專利名稱:葡萄糖氧化酶突變基因及其表達和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及葡萄糖氧化酶基因，尤其涉及密碼子優(yōu)化后的葡萄糖氧化酶突變基 因，本發(fā)明還涉及該葡萄糖氧化酶突變基因在制備葡萄糖氧化酶中的應(yīng)用，屬于葡萄糖氧 化酶的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase，簡稱GOD)學(xué)名為β _D_葡萄糖氧化還原酶 (EC1. 1.3. 4)，它能專一地將β-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫(Pluschkell S， Hellmuth K and Rinas U， Kinetics of glucose oxidase excretion by recombinant Aspergillus niger. Biotechnology and bioengineering，1996，51 :215_220.)。GOD 廣泛 應(yīng)用于食品、飼料、醫(yī)藥等許多相關(guān)領(lǐng)域(Brnkar SBiBule MViSinghal RS，et al. ,Glucose oxidase-An overview. Biotechnol Adv，2009)o
GOD在食品工業(yè)中主要作用在于除葡萄糖、除氧、形成過氧化氫、形成葡萄糖酸四 個方面。目前，許多國家已將GOD作為公認的安全抗氧劑而廣泛應(yīng)用于各種食品和食品加 工工藝中，例如用于酒類除氧、蛋白脫糖、食品包裝、果蔬及制品的保鮮等(Malherbe D， Du Toit M， Cordero Otero R， et al. ， Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in Saccharomyces cerevisiae and its potential applications in wine production.)。
GOD還可作為綠色面粉改良劑及添加劑逐漸替代化學(xué)添加劑在面粉及制品的改良 行業(yè)中發(fā)揮重要作用。溴酸鉀在焙烤業(yè)中已有八十多年的應(yīng)用歷史，它作為氧化劑成功地 賦予焙烤制品所必需的面筋強度及彈性，但是溴酸鉀對人體具有很大的危害作用，所以有 必要尋找一種安全的、可以替代溴酸鉀功能的添加劑。葡萄糖氧化酶在氧化過程中產(chǎn)生的 過氧化氫能夠氧化面筋蛋白中的巰基，形成二硫鍵，進而改善面團的網(wǎng)絡(luò)結(jié)果，增強了面團 彈性。能夠起到化學(xué)添加劑(溴酸鉀等)相同的效果，同時避免了化學(xué)添加劑對人體造成 的損害。目前已經(jīng)在小麥粉和玉米粉中通過添加葡萄糖氧化酶而提高了面粉的筋力，改善 了面包等食品的手感和形狀，提高了產(chǎn)品質(zhì)量(中國專利申請公開號CN 1748515A ；發(fā)明 名稱一種含有葡萄糖氧化酶和過氧化物酶的抗凍發(fā)酵冷凍面團及其生產(chǎn)方法)。
在醫(yī)藥方面，GOD作為試劑盒、酶電極等用于血清(漿)、尿液及腦脊液中葡萄糖 的體外定量分析；GOD制成的酶制劑還可用于除去或緩解牙斑、牙垢和齲齒的形成防止口 腔疾病和牙病的發(fā)生。此外，由于可以催化生成H2O2，還可用于對H2O2敏感的淋巴瘤的導(dǎo) 向目標(biāo)的治療(Vodopivec M, Berovi M, Jan ar J, et al. , Application of Convective Interaction Media disks with immobilised glucose oxidase for on-line glucose measurements. Analytica Chimica Acta,2000,407 :105_110·)。
近幾年，GOD作為一種新型的酶飼料添加劑，已被農(nóng)業(yè)部列為12種允許使用的飼 料酶制劑添加劑之一開始在畜牧、飼料行業(yè)上應(yīng)用。在飼料中添加葡萄糖氧化酶能夠清除 牲畜腸道上皮細胞大量自由基，保護腸道上皮細胞的完整。葡萄糖氧化酶通過不斷的催化葡萄糖生成葡萄糖酸，降低胃腸道的PH值，偏酸性環(huán)境有利于益生菌的生長增殖，從而抑 制了病原微生物的存活，提高了牲畜的自身免疫力。除此之外，由于葡萄糖氧化酶在氧化 葡萄糖過程中會產(chǎn)生過氧化氫，當(dāng)過氧化氫積累到一定濃度時，可以抑制大腸桿菌、沙門氏 菌、巴氏桿菌、葡萄球菌、弧菌等病原菌的生長繁殖，并且這種抑菌作用不會產(chǎn)生菌體抗藥 性。隨著葡萄糖氧化酶制備提純工藝的不斷發(fā)展完善，使用成本的不斷降低，葡萄糖氧化酶 將在飼料行業(yè)中發(fā)揮越來越重要的作用(李焰，葡萄糖氧化酶飼養(yǎng)肉雞效果試驗.龍巖師 專學(xué)報，2004，22 77-78.)。
GOD的應(yīng)用已擴展到紡織品行業(yè)。紡織品在生產(chǎn)過程中需要用到大量的雙氧水，即 過氧化氫，葡萄糖氧化酶在作用過程中產(chǎn)生的過氧化氫可以用于紡織工業(yè)的漂白處理。采 用具有高回收率的固定化的葡萄糖氧化酶生產(chǎn)過氧化氫，過氧化氫濃度可達3. 5g/L，處理 時不需添加雙氧水穩(wěn)定劑，處理后織物手感柔軟、豐滿。并且處理后固定化葡萄糖氧化酶可 以回收，再用到下批產(chǎn)品的處理中，因而可以有效降低紡織工業(yè)的生產(chǎn)成本，并提高紡織物 的品質(zhì)。中國作為紡織品生產(chǎn)和消費大國，葡萄糖氧化酶在此行業(yè)中的應(yīng)用具有很好的前 景(中國專利申請公開號CN 1884682A，陳堅，閻賀靜，堵國成，華兆哲，發(fā)明名稱一種應(yīng) 用葡萄糖氧化酶制劑的棉織物酶法煮煉的方法)。
GOD在生物界分布廣泛，最先于1904年在黑曲霉和灰綠青霉中發(fā)現(xiàn)，目前研究 的葡萄糖氧化酶主要來源于霉菌類微生物和昆蟲體內(nèi)，在細菌如弱氧化醋酸菌中也存在 (Murray FR, Llewellyn DJ, Peacock WJ, et al. , Isolation of the glucose oxidase gene from Talaromyces flavus and characterisation of its role in the biocontrol of Verticillium dahliae. Curr Genet，1997，32 :367_375.)。但其工業(yè)上一般采用黑 曲霉和青霉屬菌株作生產(chǎn)菌。但黑曲霉和青霉菌天然菌株在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生過氧化 氫酶，纖維素酶，淀粉酶等其他多種副產(chǎn)物(Frederick K, Tung J, Emerick R，et al., Glucose oxidase from Aspergillus niger. Cloning, gene sequence, secretion from Saccharomyces cerevisiae and kinetic analysis of a yeast-derived enzyme. Journal of Biological Chemistry，1990，265 :3793.)，大量的雜蛋白對后期的分離純化 工作造成很大的困難，也增加了成本。此外，天然霉菌生產(chǎn)過程中酶蛋白的生物合成受葡 萄糖的誘導(dǎo)和高濃度葡萄糖的分解代謝產(chǎn)物的阻遏，而發(fā)酵過程中產(chǎn)生的GOD能氧化培 養(yǎng)基中的葡萄糖生成葡萄糖酸，葡萄糖酸對酶的合成也具有抑制作用。為了解決這一問 題，近年來利用基因工程菌重組表達葡萄糖氧化酶受到研究人員的青睞。Whittington H 在釀酒酵母中表達了來源于黑曲霉的GOD基因，獲得了具有生物學(xué)活性的葡萄糖氧化酶 (Whittington H,Kerry-Williams S,Bidgood K,et al. ,Expression of the Aspergillus niger glucose oxidase gene in A. niger,A. nidulans and Saccharomyces cerevisiae. Curr Genet, 1990,18 531-536.)；母敬郁等采用瑞氏木霉表達了黑曲霉來源的葡萄糖氧 化酶基因，產(chǎn)量為25U/ml (母敬郁，王嶠，楊純中，瑞氏木霉表達黑曲霉葡萄糖氧化酶.， 生物工程學(xué)報，2006，22 =82-86.)；周亞鳳和張先恩等人將黑曲霉來源的葡萄糖氧化酶基 因在畢赤酵母中進行了重組表達，誘導(dǎo)后發(fā)酵液酶活為30-40U/ml (Zhou YF, Zhang XE, Liu H, et al. , Cloning and expression of Aspergillus niger glucose oxidase gene in methylotrophic yeast. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao,2001,17 :400_405·) ；Silvia Crognale也在畢赤酵母中成功表達青霉來源的葡萄糖氧化酶，產(chǎn)量為50U/ml (SilviaCrognale,Valentina Pulci and Brozzoli V,Expression of Penicillium νarlabile Ρ16 glucose oxidase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Enzyme and Microbial Technology 392006，1230-1235)。從上述文獻可知，雖 然目前采用基因工程的手段實現(xiàn)了葡萄糖氧化酶的異源表達，表達量在原始菌株基礎(chǔ)上 得到了提高，特別是利用畢赤酵母異源分泌表達GOD具有高細胞密度發(fā)酵、蛋白可分泌 到胞外表達，且雜蛋白少；具有翻譯后加工修飾系統(tǒng)，糖蛋白的免疫原性較低；遺傳和表 達穩(wěn)定性好等優(yōu)點(Macauley-Patrick S, Fazenda M, McNeil B, et al. , Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system. Yeast,2005,22 249-270.)，但分泌表達量均較低，通常在50-100U/ml，這就造成酶制劑價格昂貴，限制了其 廣泛使用。
通常提高外源基因在畢赤酵母中的分泌表達有密碼子優(yōu)化、mRNA結(jié)構(gòu)改造、GC含 量調(diào)整等策略。其中，優(yōu)化外源基因的密碼子是主要的手段(聶東宋，梁宋平.外源蛋白在 巴氏畢赤酵母中高效表達的策略.，吉首大學(xué)學(xué)報.2001，22，(3), 40-44)。
所謂密碼子優(yōu)化即是由于密碼子的簡并性，每個氨基酸對應(yīng)的密碼子可以有多 個。研究發(fā)現(xiàn)物種具有密碼子偏愛性，即不同物種對密碼子的使用頻率是不同的，有些密 碼子甚至從來不使用，那些不經(jīng)常使用甚至從不使用的密碼子稱為稀有密碼子或非偏愛型 密碼子。非偏愛型密碼子形成的原因主要是細胞內(nèi)缺乏識別這些密碼子的tRNA。對于不 同的表達系統(tǒng)如畢赤酵母和大腸桿菌，其密碼子偏好性是不同的。若外源基因含有較多的 宿主菌非偏愛型密碼子，尤其是連續(xù)出現(xiàn)的話，將會嚴重影響其在宿主菌中的表達量。為 了消除稀有密碼子對蛋白表達量的影響，可采用對異源基因的密碼子進行優(yōu)化來實現(xiàn)，即 在不改變外源基因氨基酸序列的情況下，將外源基因中的稀有密碼子替換為宿主常用的密 碼子。該方法具有簡單易行，重復(fù)性好的特點，得到了廣泛的使用(Sharp P，Tuohy T and Mosurski K，Codon usage in yeast :cluster analysis clearly differentiates highly and lowly expressed genes. Nucleic Acids Research，1986，14 :5125.)0
不同來源的酶蛋白外源基因經(jīng)密碼子優(yōu)化后其在畢赤酵母中的表達量提高程 度差別很大，例如Teng等通過優(yōu)化β-1，3-1，4葡聚糖酶的密碼子組成，使其在畢赤 酵母中的表達量提高 10 倍(Teng D, Fan Y, Yang YL, et al.，Codon optimization of Bacillus licheniformis beta-1,3-1,4-glucanase gene and its expression in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol，2007，74 :1074-1083) ；Chang將來源于假絲酵母的 脂肪酶密碼子進行優(yōu)化后，在畢赤酵母中的表達量提高4. 6倍(Chang Sff, Lee GC and Shaw JF, Codon optimization of Candida rugosa Iipl gene for improving expression in Pichia pastoris and biochemical characterization of the purified recombinant LIPl lipase. J Agric Food Chem，2006，54 :815_822.)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服葡萄糖氧化酶基因在宿主細胞中表達時所存 在的分泌表達量較低的缺陷，將葡萄糖氧化酶基因的密碼子進行優(yōu)化并降低其GC含量，得 到一種分泌表達量有顯著提高的葡萄糖氧化酶突變基因。
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
5[0014]一種葡萄糖氧化酶突變基因，其堿基序列為SEQ ID NO. 2所示。
本發(fā)明將克隆獲得的點青霉葡萄糖氧化酶基因在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前 提下，綜合考慮密碼子使用頻率，GC含量的調(diào)整，不穩(wěn)定序列的刪除等影響因素，按照巴斯 德畢赤酵母的偏愛密碼子對葡萄糖氧化酶基因序列進行改造，共改變了 272個堿基，涉及 96個氨基酸，GC含量由55. 54%降為48. 44%，優(yōu)化后的葡萄糖氧化酶突變基因在畢赤酵母 中的分泌表達量有顯著提高。
