專利名稱：一個(gè)新的人類睪丸特異性基因tdrg1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人類基因，具體是一個(gè)新的睪丸特異性基因rZ)i G7的cDNA全 長(zhǎng)克隆，并明確了該基因編碼的氨基酸序列以及在人體多種組織、不同發(fā)育階段 睪丸組織中的表達(dá)譜。
技術(shù)背景-根據(jù)WHO(1986)人類生殖研究發(fā)展和培訓(xùn)特別規(guī)劃署研究報(bào)告，在發(fā)達(dá)國(guó) 家不育夫婦占已婚育齡夫婦的15%，而男性不育又占不育夫婦的43%。研究表 明，男性不育發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因參與的過(guò)程，約2000個(gè)不同的基因參與 了男性生殖及其調(diào)節(jié)過(guò)程，包括睪丸發(fā)育、生殖細(xì)胞分化、減數(shù)分裂以及精子 發(fā)生的各個(gè)階段。這些基因有的位于性染色體，有的則定位于常染色體。因此， 發(fā)現(xiàn)和研究與生精相關(guān)的新基因，成為了進(jìn)一步揭示男性生精過(guò)程的分子機(jī)制的 關(guān)鍵，也可能為診治男性不育癥提供新的思路。人類基因組圖譜公諸于世后，以計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)為工具，利用現(xiàn)有的表達(dá)序 列標(biāo)簽(expressed sequence tag, EST)和生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)人類基因組未知功 能新基因的發(fā)掘和蛋白質(zhì)功能分析己成為近年研究的熱點(diǎn)。美國(guó)NCBI的 Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)中擁有大量的EST，它們來(lái)源于不同組織、不同細(xì)胞、不同病理 狀態(tài)下所構(gòu)建的cDNA (complementary DNA)文庫(kù)，已成為人們尋找新基因的 重要標(biāo)志物。運(yùn)用"數(shù)據(jù)庫(kù)消減雜交"(Digital Differential Display, DDD)方 法對(duì)不同文庫(kù)進(jìn)行比較，獲得在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上存在明顯差異的代表新基因的克隆 重疊群，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證克隆新基因的方法是目前發(fā)掘新基因的常用手段之一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一個(gè)新的睪丸特異性基因rZ)/ G7的的cDNA全長(zhǎng) 序列，并明確了其編碼的氨基酸序列，分析它在人體多種組織和不同發(fā)育階段睪 丸組織中的表達(dá)譜，以探索該基因在睪丸生精過(guò)程中所起的作用，進(jìn)而開(kāi)發(fā)治療 男性不育癥的基因藥物。.經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入美國(guó)NCBI (http:Vwww.ncbi.nlm.nih.gov)的Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)， 運(yùn)用DDD方法進(jìn)行數(shù)種平行材料之間的比較。以9個(gè)人類睪丸cDNA文庫(kù)作為 檢測(cè)子(pool A) ， 76個(gè)其他組織或細(xì)胞株(如心、脾、肝、肺、腦、皮膚、腎、 卵巢、骨骼肌、胸腺、前列腺、小腸、大腸等)來(lái)源的cDNA文庫(kù)作為驅(qū)趕子 (pooffi)，通過(guò)poolA: poolB之間的比值來(lái)計(jì)算倍數(shù)差異，并以》10倍的差 異為篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)消減雜交篩選獲得可能存在表達(dá)差異的EST片段。選 取了其中一個(gè)電子預(yù)測(cè)其可能在睪丸組織中特異表達(dá)的代表新基因的克隆重疊 群(contig)Hs. 180197， i亥EST族中包含BC071820.1、BC033995.2和BC042123.1， 3個(gè)序列拼接后獲得一條長(zhǎng)度為1197 bp的新序列。以拼接后的新序列為探針，運(yùn)用多種基因預(yù)測(cè)軟件搜索EST和Unigene數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)互聯(lián)網(wǎng)進(jìn)入美國(guó)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，利用BLAST檢索nr數(shù)據(jù)庫(kù)和EST 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行歸類、拼接、延長(zhǎng)、査新，獲得受人類基因組圖譜支持的新基因的 cDNA全長(zhǎng)為1197 bp。以成人睪丸組織的總mRNA為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。依據(jù)電子克隆的新基因 序列設(shè)計(jì)兩對(duì)引物(Pi/P2， P3/P4，見(jiàn)下文)在成人睪丸組織的cDNA文庫(kù)中進(jìn) 行PCR擴(kuò)增，以2%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。