜交液。
一種利用上述的試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測的方法，其特征在于包括如下步驟
①樣品DNA提取將水樣離心，棄上清，以核酸提取劑結(jié)合吸附柱法提取離心所得水樣中宏基因組的DNA;
②雜交將雜交液溶化后和宏基因組DNA混勻，變性后，冰浴，把芯片放入雜交盒， 蓋上蓋片，通過加樣孔注入變性冰浴后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中雜交；
③清洗雜交完的芯片通過洗干儀清洗并離心；
④芯片掃描及結(jié)果判讀清洗后離心的芯片通過微陣列芯片掃描儀，并對結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測結(jié)果。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于微囊藻毒素檢測芯片與微陣列芯片掃描儀和微囊藻毒素檢測芯片檢測系統(tǒng)配套使用。進(jìn)行檢測時，將富集后的樣品宏基因組DNA置于芯片上，當(dāng)目標(biāo)DNA與特異性探針結(jié)合時，通過檢測各檢測位點的熒光情況對目標(biāo)水體中是否存在微囊藻毒素基因進(jìn)行定性分析。芯片具有多組微囊藻合成基因的特異性探針， 通過多組探針的相互矯正達(dá)到對水體中微囊藻毒素進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測的目的；其次，由于一張芯片上可以點4個探針陣列，每個陣列可以檢測一個樣本，因此可以同時檢測4個來自于不同采集地的樣本，達(dá)到快速檢測多個樣品的目標(biāo)，同時，也可以一次性對某個樣本進(jìn)行 4次的重復(fù)，對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性進(jìn)行快速校正；結(jié)合生物芯片和分子雜交技術(shù)，剔除了繁瑣的PCR擴增，縮短了檢測時間，可以高通量、高靈敏度的快速進(jìn)行檢測。


圖1為實施例中芯片結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
①樣品DNA提取將水樣離心，棄上清，以核酸提取劑結(jié)合吸附柱法提取離心所得水樣中宏基因組的DNA
②雜交將雜交液溶化后和宏基因組DNA混勻，變性后，冰浴，把芯片放入雜交盒， 蓋上蓋片，通過加樣孔注入變性冰浴后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中雜交；
③清洗雜交完的芯片通過洗干儀清洗并離心；
④芯片掃描及結(jié)果判讀清洗后離心的芯片通過微陣列芯片掃描儀，并對結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測結(jié)果。
其中，核酸提取劑恥丨(^61^，仏5]公司生產(chǎn)的!^8丨0嫩spin kit。雜交儀、洗干儀和掃描儀三部分共同構(gòu)成微囊藻水華檢測芯片檢測分析系統(tǒng)，雜交儀、洗干儀和掃描儀均為博奧生物有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品型號分別為晶芯 Biamixer Π芯片雜交儀、晶芯 Slide Washer 8芯片洗干儀和晶芯 LuxScan 10K-A微陣列芯片掃描儀。
雜交液是不包含變性產(chǎn)物(宏基因組DNA)的雜交液，由多種試劑配制的混合溶液以用于芯片的雜交過程。具體的組成比例如下(以SyL為例)
權(quán)利要求
1.一種微囊藻毒素檢測芯片，包括基片及結(jié)合于基片上的探針，其特征在于所述的探針為六條，分別包括如下基因序列a、5，-TTTTTTTTTTTTTTTGTTCCTGTGCCRTGAGCTTC-3，；b、5，-TTTTTTTTTTTTTTTTGACCAAGTAATCCCAGAAC-3，； C、5，-TTTTTTTTTTTTTTTCTTGAGTCATTTCGGGTTGG-3，；d、5，-TTTTTTTTTTTTTTTATTCGGGACGATTGAGGTAT-3，；e、5，-TTTTTTTTTTTTTTTTTACTAAACGGATTGGAGA-3，；f、5，-TTTTTTTTTTTTTTTCATTCAAAGGATTAGGCACA-3，。
2.一種具有權(quán)利要求
1所述的微囊藻毒素檢測芯片的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2所述的試劑盒，其特征在于該試劑盒還具有核酸提取劑、雜交液。
4.一種利用權(quán)利要求
2所述的試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測的方法，其特征在于包括如下步驟①樣品DNA提取將水樣離心，棄上清，以核酸提取劑結(jié)合吸附柱法提取離心所得水樣中宏基因組的DNA ；②雜交將雜交液溶化后和宏基因組DNA混勻，變性后，冰浴，把芯片放入雜交盒，蓋上蓋片，通過加樣孔注入變性冰浴后的雜交液，蓋緊雜交盒蓋，于雜交儀中雜交；③清洗雜交完的芯片通過洗干儀清洗并離心；④芯片掃描及結(jié)果判讀清洗后離心的芯片通過微陣列芯片掃描儀，并對結(jié)果進(jìn)行判讀，給出檢測結(jié)果。
專利摘要
一種微囊藻毒素檢測芯片，包括基片及結(jié)合于基片上的探針，所述的探針為根據(jù)微囊藻毒素合成基因簇中六個保守區(qū)域序列涉及的六個特異性探針。本發(fā)明還公開了具有該檢測芯片的試劑盒及利用該試劑盒進(jìn)行微囊藻毒素檢測的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于結(jié)合生物芯片和分子雜交技術(shù)，剔除了繁瑣的PCR擴增，縮短了檢測時間，可以高通量、高靈敏度的快速進(jìn)行檢測。
文檔編號C12Q1/68GKCN102199670SQ201110115612
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月28日
發(fā)明者嚴(yán)婷婷, 嚴(yán)小軍, 朱鵬, 游玉容, 陳海敏 申請人:寧波大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan