專利名稱：：抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種siRNA，具體涉及一種抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其在篩選弓形蟲減毒活疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的機會致病原蟲，生活史復(fù)雜，涉及的組織器官多，可引起人獸共患的弓形蟲病，其危害嚴(yán)重程度在再現(xiàn)疾病中僅次于結(jié)核。孕婦感染弓形蟲可引起流產(chǎn)、早產(chǎn)、畸胎、死胎、嬰幼兒先天性弓形蟲病、小兒智力障礙等，對人口素質(zhì)和優(yōu)生優(yōu)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響。近年來，隨著寵物熱的興起，人與動物接觸機會增加，給弓形蟲病的流行帶來了新的問題。弓形蟲腦炎已成為艾滋病患者的主要死亡原因之一，也是器官移植患者死亡和精神病發(fā)病的主要原因之一。目前，尚無十分理想的弓形蟲病治療藥物，現(xiàn)有的化學(xué)藥物有治療周期長、藥物毒副作用大、不能根治等缺陷，迄今為止尚無一種藥物能夠殺滅包囊內(nèi)的蟲體，加之弓形蟲的重復(fù)感染十分迅速，故雖經(jīng)多方面努力仍未得以很好地遏制。因此，研制安全高效的弓形蟲病疫苗已成為人們的迫切需要。關(guān)于弓形蟲減毒或弱毒活疫苗已有不少報道，主要有Ts溫度敏感株、T263突變株、S48速殖子等，其中Ts溫度敏感株在多種動物體內(nèi)獲得了抗致死性攻擊的保護力；T263突變株能有效抑制貓排卵囊的能力，由此切斷傳播途徑；1988年，0'connd用S48速殖子有效地控制了綿羊的流產(chǎn)，現(xiàn)已用作抗綿羊弓形蟲病的商用疫苗。本發(fā)明人通過具有保護性的抗弓形蟲單克隆抗體免疫篩選弓形蟲cDNA文庫獲得二個新的具有免疫保護性的候選分子，其中vv;c2基因^GenBank登錄號為AY238892J序列長1515bp(SEQIDNO.l)，起始密碼子位于734-736位堿基，編碼183個氨基酸，蛋白質(zhì)理論分析量為48.639kDa。wx基因(GenBank登錄號AY208994)序列長984bp(SEQIDN0.2),起始密碼子位于243-245堿基，編碼198個氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量為49.165kDa。我們利用近幾年迅速發(fā)展起來的RNAi(RNAinterfetense)新技術(shù)，針對弓形蟲wx2基因的228-247位序列設(shè)計的雙鏈DNA，并將其導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，獲得體內(nèi)能持續(xù)表達siRNA分子的RNA干擾蟲株，動物感染實驗表明其毒力顯著減低，有望開發(fā)出家畜和寵物用弱毒或減毒活疫苗。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA。本發(fā)明的抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA是通過設(shè)計并體外合成雙鏈DNA，構(gòu)建逆病毒表達載體并導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，獲得在體內(nèi)持續(xù)表達的siRNA分子。所述雙鏈DNA的堿基序列為正義鏈5'-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTtTTCAAGAGA|ACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3';(SEQIDNO.5)反義鏈5'-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGT|rCTCTTGAA|ACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3';(SEQIDNO.6)其干擾位點為wx2序列的895913位的19個核苷酸，方框內(nèi)為為回文結(jié)構(gòu)。所述siRNA的表達質(zhì)粒為逆病毒表達載體pSUPER.retro，其分子大小為7196bp。本發(fā)明的另一目的在于提供上述siRNA在篩選弓形蟲弱毒或減毒活疫苗中的應(yīng)用。應(yīng)用本發(fā)明的siRNA篩選弓形蟲弱毒或減毒活疫苗的技術(shù)方案如下首先構(gòu)建干擾質(zhì)粒，經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，經(jīng)篩選獲得體內(nèi)能持續(xù)表達siRNA分子的可遺傳的RNA干擾蟲株，采用RT-PCR鑒定其干擾效果，選取高效的RNA于擾蟲株，通過動物攻擊實驗檢驗其干擾效果，進而利用篩選到的干擾蟲株開發(fā)家畜和寵物用弱毒或減毒活疫苗。所述干擾蟲株的篩選方法為干擾蟲株的篩選方法為采用細(xì)胞內(nèi)篩選和細(xì)胞外低溫篩選結(jié)合的方法，首先在3^g/ml嘌呤霉素條件下、于L929細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)8天，轉(zhuǎn)到^g/ml嘌呤霉素條件下、于4'C細(xì)胞外選擇8天，然后在4^g/ml嘌呤霉素條件下、于L929細(xì)胞內(nèi)選擇培養(yǎng)5天。本發(fā)明的優(yōu)勢在于本發(fā)明的siRNA分子能特異、高效地抑制弓形蟲wx2基因的表達，體外干擾表達實驗結(jié)果表明干擾質(zhì)粒組蛋白質(zhì)表達量較對照組減少60-70%;RT-PCR實驗結(jié)果表明篩選的干擾蟲株wx2b-i的干擾效果達到80%以上；進一歩的動物攻擊實驗表明千擾蟲株vvx2b-i組動物發(fā)病及死亡時間顯著推遲，平均存活時間延長一倍，因此該干擾蟲株有望成為新的減毒蟲株，可望進一步研制成應(yīng)用于家畜和寵物的弱毒或減毒活疫苗。圖l:pSUPER-retro質(zhì)粒圖圖2:干擾質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果A.pSUPER-vv/JcCEcoiI，^7u7l雙酶切；B.pSUPER-w義2cEcoRI,屈ol雙酶切；C.pSUPER-wo:B五coM，報"i/llI雙酶切；D.空泳道，無條帶出現(xiàn)；E.pSUPER-wcc2bEcoRI，歷rtdUI雙酶切；F.pSUPER-no;2a五coiI，狄"dLU雙酶切；G.pSUPER-CfcoWI,;^oI雙酶切；H.pSUPER質(zhì)茅站co/U^oI雙酶切；圖3:共轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒與pcDNA3-vvx2在真核細(xì)胞COS-7細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達的Western-blot結(jié)果A.pcDNA3對照組；B.pSUPER-wx2c與pcDNA3-wx2共轉(zhuǎn)染組；C.pSUPER-no:2b與pcDNA3-Ha2共轉(zhuǎn)染組；D.pSUPER-vva;2a與pcDNA3-na2共轉(zhuǎn)染組；E.pSUPER-C與pcDNA3-wx2共轉(zhuǎn)染組；F.pcDNA3-wx2圖4:干擾蟲株的vv;c2基因RT-PCR檢測結(jié)果A.干擾株wx2c-i;B.干擾株Hoc2b-i;C.干擾株C-i;D.野生型RH株弓形蟲；E.干擾株Ha2a-i;F.P24對照圖5:不同時間各組小鼠存活比率1.RH株組；2.C-i組；3.vwc2b-i組圖6:速殖子攻擊后各組小鼠平均生存時間具體實施例方式一、siRNA的設(shè)計與合成pSUPER-retro質(zhì)粒(圖l)為美國伊利諾伊大學(xué)羅樹紅博士惠贈。根據(jù)wx2、wjc基因cDNA序列和siRNA的設(shè)計原則以及載體pSUPER.retro的特點各設(shè)計三對具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的包含N-19的核苷酸靶序列，序列由上海生工合成。1、盯ik(酶切位點為/厶歷/7rffl7)(SEQIDNO.3)(SEQIDNO.4)2、盯ib.(酶切位點為餘〃/,〃^o!/Z7)5'-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTTTCAAGAGAACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3'(SEQIDNO.5)5'-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGTTCTCTTGAAACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3'(SEQIDNO.6)3、(酶切位點為iW//,J力o/)5'-GATCCCCAGCGGTGAGTGTCGTTCTATTCAAGAGATAGAACGACACTCACCGCTTTTTTA-3'(SEQIDNO.7)(SEQIDNO.8)4、盯A.(酶切位點為5g7//,5'-GATCCCCGGGTGGCTTCTACAAGGAATTCAAGAGATTCCTTGTAGAAGCCACCCTTTTTA-3'(SEQIDNO.9)5，(SEQIDNO.10)5、(酶切位點為A^//,歷/7說Z/)5'-((SEQIDNO.11)(SEQIDNO.12)6、wjfC.(酶切位點為5,-；(SEQIDNO.13)5，(SEQIDNO.14)7、陰性對照(C)(酶切位點為5'-GATCCCCTATCCGCACGCTCACTCTATTCAAGAGATAGAGTGAGCGTGCGGATATTTTTA-3'(SEQIDNO.15)5'-](SEQIDNO.16)二、干擾質(zhì)粒的構(gòu)建1、配對退火將配對的OligoDNA用去核酸酶的水溶解至3^g/ml，在PCR管中加入正義和反義核苷酸各及l(fā)xSTE退火緩沖液，90°C4min,7(TClOmin，然后逐漸冷卻至10°C,-2(TC保存?zhèn)溆谩?、雙酶切、回收將pSUPER質(zhì)粒(2^g)、州WU12.5^1、lOxTangobuffer2〃1、去離子水配成2(Vd體系，37。C酶切4hr，取反應(yīng)液進行瓊脂糖凝膠電泳，確定酶切完全。在反應(yīng)體系中加入Bg/Il2W，37'C酶切過夜。最后進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠回收質(zhì)粒片段，測濃度并4'C保存?zhèn)溆谩?、連接連接反應(yīng)體系見表1，16'C連接過夜，構(gòu)建的干擾質(zhì)粒命名為pSUPER-vvjc2a、pSUPER舊2b、pSUPER督2c、pSUPER督A、pSUPER督B、pSUPER督C、pSUPER-C。表l干擾質(zhì)粒連接體系退火Oligos2^1T4DNA連接buffer(10x)1^1pSUPERT4連接酶l川去離子水_^fi總體積_4、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1)冰上融化感受態(tài)細(xì)胞或用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞；2)將冷卻的10Al連接混合物加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴60min;3)42。C熱休克90sec后迅速置冰水浴孵育2min;4)加入800^1LB液體培養(yǎng)基，混勻，37°C，220rpm振蕩培養(yǎng)60min;5)取100培養(yǎng)物平鋪到含Amp(100mg/L)的LB瓊脂平板上，將平板放置室溫下直至表面液體被吸收。倒置平皿，于37"培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。5、挑單克隆，初級搖菌從LB平板上挑取克隆，加入5ml液體LB(含Amp，100//g/ml)，在37'C300rpm搖床上振蕩孵育1216h。三、弓形蟲干擾質(zhì)粒的鑒定pcDNA3-wx2、pcDNA3-wx質(zhì)粒為本發(fā)明人構(gòu)建并保存。1、重組質(zhì)粒雙酶切鑒定陽性克隆取1.5ml菌液按試劑盒說明書進行操作，小量提取質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，37i:酶切4h，雙酶切反應(yīng)體系見表2。為了便于觀察，酶切選用的位點是五coiI和i^V^UJ，觀察的目的條帶為281bp，陰性對照質(zhì)粒采用EcoiI和屈ol雙酶切，在248bp處出現(xiàn)相應(yīng)條帶。表2雙酶切反應(yīng)體系載體iowddH205EcoRI1.5WHindlII/Xho11.5^1BufferR_2川總體積_20W干擾質(zhì)粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果顯示所有干擾質(zhì)粒包括陰性對照質(zhì)粒均在6.9Kb左右和281bp處各出現(xiàn)一條帶。pSUPER空質(zhì)粒對照在6.9Kb左右和248bp處各出現(xiàn)一條帶，與預(yù)期一致，證明干擾構(gòu)建成功(見圖2)。2、重組質(zhì)粒測序鑒定將前一步提取的質(zhì)粒分裝于EP管中，送上海生工測序。測序引物根據(jù)pSUPER載體設(shè)計并由上海生工公司合成5-GGAAGCCTTGGCTTTTG陽3'bindingsite:1241-12575'-GATGACGTCAGCGTTCG陽3'bindingsite:2645-2629測序結(jié)果與預(yù)期一致，說明構(gòu)建成功，干擾質(zhì)粒測序結(jié)果見SEQIDN0.17，陰性對照pSUPER空質(zhì)粒測序結(jié)果見SEQIDN0.18。3、干擾質(zhì)粒與>2真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，初步觀察其體外干擾表達的效果1)24孔板培養(yǎng)COS-7細(xì)胞，在50(Vd無抗生素的DMEM培基中接種2xl()S細(xì)胞，待細(xì)胞長到90-95%密度時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天換成無血清DMEM培基；2)轉(zhuǎn)染混合物用5QtdOpti-MEM(無血清)培基稀釋pcDNA3-wx2,pcDNA3-wx質(zhì)粒DNA及干擾質(zhì)粒各0.8^g，輕輕混勻。在5QalOpti-MEM(無血清)培基加入2.QalLipofectamin2000，室溫孵育5min。然后混勻DNA與Lipofectamin2000(總體積100〃)，輕輕混勻，室溫孵育20min;3)將DNA與Lipofectamin2000混合物加入24孔板細(xì)胞中，來回輕輕晃動培養(yǎng)板；4)37°C5%C02培養(yǎng)6hr后換培養(yǎng)基一次，培養(yǎng)48h-72h后收集細(xì)胞裂解液進行Westtern-blot鑒定。實驗結(jié)果表明基因wx2的干擾質(zhì)粒中pSUPER-wx2b組與pSUPER-wx2c組蛋白質(zhì)表達量較陰性對照和野生型對照組有所減少，經(jīng)灰度掃描，pSUPER-na2b組蛋白質(zhì)表達量較對照組減少70%以上，pSUPER-wx2c組蛋白質(zhì)表達量較對照組減少60%以上。pSUPER-wx2a組干擾效果不明顯?；騱x的干擾質(zhì)粒中pSUPER-wxC組表達減少不明顯(圖2)。四、RNA干擾蟲株的建立及干擾效果觀察1、質(zhì)粒大量提取參照試劑盒說明進行。2、電轉(zhuǎn)化干擾質(zhì)粒入弓形蟲體內(nèi)DNA的處理干擾質(zhì)粒(pSUPER-w;c2a,pSUPER-wx2b，pSUPER-wo:2c，pSUPER-w;cB,pSUPER-wjcC,pSUPER-C)50^g用去離子水稀釋成300W體積，力fl100%乙醇600^1和3Qal醋酸鈉(pH3.0，3M)，-20°(:過夜，14000rpm離心10min，棄上清，用lml70呢乙醇洗DNA(-20。C至少2h)，14000rpm離心10min,晾干后用100^1電轉(zhuǎn)染buffer懸浮DNA。收獲純化弓形蟲速殖子，每次轉(zhuǎn)染用5-10xl(^個速殖子，1600rpm離心6min,棄上清，用5ml電轉(zhuǎn)染緩沖液漂洗速殖子1次，再將速殖子重懸于電轉(zhuǎn)染緩沖液30Q1中，再加入處理過的質(zhì)粒DNA10Qal，混勻，轉(zhuǎn)入4mm電擊杯進行電穿孔。條件1.5千伏，25//F電擊一次，時間lms，室溫放置15min，然后將蟲體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中培養(yǎng)(含5%小牛血清)，37°C，5%(202培養(yǎng)12h后換成嘌呤霉素選擇培養(yǎng)。3、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染蟲株的篩選選取不同細(xì)胞株HeLa、3T3、HFF、L292，用DMEM完全培基培養(yǎng)至長滿培養(yǎng)瓶，接種干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的弓形蟲，37°C、5%(202培養(yǎng)12小時，換成不同濃度嘌呤霉素培養(yǎng)基(分別含0.5^g/ml、1^g/ml、1.5^g/ml、2^ag/ml、3^g/ml、4^g/ml質(zhì)量百分比濃度嘌呤霉素及5%小牛血清)選擇培養(yǎng)。在不同時間觀察蟲子及細(xì)胞生長情況，在選擇培養(yǎng)后8天，收集蟲子，離心收集沉淀，用4^g/ml嘌呤霉素溶解沉淀，(C細(xì)胞外選擇8-15天，回復(fù)到細(xì)胞內(nèi)用^g/ml嘌呤霉素選擇培養(yǎng)5天，收集蟲子接種昆明小鼠，大量收集弓形蟲用于提取RNA進行后續(xù)檢測及電鏡檢査。實驗結(jié)果表明HeLa、3T3、HFF細(xì)胞對于嘌呤霉素的耐受不同，在濃度為0.5-1.5^g/ml之間，對干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染蟲體的選擇性殺傷不理想，對照組野生型蟲株在選擇5天后仍沒有明顯死亡，細(xì)胞死亡也少；在2/zg/ml以上時，野生型對照組的蟲體雖然死亡明顯，但細(xì)胞在培養(yǎng)第3天就大量死亡，不足以維持蟲體的生長。L929細(xì)胞對嘌呤霉素的耐受力較前幾種細(xì)胞好，在3^g/ml時可以耐受選擇5-8天左右，而細(xì)胞死亡速度較慢，在4^g/ml時仍可以耐受4-5天，所以選擇L929細(xì)胞作為宿主細(xì)胞。DMEM完全培養(yǎng)基的小牛血清濃度為5%，以限制細(xì)胞生長速度，細(xì)胞生長速度過快不利于蟲體的篩選。干擾蟲株在L929細(xì)胞中選擇培養(yǎng)8天后，野生型蟲株組蟲體在顯微鏡下觀察不到，培養(yǎng)上清接種昆明小鼠(盲傳)均無發(fā)病現(xiàn)象。4、RT-PCR在mRNA水平檢測基因wx2的表達1)總RNA的提取取2-3xl()7個弓形蟲干擾株(wx2a-i，wx2b-i，w;c2c-i,wxB-i,wxC-i，C-i)速殖子加入lmlTrizol，室溫放置5min，再加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15min，室溫放置3min,4。C，10000rpm離心15min，吸取水相部分，于水相中加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min,4'C，10000rpm離心10min，棄上清，留沉淀，用75%的乙醇洗滌沉淀，4'C，lOOOOrpm離心5min，晾干10min,用2QalDEPC處理水55-6(TC溶解沉淀，-7(TC保存?zhèn)溆谩?)逆轉(zhuǎn)錄采用Ferment公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行，在冰浴試管中加入總RNA5/d(5^g)，引物01igo(dT)^1^1,DEPC處理水定容至12W，混勻，瞬時離心5sec，然后7(TC水浴5min，冰浴30sec,瞬時離心5sec，將試管冰浴再加入5xreactionbuffer4/d，RNaseinhibitor(20u/^l)2/zl,dNTPMix(10mmol/L)2/d,37。C水浴5min，再加入AMVRT1^1(20U/^1)，總體積為20W，37'C水浴60min,7(TC加熱10min結(jié)束反應(yīng)，-2(TC保存?zhèn)溆谩?)PCR擴增以逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，引物分別為ho:2,正向引物GCGAATTCCTTGCGGAGACACATG;反向引物CCGCTCGAGATTCGTTTAGAGAGG。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>cDNA模板3ul無菌雙蒸水__總體積___PCR擴增條件94。C預(yù)變性4分鐘，94。C變性80秒，53。C/52。C退火80秒，72°C延伸120秒，共35個循環(huán)，72"C再延伸8分鐘，4"C保存。實驗結(jié)果表明干擾蟲株wx2c-i、wx2b-i均獲得一定的基因沉默效果，其中干擾蟲株vvx2b-i(B泳道)基因沉默效果尤其理想，經(jīng)灰度掃描RNA干擾效果達到80%左右(圖4)?？紤]到有些序列可能在二級結(jié)構(gòu)或在高一級巻曲內(nèi)被隱藏，部分靶mRNA不能被dsRNA作用，因此，干擾效果能夠達到80%是相當(dāng)成功的。五、干擾蟲株毒力及動物攻擊實驗觀察實驗分三組，每組各10只昆明小鼠(22±5g)，分別記數(shù)500個干擾蟲株、陰性蟲株C-i、野生型RH株弓形蟲速殖子腹腔接種小鼠，觀察小鼠死亡時間。在動物感染實驗中，vv義2b-i組動物存活時間較陰性C-i組和野生型RH株弓形蟲組明顯延長，40%小鼠存活期長達21天，平均存活時間為319.1土175.6h;而對照組小鼠在10天內(nèi)基本全部死亡陰性，其中C-i組和野生型RH株組平均存活時間分別為161.2±11.98h與165.4±6.09h，統(tǒng)計學(xué)分析具有顯著性差異，P<0.05;發(fā)病及死亡時間推遲，說明干擾蟲株毒力有所減低(圖6、圖7)。SEQUENCELISTING〈110〉中南大學(xué)〈120〉抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其應(yīng)用〈130〉<160〉18〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1515〈212〉廳<213〉Toxoplasmagondii〈400〉1ggcacgagcgagcgtgttgcgaaggcaaaccgataaacagttcttgctctctgcctgttg60gaaaccatgttcttacgatggctgggctgttttcgcgcatcctcgtttgacgtaggttag120tgacatgcttctactccgtgcttcgtcagtgaaaactttgtgttgccgaaacaagcaatg180tgcctctactgggcaacttcctcttaacatgttcaaggtcga^aaaaaaaaaaaaaa犯240ctcgagagatcttttgagcacaagaaggtacacgtttctttcccttctgctcgcctcggc300ggtaaggctggtgcgcatttgttgcacgcgcatctttccacatgaaaaaagagcgcgtat360cgggataacgggagacagagcgaaaataaaagagggcgggtttc3tttgg犯caacgcca420agacattgtttctgcaacatacaccgcgagaaactgctgcaccccgcagtagagattgaa480cttcaccggaatcgagtgtaatccacacgctagaccaggcctaaagacgtttacccagtt540cctaaccgggcgccgcgcttgtccttcgagaaaaaacttcatggaagaaaaaagctcaca600ctttgtaccgacaaacggcaaacattagcgccatacgcaaaaggaaccgcatgcacacag660ctcggtaagctcctcctctcgacggtacctgacctaattcggtgcaccgagcgatagaca720attgcggagacacatgtatatctgtatagaaggtacgcaaaaaggtaggatcacagacgc780gcatgcaaaaacacattcctcacagacgcgatggcgtcctgcacctgcagtgccgcttct840tcattcaccgattcacatgacattttccttcgaccggagagacgaaaacatccgtaaagc900ggtgagtgtcgttctacgtatcgcctctcgtcgccgaagagaagaaattcctccatactc兆Oaggactcttcggatttcctcagtttgcttctgcattccgtgttcccttcttcgtcgtctc1020tcctccctcctccccatttctttgcttcctctctctcctttctaaccgtctctgcggctc1080tccgccgtcgctccgttcctcgactttgcttctcggagtcgagcgcgtcgacccttcctc1140ccggtttctctcttctctggatacgagcgaacgcgagctgaccgcgtcgcaccaccctca1200aaacactcgcacggggtcccatgtgaggtacacacacgaagtatttttcctccggctgca1260cttgaacgtacacagaagtcaggcgacaccgtgagtgcagcaggcccgcggcttggggga1320gctccggcctctctaaacgaatctgaaaatgcgcgaaagaaaagcgacttgcccttcccg1380cacagtccgtggtgtggcgcgagcgacattccacgcctgggatttgcgtcatcacaaaac1440tatcgaaccagcaaatgcacttgtttttcgccaccgcagagacacgtgagtcattgttgc1500tctcgcttctttgcc1515〈210〉2〈211〉984〈212〉腿<213〉Toxoplasmagondii〈400〉2ggcacgaggcgcttttggcttcgttccgatcgtccgcgagtcttcccctcgtttttacac60aatggcggaccggtactctgtgaagctgttgcggcccatggagggcgtccccgtccccga120gcggaccaagaccaagatcgcccgggacgtcaagcttctcaacaagatgaagcaggcgaa180ggaagcccacgcaaagaaggttcatgcacagcgtcatgcgctcaagatgaggacatacaa240gtatgtcagcgagtacagggaaggagagagaigaacctcatcaagctgaagcgcgaggcca300aggcgaagggtggcttctacaaggaacccgaggc犯aggttatcctggccactcgtatca兆Oagggtatcaacaagcttgctcccaagccgaagatgattctccgtctcttccggctgcgcc420agctcc.acaacgcggtcttcatcaaggtcaacaaagccaccattgaaatgttgaaggctg480tccagcccttcatcacttacggctacccgaccctgaaaactatccgccagctcatctaca540agcgtggctacgctaaggtcggcaagcccggcgcccactcgcgcatccgcctgcaagcga600acgacatcgtgtcccagcacttgggcaagtacggcatccacggagtcgaggatttggttc660acgaaatctacacttgcggcccgtacttcaagcaggcgaacaactttttgtggccgttta720agctcaactctccccgcaagggattcaccagcaagcgccacggctacaacgagccccgca780agggagactggggcaacagagaggaaatgatcaacgagttggtccagcgaatgatctaaa840agcagacggcgtccgcgcgggagggtggccgagggccgctgaatctcgtgcacgtggtgt■ctttgttctgtagtgaagcaactgcgcatccaactctcaccgtccaatcgtaacagtgac%0<210>3<211〉60<212>DNA〈213〉人工序列〈400〉3gatccccacacattcctcacagacgcttcaagagagcgtctgtgaggaatgtgtttttta〈210〉4<211>60<212>腿〈213〉人工序列〈400〉4agcttaaaaaacacattcctcacagacgctctcttgaagcgtctgtgaggaatgtgtggg<210>5〈211〉60<212>DNA9846060〈213>人工序列〈400〉5gatcccccatccgtaaagcggtgagtttcaagagaactcaccgctttacggatgttttta60<210>6〈211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>6agcttaaaaacatccgtaaagcggtgagttctcttgaaactcaccgctttacggatgggg60〈210〉7<211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>7gatccccagcggtgagtgtcgttctattcaagagatagaacgacactcaccgctttttta60〈210〉8〈211〉61<212>DNA<213>人工序列〈400〉8tcgagtaaaaaagcggtgagtgtcgttctatctcttgaatagaacgacactcaccgctgg60〈210>9<211>60〈212〉DNA<213>人工序列<400>9gatccccgggtggcttctacaaggaattcaagagattccttgtagaagccacccttttta60<210〉10〈211〉60<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉10agcttaaaaagggtggcttctacaaggaatctcttgaattccttgtagaagccacccggg60〈210〉11<211>60〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400>11gatccccgccgaagatgattctccgtttcaagagaacggagaatcatcttcggcttttta60〈210〉12<211>60〈212〉腿<213〉人工序列〈400〉12agcttaaaaagccgaagatgattctccgttctcttgaaacggagaatcatcttcggcggg60〈210>13〈211〉60〈212〉DNA〈213>人工序列<400>13gatccccctatccgccagctcatctattcaagagatagatgagctggcggatagttttta60〈210〉14〈211〉61〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉14tcgagtaaaaactatccgccagctcatctatctcttgaatagatgagctggcggataggg60〈210〉15〈211>60<212>腿〈213>人工序列〈400〉15gatcccctatccgcacgctcactctattcaagagatagagtgagcgtgcggatattttta60<210>16〈211〉61<212>DNA<213>人工序列〈400〉16tcgagtaaaaatatccgcacgctcactctattcaagagatagagtgagcgtgcggatagg60g61<210>17<211>958<212〉DNA〈213〉Toxoplasmagondii〈400>17cccatggcagcagagatcgatctctcgagaaaacatccgtaaagcggtgagttctcttga60aactcaccgctttacggatgggggatctgtggtctcatacagaacttataagattcccaa120atccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatatt180gcagggcgccactcccctgtccctcacagccatcttcctgccagggcgcacgcgcgtggg240tgttcccgcctagtgacactgggcccgcgattccttggagcgggttgatgacgtcagcgt300tcgaattctaccgggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttag360cagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacat420ccaccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactc480ctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaa540tggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagc600gggtaggcctttggggcagcggccaatagcagctttgctccttcgctttctgggctcaga660ggctggg犯ggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctc鄉(xiāng)ggcggggcgggcg720cccgaaggtcctccggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgc780tgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcccaagctagcttaccatga840ccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgca900ccctcgcgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgtcgatccggaccgc958〈210〉18〈211〉914〈212〉DNA〈213〉Toxoplasmagondii〈400〉18gccgggggcggcattagatcgatctctcgaggtcgacggtatcgataagcttaaaaatat60ccgcacgctcactctattcaagagatagagtgagcgtgcggataggggatctagatctgt120ggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatt180tcccagaacacatagcgacatgcaaatattgcagggcgccactcccctgtccctcacagc240catcttcctgccagggcgcacgcgcgctgggtgttcccgcctagtgacactgggcccgcg300attccttggagcgggttgatgacgtcagcgttcgaattctaccgggtaggggaggcgctt360ttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacaca420agtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtaggcgccaaccggctccgttc480tttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgcc540ccgcagctcgcgtcgtgcaggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtg600cagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatag660cagctttgctccUcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcggg720ctcacgggcgggctcagggcggggcgggcgcccgaaggtcctccggaggcccggcattct780gcacgcttcaaagcgcacgtctgccgcgctgttctctcttctcatctcgggctttcgact840gcagcccaagctagcttaccatgaccgagtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcg900acgacgtcctcaag91權(quán)利要求1、抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA，其特征在于，設(shè)計并體外合成以下雙鏈DNA，構(gòu)建逆病毒表達載體并導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，獲得體內(nèi)持續(xù)表達的siRNA分子，所述雙鏈DNA的堿基序列為正義鏈5′-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3′(SEQIDNO.5)反義鏈5′-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGTACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3′；(SEQIDNO.6)干擾位點為wx2序列的895～913位的19個核苷酸，方框內(nèi)為為回文結(jié)構(gòu)。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA，其特征在于，所述siRNA的表達質(zhì)粒為逆病毒表達載體pSUPER.retro，其分子大小為7196bp。3.權(quán)利要求1所述的抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA在篩選弓形蟲減毒活疫苗中的應(yīng)用，其特征在于，首先構(gòu)建干擾質(zhì)粒，經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，篩選有效的RNA干擾蟲株，通過動物攻擊實驗檢驗其干擾效果，進而利用篩選到的干擾蟲株開發(fā)家畜和寵物用弱毒或減毒活疫苗。4.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA在篩選弓形蟲減毒活疫苗中的應(yīng)用，其特征在于，干擾蟲株的篩選方法為采用細(xì)胞內(nèi)篩選和細(xì)胞外低溫篩選結(jié)合的方法，首先在3^g/ml嘌呤霉素條件下、于L929細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)8天，轉(zhuǎn)到4/^g/ml嘌呤霉素條件下、于4。C細(xì)胞外選擇8天，然后在4^g/ml嘌呤霉素條件下、于L929細(xì)胞內(nèi)選擇培養(yǎng)5天。全文摘要本發(fā)明具體涉及一種抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其在篩選弓形蟲弱毒或減毒活疫苗中的應(yīng)用。針對弓形蟲wx2基因(GenBank登錄號為AY238892)的895～913位序列設(shè)計一對各含有9個堿基回文結(jié)構(gòu)的60核苷酸發(fā)夾狀DNA，應(yīng)用該發(fā)夾狀DNA構(gòu)建干擾質(zhì)粒并經(jīng)電穿孔法導(dǎo)入弓形蟲體內(nèi)，獲得體內(nèi)能持續(xù)表達siRNA分子的RNA干擾蟲株wx2b-i，動物感染實驗表明其毒力顯著減低，攻擊的小鼠存活時間明顯長于陰性對照和野生型蟲株，有望開發(fā)出家畜和寵物用弱毒或減毒活疫苗。文檔編號C12N15/11GK101298612SQ20081003067公開日2008年11月5日申請日期2008年2月25日優(yōu)先權(quán)日2008年2月25日發(fā)明者翔吳,瓊張,舒衡平,奎譚申請人:中南大學(xué)