專利名稱：：一種抗HBV核心區(qū)的siRNA表達(dá)模板和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基因藥物，具體涉及一種抗HBV核心區(qū)的siRNA表達(dá)模板。技術(shù)背景乙型肝炎病毒(HBV)的持續(xù)感染是當(dāng)前嚴(yán)重的全球健康問題之一，也是導(dǎo)致慢性肝病最常見的原因。目前全球約有3.5億慢性乙型肝炎病毒感染者，其中75%分布在亞太地區(qū)。慢性乙型肝炎預(yù)后不良,可發(fā)展為肝硬化和肝癌。目前控制HBV持續(xù)感染的抗病毒療法主要采用核苷類似物和重組干擾素類抗病毒藥物。但迄今為止，慢性乙型肝炎的抗病毒治療療效尚不令人滿意，高劑量重組干擾素的持續(xù)應(yīng)答率僅約30%左右，核苷類似物如拉米夫定雖然抗病毒活性較強(qiáng)，但停藥后病毒復(fù)制水平快速反跳及耐藥病毒株的出現(xiàn)，使得臨床抗病毒方案的實(shí)施受到極大的阻礙。RNA干預(yù)(RNAi)技術(shù)的出現(xiàn)為基因功能研究、抗腫瘤和抗病毒基因治療等方面的研究展開了新的一頁(yè)。雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻斷作用被稱為RNA干預(yù)(RNAinterference,RNAi)，具有干預(yù)作用的小片段雙鏈RNA則稱為siRNA,這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補(bǔ)結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致mRNA失去功能，即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因"沉默"了。目前RNAi技術(shù)主要用于功能基因研究和抗腫瘤研究，抗病毒治療研究才剛剛起步，但已顯示了良好的前景和巨大潛力，如有研究者證實(shí)RNAi介導(dǎo)的基因沉寂療法可以成功抑制艾滋病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)的復(fù)制與表達(dá)。Gitlin等人報(bào)道將針對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞，可產(chǎn)生抵御病毒感染的保護(hù)作用，Novina等人采用針對(duì)HIV-1受體CD4的siRNA明顯降低了HIV感染細(xì)胞的能力?；蜉斔鸵恢笔腔蛑委熀娃D(zhuǎn)基因研究中的一個(gè)難題，目前普遍采用腺病毒載體和脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物進(jìn)行基因輸送，而這兩種方法存在著安全隱患和效率低等方面的問題，納米技術(shù)在生物領(lǐng)域的滲透形成了納米生物技術(shù)，而納米藥物載體的研究是納米生物技術(shù)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。被制成基因載體的磁性納米顆粒能與DNA結(jié)合，并把DNA導(dǎo)入細(xì)胞，在外部磁場(chǎng)導(dǎo)向作用下能達(dá)到最佳的細(xì)胞轉(zhuǎn)染作用，完全克服了傳統(tǒng)方法所遇到的困難。為了進(jìn)一步研究RNAi對(duì)HBV復(fù)制的影響，本發(fā)明把siRNA技術(shù)和納米技術(shù)結(jié)合，研制了一種新型基因藥物，抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，這對(duì)探索乙肝治療的新途徑具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，通過采用siRNA技術(shù)結(jié)合納米技術(shù)對(duì)HBV核心區(qū)進(jìn)行封閉并抑制HBcAg的表達(dá)，最終抑制HBV表達(dá)和復(fù)制。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用以下技術(shù)方案一段HBV核心區(qū)靶基因的siRNA表達(dá)模板的核苷酸序列為gatcccgttggaggcttgaacagtaggattgatatccgtcctactgttcaagcctccaattttttccaaa。將上述表達(dá)模板插入到siRNA表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pRNA-HBcAg，再與磁性納米顆粒結(jié)合，通過磁場(chǎng)導(dǎo)入2215細(xì)脫產(chǎn)生靶向HBV核心區(qū)的siRNA;經(jīng)序列測(cè)定，它由70個(gè)核苷酸組成，與設(shè)計(jì)相符；經(jīng)放射免疫法、RT-PCR、westernblotting、免疫組化等體外實(shí)驗(yàn)，表明pRNA-HBcAg可明顯抑制HBV核心區(qū)和HBV-DNA的表達(dá)，同時(shí)也在一定程度上抑制了HBsAg和HbeAg的表達(dá)，從而達(dá)到抗HBV的目的。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1、靶向廣泛選擇的靶序列同時(shí)針對(duì)HBV的adr和adw兩個(gè)亞型(這兩個(gè)亞型囊括了大部分HBV)，而與人體基因組毫無沖突；2、納米技術(shù)應(yīng)用使用磁性納米顆粒作為基因?qū)氲妮d體，解決了安全性問題，同時(shí)利用磁場(chǎng)的作用解決了導(dǎo)向問題，而且納米技術(shù)的運(yùn)用使基因?qū)氲男视兴岣撸?、效果明顯當(dāng)前相關(guān)RNAi抗朋V的研究大都把靶點(diǎn)設(shè)在HBV核心區(qū)C端，而本發(fā)明設(shè)計(jì)的RNAi靶點(diǎn)在HBV核心區(qū)N端，是其特點(diǎn)。所構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pRNA-HBcAg可明顯抑制HBV核心區(qū)的表達(dá)，從而抑制HBV的復(fù)制和表達(dá)，為研制治療乙肝的基因藥物開辟了一條有實(shí)用意義的新途徑。圖1為大腸桿菌轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性克隆菌落。圖2為測(cè)序圖譜，框內(nèi)標(biāo)記的序列為正確的克隆序列。圖3為siRNA的結(jié)構(gòu)描述。圖4為熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白GFP表達(dá)。圖5為RT-PCR結(jié)果marker為DNA分子量；l為空白對(duì)照；2為陰性對(duì)照；3為pRM-HBcAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖6為免疫組化結(jié)果:A為對(duì)照；B為siRNA-HBcAg。圖7為Western-blotting結(jié)果Marker為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；l為空白對(duì)照；2為陰性對(duì)照；3為siRNA-HBcAg。具體實(shí)施方式實(shí)施例1:1.構(gòu)建耙向基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒1.1表達(dá)質(zhì)粒的準(zhǔn)備購(gòu)買GenScript公司的pRNAT-U6.1/Neo質(zhì)粒，它是一個(gè)為轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞設(shè)計(jì)的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，質(zhì)粒中攜帶新霉素抗性基因作為篩選標(biāo)志以建立穩(wěn)定細(xì)胞株，位于CMV啟動(dòng)子下的GFP(綠色熒光蛋白)基因能夠用來跟蹤質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率，U6啟動(dòng)子下設(shè)計(jì)有多克隆位點(diǎn)，本發(fā)明中我們利用其BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)進(jìn)行克隆。1.2siRNA模板序列的設(shè)計(jì)GeneScript公司提供了在線siRNA模板序列設(shè)計(jì)的軟件，利P該軟件可設(shè)計(jì)siRNA模板序列，我們針對(duì)HBV核心區(qū)找到一段靶序列5'TCCTACTGTTCAAGCCTCCAA3，根據(jù)它再設(shè)計(jì)出一對(duì)siRNA模板序列(其結(jié)構(gòu)見圖3-A):5，-GATCCCGTTGGAGGCTTGAACAGTAGGATTGATATCCGTCCTACTGTTCAAGCCTCCMTTTTTTCCAAA-3，3，-GGCAACCTCCGAACTTGTCATCCTAACTATAGGCAGGATGACAAGTTCGGAGGTTAAAAAAGGTTTTCGA-5，1.3將合成的模板與酶切好的質(zhì)粒連接將上述合成的一對(duì)模板DNA鏈分別用水配成lug/ul的溶液，各取5ul，加入2ul退火緩沖液(2MNaCl)和8ul水，混勻后于95'C水浴5分鐘變性，再自然冷卻退火成一條雙鏈DNA，由于設(shè)計(jì)好了BamHI和HindIII的酶切位點(diǎn)粘端，可直接與BamHI和HindIII酶切(內(nèi)切酶均購(gòu)自美國(guó)Promega公司，操作方法詳見內(nèi)切酶產(chǎn)品說明書)好的質(zhì)粒pRNAT-U6.1/Neo連接；然后取lul酶切好的質(zhì)粒與3ul退火雙鏈DNA，加3U/ul的T4連接酶lul，與10ul水混合，在T4連接酶作用下，16'C連接反應(yīng)過夜。1.4轉(zhuǎn)染DH5a感受態(tài)細(xì)胞將連接過夜的連接體系轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞(大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版第55頁(yè))，涂布于含Ampl00ug/ml的LB平皿上，37'C培養(yǎng)過夜，可見有若干個(gè)菌落生長(zhǎng)(見圖l)。1.5挑陽(yáng)性克隆進(jìn)行酶切鑒定和測(cè)序鑒定，以確定siRNA模板已正確插入質(zhì)粒挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落接種于含A即100ug/ml的LB液體培養(yǎng)基中，37'C，270r/min搖床培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒純化試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)提取質(zhì)粒(方法按照試劑盒說明書操作)。并做PstI和SalI酶切(方法按照內(nèi)切酶產(chǎn)品說明書操作)鑒定，初步證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建成功，把質(zhì)粒送大連寶生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果(見圖2)最終確定siRNA模板已正確插入質(zhì)粒，模板序列經(jīng)Primer5分析為發(fā)夾結(jié)構(gòu)(見圖3_B)。L6大量擴(kuò)增重組質(zhì)粒，為下一步作準(zhǔn)備。2.購(gòu)買磁性納米顆粒并與siRNA表達(dá)質(zhì)粒偶聯(lián)①磁性納米顆粒的準(zhǔn)備購(gòu)買法國(guó)OZ公司的磁性納米顆粒產(chǎn)品，放4'C冰箱儲(chǔ)存。②與siRNA表達(dá)質(zhì)粒偶聯(lián)吸取siRNA表達(dá)質(zhì)粒與磁性納米顆粒漿液按liig:2ul均勻混合，放室溫靜置30分鐘即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。3.體外實(shí)驗(yàn)3.1放射免疫實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)HBV的抑制情況。借磁場(chǎng)的導(dǎo)向作用，將siRNA-納米顆粒轉(zhuǎn)染2215細(xì)胞，用熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)其轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染前一天用胰酶(0.25g/100ml)消化培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，用含IOW(v/v)胎牛血清的DMEM調(diào)整細(xì)胞密度為2X10s個(gè)/ml，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入2ml細(xì)胞懸液，細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h左右，使細(xì)胞全部貼壁；每孔轉(zhuǎn)染2ug重組質(zhì)粒(對(duì)照孔轉(zhuǎn)染2ug空質(zhì)粒pRNAT-U6.1)。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，可見轉(zhuǎn)染后細(xì)胞有綠色熒光蛋白GFP表達(dá)(見圖4)。<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>由上表結(jié)果可知，藥物對(duì)HBV-DNA復(fù)制的抑制率達(dá)到9(m以上，而對(duì)HBsAg(抑制率:26.1%)和HBeAg(抑制率19.3%)都有一定程度的抑制。3.2通過RT-PCR和Westernblot檢測(cè)siRNA封閉基因表達(dá)的效果，用免疫組化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行定位。RT-PCR采用TrizalReagents(Gibico/BRL)提取細(xì)胞總RNA，設(shè)計(jì)PCR引物為PI:5，-AACTTTTTCACCTCTGCCTA-3，P2:5，_CTAACATTGAGATTCCCGAG-3，e-actin作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照；PCR條件為94。C預(yù)變性3分鐘，然后進(jìn)入循環(huán)94'C60秒，58°C60秒，72'C90秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72'C延伸10分鐘，緩慢降到4'C,凝膠電泳結(jié)果如下轉(zhuǎn)染pRNA-HBcAg的細(xì)胞mRNA表達(dá)明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空白質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞，表明pRNA-HBcAg可明顯抑制HBV核心區(qū)mRNA表達(dá)。未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞HBV核心區(qū)mRNA表達(dá)無明顯影響。e-actin作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，可見清晰表達(dá)(圖5)。Westernblotting:加入PBS500yl，200W超聲破碎60秒，4'C離心2min,取上清，測(cè)蛋白含量，用1(WPAGE膠(10%PAGE膠的配方見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版第883頁(yè))電泳分離蛋白，進(jìn)行Westernblotting實(shí)驗(yàn)(Western印跡法見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第二版第888頁(yè))，實(shí)驗(yàn)所需的一抗為鼠抗HBV核心區(qū)單抗，稀釋200倍后使用；二抗為HRP標(biāo)記羊抗鼠抗體，稀釋500倍后使用；兩個(gè)抗體均購(gòu)自SantaCruz公司。觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果pRNA-HBcAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞HBV核心區(qū)蛋白表達(dá)明顯下降，而未轉(zhuǎn)染細(xì)胞及空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞HBV核心區(qū)蛋白表達(dá)無明顯影響(圖7)。免疫組化取出載玻片，4呢多聚甲醛(v/v)固定，分別滴加小鼠抗HBV核心區(qū)單抗、生物素化二抗、辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，滴加MB顯色劑，顯色10min。結(jié)果pRNA-HBcAg轉(zhuǎn)染細(xì)胞核內(nèi)HBV核心區(qū)蛋白表達(dá)明顯下降，而空白對(duì)照細(xì)胞及空質(zhì)粒對(duì)照細(xì)胞HBV核心區(qū)蛋白表達(dá)無明顯影響(如圖6)。<110>蘇先獅<120>—種抗HBV核心區(qū)的siRNA表達(dá)模板和應(yīng)用<160>1<210>1<211>70<212>DNA<213>人工序列<220><400>1gatcccgttggaggcttgaacagtaggattgatatccgtcctactgttcaagcctccaat60tttttccaaa70權(quán)利要求1、一種抗HBV核心區(qū)的siRNA表達(dá)模板，其特征在于所述表達(dá)模板的核苷酸序列為gatcccgttggaggcttgaacagtaggattgatatccgtcctactgttcaagcctccaat60tttttccaaa702、一種權(quán)利要求1所述的抗HBV核心區(qū)的siRNA表達(dá)模板在制備抑制HBV藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明通過采用siRNA技術(shù)結(jié)合納米技術(shù)對(duì)HBV核心區(qū)進(jìn)行封閉并抑制HBcAg的表達(dá)，最終抑制HBV表達(dá)和復(fù)制。本發(fā)明靶向廣泛，效果明顯，通過采用納米技術(shù)提高了基因?qū)氲男?。文檔編號(hào)C12N15/113GK101235372SQ20081003072公開日2008年8月6日申請(qǐng)日期2008年2月29日優(yōu)先權(quán)日2008年2月29日發(fā)明者蘇先獅申請(qǐng)人:蘇先獅