含有葡萄糖氧化酶的突變基因的重組表達載體以及含有該重組表達載體的宿主 細胞也當(dāng)然屬于本發(fā)明的保護范疇之列；優(yōu)選的，所述重組表達載體是重組真核表達載體， 更優(yōu)選為重組畢赤酵母表達載體；所述的宿主細胞優(yōu)選為酵母細胞，更優(yōu)選為畢赤酵母 (Pichia pastoris)細胞。
本發(fā)明還提供了一種制備葡萄糖氧化酶的方法，包括將SEQ ID NO. 2所示的葡萄 糖氧化酶突變基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體 轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組葡萄糖氧化酶的表達，回收并純化所 表達的葡萄糖氧化酶，即得。
上述方法中，所述的重組表達載體優(yōu)選為重組真核表達載體，更優(yōu)選為重組畢赤 酵母表達載體；所述的宿主細胞優(yōu)選為酵母細胞，更優(yōu)選為畢赤酵母(Pichia pastoris) 細胞。
本發(fā)明將點青霉(Penicillium notatum)來源的葡萄糖氧化酶基因(SEQ ID NO. 1)經(jīng)密碼子優(yōu)化、GC含量改變等綜合改造，得到葡萄糖氧化酶突變基因(SEQ ID N0. 2)。 本發(fā)明將葡萄糖氧化酶突變基因轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中進行表達，試驗結(jié)果表明，相比于突變 前，葡萄糖氧化酶突變基因在畢赤酵母中的分泌表達量有顯著提高，與國內(nèi)外部分研究比 較，本發(fā)明葡萄糖氧化酶突變基因的最終表達量達到較高的表達水平，為進一步工業(yè)化擴 大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)測定表明，本發(fā)明葡萄糖氧化酶突變基因所表 達的重組葡萄糖氧化酶蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性和較高的酶活力。


圖1G0D原基因密碼子使用頻率。
圖2改造后的GOD-M基因密碼子使用頻率。
圖3葡萄糖氧化酶優(yōu)化基因分段合成及酶切位點示意圖。
圖4酵母重組表達質(zhì)粒pPIC9-G0D和pPIC9-G0D_M的構(gòu)建圖。
圖5酵母轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定電泳圖(1 陰性對照，2-11 轉(zhuǎn)GOD的PCR結(jié)果；12-21 轉(zhuǎn) GOD-M 的 PCR 結(jié)果；M :marker)。
圖6平板法篩選有葡萄糖氧化酶活性的酵母轉(zhuǎn)化子。
圖7轉(zhuǎn)GOD和GOD-M酵母菌株3升發(fā)酵罐中葡萄糖氧化酶酶活結(jié)果。
圖8發(fā)酵罐中葡萄糖氧化酶經(jīng)甲醇誘導(dǎo)不同時間內(nèi)的表達量(M:蛋白分子量 marker ； 1-9 甲醇誘導(dǎo) 24、36、48、60、72、84、96、108、120h 發(fā)酵液)。
圖9葡萄糖氧化酶酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖10葡萄糖氧化酶最適pH曲線。
圖11葡萄糖氧化酶pH穩(wěn)定性曲線。
6[0031]圖12葡萄糖氧化酶最適溫度曲線。
圖13葡萄糖氧化酶熱穩(wěn)定性曲線。
圖14金屬離子及化學(xué)試劑對酶活性的影響。
圖15葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖雙倒數(shù)曲線。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù) 人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式 進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
說明以下具體實施例中所用到重組遺傳學(xué)技術(shù)均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)。在 以下實施例中未作詳細介紹的技術(shù)，均按照以下實驗手冊或文獻中的相關(guān)章節(jié)或部分來 進行，包括Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版· 2001)； Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual(1990)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。
實施例1葡萄糖氧化酶基因的優(yōu)化設(shè)計及合成
1. 1菌株和質(zhì)粒
點青霉(Peniciliium notatum)，由發(fā)明人本實驗室保存；