將經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證的PCR 產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。重組克隆在AB1377-3自動(dòng) 測(cè)序儀上完成測(cè)序。結(jié)果表明兩對(duì)引物均擴(kuò)增成功，實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與 電子克隆所獲得的基因序列完全一致，從而實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該基因在成人睪丸組織中 的表達(dá)。對(duì)睪丸、心臟、肝臟、腦、附睪、肺、腎、脾等人正常組織進(jìn)行多組織半定 量RT-PCR分析，結(jié)果表明該新基因僅在人睪丸組織中表達(dá)。多組織半定量 Northern雜交分析亦顯示僅在睪丸組織中有約lJ9kb大小的陽(yáng)性轉(zhuǎn)錄本存在。 說(shuō)明新克隆的基因?yàn)椴G丸特異性表達(dá)的基因。用半定量RT-PCR分析新基因在人 類不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)新基因在4個(gè)月和6個(gè)月的胎兒睪丸中 無(wú)表達(dá)，在15歲少年睪丸中強(qiáng)表達(dá)，在33歲青年睪丸中表達(dá)稍減弱，而在74 歲老年男性睪丸組織中的表達(dá)明顯減弱，從而提示該基因與男性性成熟與生精功 能有關(guān)。因此，我們將該新基因全長(zhǎng)cDNA序列提交到GeneBank，登錄號(hào)為 DQ168992，經(jīng)國(guó)際人類基因命名委員會(huì)批準(zhǔn)命名為7DWG7 (Testis Development Related Gene 1)。7IJ)i G7基因定位于6p21.1-6p21.2，整個(gè)基因跨越約1.8kb，包括2個(gè)外顯子 和1個(gè)內(nèi)含子。該基因含有303bp (504—806bp)的完整開(kāi)放閱讀框，編碼100 個(gè)氨基酸，504-506bp處為起始密碼子ATG， 804-806bp處為終止密碼子TAG, 在ATG 5'端有1個(gè)同一相位的終止密碼子TGA， 3'端則有1個(gè)加尾信號(hào) AATAAA及poly A尾。依據(jù)該基因的開(kāi)放閱讀框序列，構(gòu)建大腸桿菌表達(dá)載體重組71J)WG/蛋白， 利用重組蛋白免疫小鼠，制備了抗7Di G/蛋白單克隆抗體。以抗7D7 G/單克 隆抗體為一抗，天然人睪丸組織裂解液為抗原，進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。結(jié)果為 陽(yáng)性，表明人睪丸組織中有陽(yáng)性的7Z說(shuō)G/蛋白表達(dá)。7ZWG/蛋白包括100個(gè)氨 基酸序列，分子量為17KD，無(wú)保守結(jié)構(gòu)域，無(wú)跨膜區(qū)，無(wú)信號(hào)肽序列，推測(cè)為 一非分泌性蛋白。對(duì)其修飾位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示可能含有1個(gè)蛋白激酶C磷酸 化位點(diǎn)，2個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)，3個(gè)N-肉豆蔻基化位點(diǎn)。對(duì)該蛋白質(zhì) 序列進(jìn)行相似性比較，結(jié)果顯示與其他已知蛋白質(zhì)無(wú)明顯同源性，表明該7Di G7 基因及其編碼蛋白質(zhì)均是全新的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1、 克隆了一個(gè)人類睪丸特異性新基因的全長(zhǎng)cDNA序列，確定了 其編碼的氨基酸序列，初步闡明了該基因的功能，為下一步深入研究該基因功能 提供了基礎(chǔ)。2、 7Z)i G/基因與男性睪丸生精功能相關(guān)，有望成為診治男性不育癥的新靶 點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)治療男性不育癥的新藥物提供思路。本發(fā)明通過(guò)以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一歩闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。


圖1. 7ZW(7/的cDNA核苷酸序列和其編碼的氨基酸序列； 圖2. RT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證電子克隆的新基因序列；M: Marker; 1:引物P!/P2; 2:引物P3/P4.圖3. rZ)A(7/的多組織半定量RT-PCR;M: Marker; 1:睪丸；2:心臟；3:肝；4:腦； 5:附睪；6:肺；7:腎；8:脾.圖4. 7ZWG/的多組織Northern雜交；M: Marker; 1:成人腦；2:心臟；3:肝臟；4:月市；5:脾臟；6:腎臟；7:睪丸8:骨骼.圖5. ri)i G/在不同發(fā)育階段睪丸組織的半定量RT-PCR;M: Marker; 1: 15歲人睪丸；2: 33歲青年睪丸；3: 74歲老年人睪丸；4: 4個(gè)月胎兒睪丸；5: 6個(gè)月胎兒睪丸.圖6. Western Blot驗(yàn)證7Di G/蛋白； M: Marker;1、 2、 3抗原均為人類睪丸裂解液；抗體均為抗一7I)i G/單克隆抗體.
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證基因的cDNA序列根據(jù)電子克隆的新基因序列設(shè)計(jì)Pi/P2， P3/P4兩對(duì)引物P1: sense 5'—GAAGAGGAGGGAGGCAGTCT—3，P2: antisense 5'—GCCCAATTCCTCTTGACTGA—3' P3: sense 5'—AAGGAGAGTGCCCTGCGTG—3'P4: antisense 5'—TCCCTGAAGGTGGAGTGCTG—3'PCR以成人睪丸組織的cDNA文庫(kù)為模板。反應(yīng)條件94'C預(yù)變性5min后， 94。C變性30sec， 58。C退火30sec， 72。C延伸lmin，完成30個(gè)循環(huán)，最后72。C延 伸5min，置4。C保存。以2%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。將經(jīng)瓊脂糖電泳驗(yàn)證的PCR產(chǎn)物連接到pUCm-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109。重組克隆在AB1377-3自動(dòng)測(cè)序儀 上完成測(cè)序。實(shí)施例2 rZ)i G7在全身多組織和不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)分析利用上述Pi/P2引物對(duì)在人各種組織cDNA文庫(kù)中進(jìn)行半定量RT-PCR，按 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體積20uL,模板RNA lug。以 GAPDH基因作為內(nèi)參。為較客觀地反映mRNA表達(dá)的相對(duì)水平，在7Di G/基 因及GAPDH的PCR平臺(tái)期前結(jié)束PCR。采用下列反應(yīng)條件進(jìn)行94"C預(yù)變性 5min后，94。C變性30sec， 58。C退火30sec， 72。C延伸lmin，完成30個(gè)循環(huán)， 最后72"C延伸5min，置4'C保存。利用上述同樣的方法對(duì)新基因在不同發(fā)育階段睪丸組織中的表達(dá)情況進(jìn)行 半定量RT-PCR。實(shí)施例3多組織Northern雜交(1) 、用DDLK-010試劑盒標(biāo)記GW探針，純化后備用。(2) 、預(yù)雜交將預(yù)制人全身多組織核酸印跡膜取出，放入雜交袋中三面封 口 ，加入65T預(yù)熱的Hyb雜交液5mL，封口 。放65'C水浴振蕩雜交1小時(shí)。(3) 、雜交將標(biāo)記好的探針?lè)臝O(TC煮10 15分鐘，立即放冰浴冷卻10 分鐘。將預(yù)雜交袋從水浴中取出，盡量排干袋中的預(yù)雜交液，取5mLHyb雜交 液，加入探針，混勻，加入到雜交袋中，封口，放65"水浴振蕩雜交過(guò)夜。(4) 、洗膜剪開(kāi)雜交袋，用鑷子取出膜，放入裝有20mL的2XSSC 0.1% SDS溶液的平皿中，在室溫下振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。再將膜放入0.1 XSSC 0.P/。SDS溶液(先放5(TC水浴預(yù)熱)中5(TC水浴振蕩洗滌兩次，每次15分鐘。 用鑷子將膜取出轉(zhuǎn)入裝有20mL洗滌緩沖液的平皿中振蕩洗滌5分鐘。(5) 、用20mL阻斷封閉30分鐘。 再將膜轉(zhuǎn)入10mL抗體溶液中振蕩孵育30分鐘。在20mL洗滌緩沖液中振蕩洗滌兩次，每次15分鐘。(6) 、信號(hào)檢測(cè)將膜放20mL檢測(cè)緩沖液中振蕩平衡5分鐘。(7) 、配制發(fā)光底物按1: 100比例將CDP-STAR濃縮底物加入到檢測(cè) 緩沖液中，混勻。均勻加在膜上，室溫反應(yīng)5分鐘，用X-光片曝光10-30分 鐘，記錄結(jié)果。
權(quán)利要求
1、一個(gè)新的人類睪丸特異性基因TDRG1，其特征在于該人類新基因的cDNA核苷酸序列和編碼氨基酸序列如下1aagatcaggactgctgaaagaatgaagaagaacttacttggcctaggatg 5051 tggctagagaacggagcgcactttcacttacctggcaaggtggttttgga 100101 agtttccacggaagccttcccagggccgctgctgcccgtcctcgcctagg 150151 tgtggagcttcccgaccggctggggagggaatgtcctgcgggagccgccg 200201 aggaccctctttagcctcttccctggcttggctgcagctgcagtctggta 250251 ctcgcccattctgctcttcttcacctccgtattttctctctcacggaaga 300301 agaattccattctcccatcccaggaaggagagtgccctgcgtgccacgaa 350351 agagcccaggacccacaggacaaatacgtcactggcagacctgccttcgc 400401 cagcgccagcccatctctgaaacctccagcatttgtgccccggtccggcc 450451 cctcccaggcctgactctttccgtgaacggtcactgcgcaggatcaagct 500501 acaATGAAGAGGAGGGAGGCAGTCTGCGCGCACCGCCATTTTCTAGGAACT 550 M K R R E A V C A H R H F L G T551 GGGAAGCCCCCCCACCCCTTAGGAAGATCCATCCCTGTGGAACCTTGCCCA 601 G K P P H P L G R S I P V E P C P602 GGCTTACCAGCCTTTGCTGAGGTTGATCTATTGTCCCTCCTTGTCCCCATC 652 G L P A F A E V D L L S L L V P I653 AAAATATCCAGCACTCCACCTTCAGGGAGTAGACTTGACCCTCAAATAGCA 703 K I S S T P P S G S R L D P Q I A704 AGTTCAGCCTTCCCAGGTCTAGGTTCCCTGGGAGGTCAAGATTCGTCTGGT 754 S S A F P G L G S L G G Q D S S G755 TCCTTAGTACAGAGGGCTAGCTGTGAGTTGGAATCCCCCTATGAGCTTTAG 806 S L V Q R A S C E L E S P Y E L *807 aatcagtcaagaggaattgggccccttcccttcatccctcttcttttccct 857858 ttttgtcccagagctcagctctgactcaaaagtttttccatttaccatcaa 908909 catggaaacttggctcctcacgtaggtatattatcccccttttgtacatgg 959960 tcttgttgatccaaactccctttctgtgaaagaggcctgtggggctcaaga 10101011 agcctggtcagccagccaggctagtcccacatacctcagaaccagtttaat 10611062 aaaaaaggctctatgtcattcttttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 11091110 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 11601161 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa119全文摘要
運(yùn)用“數(shù)據(jù)庫(kù)消減雜交”的方法克隆了一個(gè)新的人類睪丸特異性基因TDRG1，它的cDNA全長(zhǎng)為1197bp，編碼100個(gè)氨基酸。TDRG1基因僅在人睪丸組織中表達(dá)，且在青少年睪丸組織中強(qiáng)表達(dá)，胎兒和老年睪丸組織中表達(dá)明顯減弱，表明該基因與男性性成熟與生精功能相關(guān)，有望成為診治男性不育癥的新靶點(diǎn)，為開(kāi)發(fā)治療男性不育癥的新藥物提供思路。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101255426SQ20081003071
公開(kāi)日2008年9月3日 申請(qǐng)日期2008年2月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年2月28日
發(fā)明者文甲明, 湯育新, 蔣先鎮(zhèn), 陽(yáng)建福 申請(qǐng)人:蔣先鎮(zhèn);陽(yáng)建福;湯育新;文甲明