大腸桿菌(Escherichia coli)菌株T0P10和克隆載體pSP72購自北京全式金生 物技術(shù)有限公司；基因小片段由北京奧科生物技術(shù)公司合成。
1. 2葡萄糖氧化酶基因的優(yōu)化設(shè)計
首先對從點青霉(Peniciliium notatum)中克隆獲得的葡萄糖氧化酶原始基因的 序列進行分析(基因的克隆請參考李卓夫(碩士論文)，葡萄糖氧化酶基因的克隆及高效 表達.長春理工大學(xué)，2008)，在不改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的前提下，綜合考慮密碼子使用 頻率，GC含量的調(diào)整，不穩(wěn)定序列的刪除等影響因素，按照巴斯德畢赤酵母的偏愛密碼子對 葡萄糖氧化酶基因序列進行改造。
點青霉來源的葡萄糖氧化酶原基因全長1815bp，共編碼604個氨基酸和一個終止 密碼子。其中前54個堿基編碼的18個氨基酸為信號肽序列，在畢赤酵母中表達時需去除 自帶的信號肽序列，以表達載體PPIC9上的α因子為信號肽。因此去除自身信號肽的葡 萄糖氧化酶基因(GOD)由1761個堿基組成，編碼586個氨基酸和一個終止密碼子(SEQ ID NO. 1)。在不改變氨基酸序列的前提下對GOD基因進行優(yōu)化后的葡萄糖氧化酶基因(GOD-M) 序列(SEQ ID N0. 2)，共改變了 272個堿基，涉及96個氨基酸，GC含量由55. 54%降為 48. 44%。(表1)。GOD基因優(yōu)化前后的密碼子使用情況如圖1、2所示。
表1葡萄糖氧化酶基因優(yōu)化前后GC含量的變化
權(quán)利要求
一種葡萄糖氧化酶突變基因，其特征在于其堿基為SEQ ID NO.2所示。
2.含有權(quán)利要求
1所述葡萄糖氧化酶突變基因的重組表達載體。
3.按照權(quán)利要求
2所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體是重組真核 表達載體。
4.按照權(quán)利要求
3所述的表達載體，其特征在于所述重組真核表達載體是重組比赤 酵母(Pichia pastoris)表達載體。
5.含有權(quán)利要求
2-4任何一項所述重組表達載體的宿主細胞。
6.按照權(quán)利要求
5所述的宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞為酵母細胞。
7.按照權(quán)利要求
6所述的宿主細胞，其特征在于所述的酵母細胞為畢赤酵母(Pichia pastoris)細胞。
8.權(quán)利要求
1所述的葡萄糖氧化酶突變基因在制備葡萄糖氧化酶中的應(yīng)用。
9.按照權(quán)利要求
8所述的應(yīng)用，其特征在于，包括將權(quán)利要求
1所述的葡萄糖氧化酶 突變基因可操作性的與表達載體相連接得到重組表達載體；將所述重組表達載體轉(zhuǎn)化宿主 細胞，得重組菌株；培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組葡萄糖氧化酶的表達，回收并純化所表達的葡 萄糖氧化酶。
10.按照權(quán)利要求
9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的重組表達載體為重組真核表達載 體，優(yōu)選為畢赤酵母表達載體；所述的宿主細胞為酵母細胞，優(yōu)選為畢赤酵母細胞(Pichia pastoris)。
專利摘要
本發(fā)明公開了葡萄糖氧化酶突變基因及其表達和應(yīng)用。本發(fā)明將葡萄糖氧化酶基因通過密碼子優(yōu)化、GC含量改變等方式，改變了272個堿基，將GC含量由55.54％降為48.44％，得到葡萄糖氧化酶突變基因，其堿基為SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明將葡萄糖氧化酶突變基因轉(zhuǎn)入到畢赤酵母中進行表達，試驗結(jié)果表明，相比于突變前，葡萄糖氧化酶突變基因在畢赤酵母中的分泌表達量有顯著提高，與國內(nèi)外部分研究比較，本發(fā)明葡萄糖氧化酶突變基因的最終表達量達到較高的表達水平，為進一步工業(yè)化擴大生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。葡萄糖氧化酶酶學(xué)性質(zhì)測定表明，采用本發(fā)明葡萄糖氧化酶突變基因所表達的重組葡萄糖氧化酶蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性和較高酶活力。
文檔編號C12N1/21GKCN101955953SQ201010277121
公開日2011年1月26日 申請日期2010年9月9日
發(fā)明者姚斌, 張偉, 張宇宏, 范云六 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan