專利名稱:多能干細(xì)胞的分化的制作方法
多能干細(xì)胞的分化
本發(fā)明要求于2008年6月30日提交的專利申請(qǐng)序列號(hào)61/076，900、于2008年6 月30日提交的專利申請(qǐng)序列號(hào)61/076，908以及于2008年6月30日提交的專利申請(qǐng)序列號(hào)61/076，915的優(yōu)先權(quán)。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。具體來講，本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法和組合物，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含足夠量的GDF-8以引起多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
背景技術(shù)：
用于I型糖尿病的細(xì)胞替代療法的進(jìn)展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開發(fā)適于移植物移入的胰島素生成細(xì)胞或β細(xì)胞的來源上。一種方法是從多能干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生功能性β細(xì)胞。
在脊椎動(dòng)物的胚胎發(fā)育中，多能干細(xì)胞可在稱為原腸胚形成的過程中產(chǎn)生包括三個(gè)胚層(外胚層、中胚層和內(nèi)胚層)的細(xì)胞群體。諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內(nèi)胚層，經(jīng)由中間階段發(fā)育而來。該過程中的中間階段是形成定形內(nèi)胚層。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)多種標(biāo)志物，例如，HNF-3 β , GATA4, MIXLl, CXCR4和S0X17。
定形內(nèi)胚層分化成胰腺內(nèi)胚層導(dǎo)致形成胰腺。胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)胰-十二指腸同源盒基因Pdxl。在不存在Pdxl時(shí)，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再發(fā)育。因而，Pdxl表達(dá)標(biāo)志著胰腺器官發(fā)生中的一個(gè)關(guān)鍵步驟。除了其他細(xì)胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內(nèi)分泌組織。外分泌和內(nèi)分泌組織來自胰腺內(nèi)胚層的分化。
據(jù)報(bào)道，從小鼠的胚胎細(xì)胞衍生了帶有胰島細(xì)胞特征的細(xì)胞。例如，Lumelsky等人 (Science 292 =1389,2001)報(bào)道了小鼠胚胎干細(xì)胞向類似胰島的胰島素分泌結(jié)構(gòu)的分化。 Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)報(bào)道，衍生自小鼠胚胎干細(xì)胞的胰島素分泌細(xì)胞使鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中的血糖變正常。
例如，Hori等人(PNAS 99 =16105,2002)揭示，用磷酸肌醇 3_ 激酶(LY294002)的抑制劑處理小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了類似β細(xì)胞的細(xì)胞。
又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 =998,2003)報(bào)道，從組成型表達(dá)1^x4的小鼠胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生了胰島素生成細(xì)胞。
Micallef等人報(bào)道說，視黃酸可調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞定向形成Pdxl陽性胰腺內(nèi)胚層。 在對(duì)應(yīng)于胚胎的原腸胚形成末的期間，加入胚胎干細(xì)胞分化第4天的培養(yǎng)物中時(shí)視黃酸是誘導(dǎo) Pdxl 最有效的(Diabetes 54:301,2005)。
Miyazaki等人報(bào)道了過表達(dá)Pdxl的小鼠胚胎干細(xì)胞系。他們的結(jié)果顯示，外源Pdxl表達(dá)在所得的分化細(xì)胞中明顯增強(qiáng)了胰島素、生長抑素、葡萄糖激酶、神經(jīng)元素3、 P48、Pax6 和 HNF6 基因的表達(dá)(Diabetes 53:1030,2004)。
Skoudy等人報(bào)道說，激活素A(TGF-β超家族的成員)能上調(diào)小鼠胚胎干細(xì)胞中的胰腺外分泌基因(P48和淀粉酶)和內(nèi)分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達(dá)。
使用InM激活素A時(shí)觀察到最大的效果。他們還觀察到，胰島素和Pdxl mRNA的表達(dá)水平不受視黃酸的影響；然而，3nM FGF7處理導(dǎo)致Pdxl的轉(zhuǎn)錄水平升高(Biochem. J. 379 :749,2004)。
Shiraki等人研究了能特異性增強(qiáng)胚胎干細(xì)胞分化成Pdxl陽性細(xì)胞的生長因子的作用。他們觀察到，TGFβ 2可再現(xiàn)地產(chǎn)生更高比例的Pdxl陽性細(xì)胞(Genes Cells. 2005 June ； 10 (6) :503-16)。
Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑的情況下從小鼠胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)braChyUry[陽性]/HNF_3i3 [陽性]內(nèi)胚層細(xì)胞(US 2006/0003446A1)。
Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 頁，2006)聲稱“Wnt 禾口 TGF-β/nodal/激活素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)同時(shí)為前原條的產(chǎn)生所必需”。
然而，胚胎干細(xì)胞發(fā)育的小鼠模型可能不會(huì)完全模擬高等哺乳動(dòng)物(例如人)中的發(fā)育程序。
Thomson等人從人胚泡分離了胚胎干細(xì)胞(Science 282 :114，1998)。同時(shí)， Gearhart和其同事從胎兒生殖腺組織衍生了人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott等人， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡單通過與白血病抑制因子(LIF) — 起培養(yǎng)來防止分化的小鼠胚胎干細(xì)胞不一樣，人胚胎干細(xì)胞必須維持在非常特殊的條件下 (美國專利 No. 6，200，806.W099/2074UW0 01/51616)。
D' Amour等人描述了在高濃度激活素和低血清的存在下生產(chǎn)人胚胎干細(xì)胞衍生定形內(nèi)胚層的富集培養(yǎng)基(D' Amour K A等人，2005)。將這些細(xì)胞移植到小鼠的腎囊下， 導(dǎo)致分化成具有某些內(nèi)胚層器官的特性的更成熟細(xì)胞。在加入FGF-10之后，人胚胎干細(xì)胞衍生的定形內(nèi)胚層細(xì)胞可進(jìn)一步分化成Pdxl陽性細(xì)胞(US 2005/0266554A1)。
D' Amour 等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401 (2006))聲稱“我們已開發(fā)出使人胚胎干(hEQ細(xì)胞轉(zhuǎn)化成能夠合成胰腺激素胰島素、胰高血糖素、生長抑素、胰多肽和生長激素釋放肽的內(nèi)分泌細(xì)胞的分化方法。該方法通過引導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)過類似于定形內(nèi)胚層、腸管內(nèi)胚層、胰腺內(nèi)胚層和內(nèi)分泌前體的階段轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)內(nèi)分泌激素的細(xì)胞來模擬體內(nèi)胰腺器官發(fā)生”。
又如，F(xiàn)isk等人報(bào)道了用于從人胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生胰島細(xì)胞的系統(tǒng) (US2006/0040387A1)。在該情形中，分化途徑分成三個(gè)階段。首先，使用正丁酸鹽和激活素A的組合，使人胚胎干細(xì)胞分化為內(nèi)胚層。然后將細(xì)胞與TGF-β拮抗劑(例如成頭蛋白 (Noggin))結(jié)合EGF或β細(xì)胞素一起進(jìn)行培養(yǎng)，以產(chǎn)生Pdxl陽性細(xì)胞。通過煙酰胺誘導(dǎo)終末分化。
在一個(gè)例子中，Benvenistry等人聲稱“我們得出如下結(jié)論P(yáng)DX1的過量表達(dá)增強(qiáng)了胰腺富集基因(pancreatic enriched gene)的表達(dá)，胰島素表達(dá)的誘導(dǎo)可能需要另外的僅存在于體內(nèi)的信號(hào)” (Benvenistry 等人，StemCells 2006 ；24 :1923-1930)。
激活素A是表現(xiàn)出廣泛生物活性的TGF-β家族成員，所述生物活性包括調(diào)控細(xì)胞增殖和分化以及促進(jìn)神經(jīng)元存活。激活素A的分離和純化通常是復(fù)雜的，通常會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)率低。例如，Pangas，S. Α.和Woodruff，Τ. K聲稱“抑制素和激活素是具有包括調(diào)節(jié)垂體FSH分泌在內(nèi)的各種生理作用的蛋白質(zhì)激素”。類似于轉(zhuǎn)化生長因子_b基因家族的其他成員， 它們經(jīng)歷從較大前體分子加工以及組裝成功能性二聚體。從天然來源分離抑制素和激活素僅能生產(chǎn)有限量的生物活性蛋白質(zhì)(J.Endocrinol. 172(2002) 199-210)。
又如，Arai，K. Y.等人聲稱“激活素是屬于轉(zhuǎn)化生長因子_b超級(jí)族的多功能生長因子。從天然來源分離激活素需要許多步驟并僅產(chǎn)生有限的量。盡管重組制劑已用于近來的研究，但重組激活素的純化仍需要多個(gè)步驟”(Protein Expression and Purification 49(2006)78-82)。
因此，仍存在對(duì)激活素A替代物的巨大需要，以便于多能干細(xì)胞的分化。
發(fā)明內(nèi)容
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含足夠量的 ⑶F-8以使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述包含足夠量GDF-8的培養(yǎng)基還含有至少一種其他化合物。 在一個(gè)實(shí)施例中，所述至少一種其他化合物是苯胺-吡啶并三嗪。在一個(gè)替代實(shí)施例中，所述至少一種其他化合物是環(huán)苯胺-吡啶并三嗪。


圖1顯示Hl人胚胎干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。分化通過使用IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare)測(cè)量細(xì)胞數(shù)目(分圖Α)和S0X17強(qiáng)度(分圖B)來確定。用含有20ng/ml Wnt3a加指定濃度的激活素A (黑色柱條)的培養(yǎng)基或缺少Wnt3a但具有指定濃度(白色柱條)的激活素A的培養(yǎng)基處理人胚胎干細(xì)胞總共四天。
圖2示出了用于使人胚胎干細(xì)胞系Hl的細(xì)胞向表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化的激活素A和GDF8的劑量響應(yīng)關(guān)系。將細(xì)胞用所示濃度的激活素A或GDF8 處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt3a處理測(cè)定法的第一天。分化通過使用熒光抗體探針以及在GE Healthcare IN CellAnalyzer上的高內(nèi)涵分析來測(cè)量S0X17強(qiáng)度而確定。
圖3示出了根據(jù)實(shí)例12所述方法，在分化的第一個(gè)步驟后細(xì)胞中的CXCR4表達(dá)。 將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或200ng/ml⑶F-8處理總共三天，結(jié)合用 20ng/ml Wnt 3a處理第一天或用2. 5 μ M化合物；34或2. 5 μ M化合物56處理全部三天。 CXCR4表達(dá)用熒光抗體探針和流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)量，得到所示的陽性細(xì)胞百分比。
圖4示出了在根據(jù)實(shí)例12所述方法向定形內(nèi)胚層分化三天后細(xì)胞中S0X17的表達(dá)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或200ng/ml⑶F_8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt 3a處理第一天或用2. 5 μ M化合物；34或2. 5 μ M化合物56處理全部三天。分化通過用熒光抗體探針和在GE Healthcare IN Cell Analyzer上的高內(nèi)涵分析來測(cè)量S0X17強(qiáng)度(黑色柱條)和所得細(xì)胞數(shù)(白色柱條)而確定。
圖5示出了根據(jù)實(shí)例12所述方法，在分化的第三個(gè)步驟后細(xì)胞中的PDXl和CDX2 蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或200ng/ml⑶F_8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt 3a處理第一天或用2. 5 μ M化合物；34或2. 5 μ M化合物56處理全部三天，接著通過分化的第二個(gè)和第三個(gè)步驟進(jìn)行后續(xù)分化。對(duì)于每個(gè)處理組，描述了用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析法確定的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞數(shù)。為了進(jìn)行比較，將值相對(duì)于使用激活素A/Wnt3a的處理進(jìn)行歸一化。
圖6示出了根據(jù)實(shí)例12所述方法，在分化的第四個(gè)步驟后細(xì)胞中PDXl蛋白的表達(dá)(白色柱條)和細(xì)胞數(shù)(黑色柱條)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或 200ng/ml⑶F_8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt 3a處理第一天或結(jié)合用2. 5 μ M化合物34或2. 5 μ M化合物56處理全部三天，接著通過分化的第二個(gè)、第三個(gè)和第四個(gè)步驟進(jìn)行后續(xù)分化。對(duì)于每個(gè)處理組，描述了用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析法確定的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞數(shù)。為了進(jìn)行比較，將值相對(duì)于使用激活素A/Wnt3a的處理進(jìn)行歸一化。
圖7示出了根據(jù)實(shí)例12所述方法分化的細(xì)胞中的胰島素和胰高血糖素的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞數(shù)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或200ng/ml⑶F_8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt 3a處理第一天或結(jié)合用2. 5 μ M化合物34或2. 5 μ M化合物 56處理全部三天，接著通過分化的第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)和第五個(gè)步驟進(jìn)行后續(xù)分化。對(duì)于每個(gè)處理組，描述了用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析法確定的蛋白質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞數(shù)。為了進(jìn)行比較，將值相對(duì)于使用激活素A/Wnt3a的處理進(jìn)行歸一化。
圖8示出了根據(jù)實(shí)例13所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)和細(xì)胞數(shù)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或lOOng/ml ⑶F-生長因子處理總共四天，結(jié)合用20ng/ml Wnt 3a處理第一天或結(jié)合用2. 5 μ M化合物 34或2. 5 μ M化合物56處理測(cè)定法的開始兩天。對(duì)于各處理組，描述了用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的S0X17蛋白表達(dá)(黑色柱條)和細(xì)胞數(shù)(白色柱條)。為了進(jìn)行比較， 將值相對(duì)于使用激活素A/Wnt3a的處理進(jìn)行歸一化。分圖8A示出了在不存在任何生長因子(無)或用激活素A/Wnt3a處理(AA/Wnt3a)或單獨(dú)使用各試劑時(shí)進(jìn)行分化的一系列控制條件。分圖8B示出了單獨(dú)用GDF-3或其與Wnt3a、化合物34或化合物56的多種組合進(jìn)行的分化。分圖8C示出了單獨(dú)用GDF-5或其與Wnt3a、化合物34或化合物56的多種組合進(jìn)行的分化。分圖8D示出了單獨(dú)用GDF8或其與Wnt3a、化合物34或化合物56的多種組合進(jìn)行的分化。分圖8E示出了單獨(dú)用GDF-10或其與Wnt3a、化合物34或化合物56的多種組合進(jìn)行的分化。分圖8F示出了單獨(dú)用GDF-Il或其與Wnt3a、化合物34或化合物56的多種組合進(jìn)行的分化。分圖8G示出了單獨(dú)用GDF-15或其與Wnt3a、化合物34或化合物56 的多種組合進(jìn)行的分化。
圖9示出了根據(jù)實(shí)例14所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml的激活素A或所示濃度的多種生長因子處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt 3a或結(jié)合用2. 5 μ M化合物34處理測(cè)定法的第一天。對(duì)于每個(gè)處理組，描述了用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的S0X17蛋白表達(dá)(黑色柱條)和細(xì)胞數(shù)(白色柱條)。為了進(jìn)行比較，將值相對(duì)于使用激活素A/Wnt3a的處理進(jìn)行歸一化。分圖9A示出了用單獨(dú)的Wnt3a或不存在任何生長因子(無)或用激活素A/Wnt3a 處理(AA/Wnt3a)進(jìn)行分化的一系列控制條件。分圖9B示出了用所示濃度的GDF-8 (供貨商P印roTech)結(jié)合20ng/ml Wnt3a進(jìn)行的分化。分圖9C示出了用所示濃度的⑶F-8 (供貨商Sienendoah)結(jié)合20ng/ml Wnt3a進(jìn)行的分化。分圖9D示出了用所示濃度的TGF β 1 與Wnt3a或化合物34的多種組合進(jìn)行的分化。分圖9E示出了用所示濃度的BMP2與Wnt3a或化合物34的多種組合進(jìn)行的分化。分圖9F示出了用所示濃度的BMP3與Wnt3a或化合物34的多種組合進(jìn)行的分化。分圖9G示出了用所示濃度的BMP4與Wnt3a或化合物34的多種組合進(jìn)行的分化。
圖10示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)總共處理三天100ng/ ml激活素A或lOOng/ml⑶F_8結(jié)合20ng/mlWnt3a。用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的 S0X17蛋白表達(dá)顯示為各處理組的總強(qiáng)度值，從而測(cè)試沒有添加生長因子(無處理)、單獨(dú)添加Wnt3a、單獨(dú)添加激活素A或⑶F-8或采用激活素A/Wnt3a處理或⑶F-8/Wnt3a處理情況下進(jìn)行分化的控制條件，其中如所示出的僅在測(cè)定法的第一天添加Wnt3a或在測(cè)定法的全部三天添加Wnt3a。
圖11示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天 lOOng/ml激活素A結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180(分圖B)、 化合物19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3 抑制劑BIO(分圖G))，其中僅在測(cè)定法的第一天添加測(cè)試化合物。用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的S0X17的蛋白質(zhì)表達(dá)通過總強(qiáng)度值來描述。
圖12示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天 lOOng/ml激活素A結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180(分圖B)、 化合物19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3 抑制劑BIO(分圖G))，其中在測(cè)定法的全部三天添加測(cè)試化合物。用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的S0X17的蛋白質(zhì)表達(dá)通過總強(qiáng)度值來描述。
圖13示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天 100ng/ml的GDF-8結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180 (分圖B)、 化合物19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3 抑制劑BIO(分圖G))，其中僅在測(cè)定法的第一天添加測(cè)試化合物。用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的S0X17的蛋白質(zhì)表達(dá)通過總強(qiáng)度值來描述。
圖14示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在向定形內(nèi)胚層分化后人胚胎干細(xì)胞中的 S0X17蛋白表達(dá)。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天 100ng/ml的GDF-8結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180 (分圖B)、 化合物19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3 抑制劑BIO(分圖G))，其中在測(cè)定法的全部三天添加測(cè)試化合物。用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的S0X17的蛋白質(zhì)表達(dá)通過總強(qiáng)度值來描述。
圖15示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化后的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天100ng/ml激活素A或lOOng/ml⑶F_8結(jié)合20ng/ml Wnt3a。顯示了各測(cè)試組的用熒光抗體探針和高內(nèi)涵分析確定的細(xì)胞數(shù)，從而測(cè)試沒有添加生長因子(無處理)、單獨(dú)添加Wnt3a、單獨(dú)添加激活素A或⑶F-8或采用激活素A/Wnt3a處理或⑶F-8/Wnt3a處理情況下進(jìn)行分化的控制條
7件，其中如所示出的僅在測(cè)定法的第一天或在測(cè)定法的全部三天添加Wnt3a。
圖16示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化后的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天100ng/ml激活素A結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180 (分圖B)、化合物19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3抑制劑BIO (分圖G))，其中僅在測(cè)定法的第一天添加測(cè)試化合物。示出了用熒光核探針和高內(nèi)涵分析確定的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。
圖17示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化后的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天100ng/ml激活素A結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180 (分圖B)、化合物19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3抑制劑BIO (分圖G))，其中在測(cè)定法的全部三天添加測(cè)試化合物。示出了用熒光核探針和高內(nèi)涵分析確定的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。
圖18示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化后的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天100ng/ml 的GDF-8結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180 (分圖B)、化合物 19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3抑制劑 BIO(分圖G))，其中僅在測(cè)定法的第一天添加測(cè)試化合物。示出了用熒光核探針和高內(nèi)涵分析確定的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。
圖19示出了根據(jù)實(shí)例15所述方法，在人胚胎干細(xì)胞向定形內(nèi)胚層分化后的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。將Hl細(xì)胞在多種定時(shí)暴露方案中暴露于如下物質(zhì)而總共處理三天100ng/ml 的GDF-8結(jié)合所示濃度的測(cè)試化合物(化合物181 (分圖A)、化合物180 (分圖B)、化合物 19 (分圖C)、化合物202 (分圖D)、化合物40 (分圖E)、化合物34 (分圖F)或GSK3抑制劑 BIO(分圖G))，其中在測(cè)定法的全部三天添加測(cè)試化合物。示出了用熒光核探針和高內(nèi)涵分析確定的細(xì)胞數(shù)產(chǎn)率。
圖20示出了根據(jù)實(shí)例16所述方法，在分化的全部多個(gè)步驟中細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或lOOng/ml⑶F-8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt3a處理第一天或結(jié)合用僅在第一天添加的2. 5 μ M多種化合物 (化合物19、化合物202、化合物40或GSK3抑制劑ΒΙ0)處理。圖20分圖A示出了在分化的第一個(gè)步驟后的細(xì)胞中，定形內(nèi)胚層標(biāo)志物CXCR4的FACS分析。CXCR4表達(dá)用熒光抗體探針和流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)量，得到所示的陽性細(xì)胞百分比。圖20分圖B示出了由分化的第一個(gè)步驟產(chǎn)生的歸一化S0X17蛋白表達(dá)(黑色柱條)和回收細(xì)胞數(shù)(白色柱條)的高內(nèi)涵圖像分析，從而測(cè)試了所示的對(duì)應(yīng)處理。圖20分圖C示出了從通過分化步驟5處理的培養(yǎng)物回收的相對(duì)細(xì)胞數(shù)的高內(nèi)涵圖像分析。圖20分圖D示出了通過分化步驟5處理的培養(yǎng)物的胰高血糖素蛋白表達(dá)的高內(nèi)涵圖像分析。圖20分圖E示出了通過分化步驟5處理的培養(yǎng)物的胰島素蛋白表達(dá)的高內(nèi)涵圖像分析。圖20分圖F示出了通過分化步驟5處理的培養(yǎng)物的細(xì)胞中胰高血糖素與胰島素表達(dá)的比率。為了進(jìn)行比較，分圖B、C、D、E和F中的表達(dá)值相對(duì)于在步驟1期間使用激活素A和Wnt3a的對(duì)照處理進(jìn)行歸一化。
圖21示出了根據(jù)實(shí)例17所述方法，在分化的全部多個(gè)步驟中細(xì)胞中的多種蛋白質(zhì)和RT-PCR標(biāo)志物的表達(dá)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或lOOng/ml ⑶F-8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt3a處理第一天或結(jié)合用僅在第一天添加的如下濃度的多種化合物(化合物181、化合物180、化合物19、化合物202、化合物40、化合物56 或GSK3抑制劑ΒΙ0)處理。示出了在分化的第一個(gè)步驟后細(xì)胞中定形內(nèi)胚層標(biāo)志物CXCR4 的FACS分析，其中處理包括激活素A (分圖Α)或GDF-8 (分圖B)與Wnt3a或多種化合物的組合。CXCR4表達(dá)用熒光抗體探針和流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)量，得到所示的陽性細(xì)胞百分比。在圖 21的后續(xù)分圖中，示出了通過在分化的第一個(gè)步驟期間使用激活素A或GDF-8進(jìn)行的各種處理后多種分化標(biāo)志物的歸一化RT-PCR值結(jié)合激活素A(分圖C)或GDF-8(分圖D)進(jìn)行處理的分化的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的標(biāo)志物；結(jié)合激活素A(分圖E)或GDF-8(分圖F)進(jìn)行處理的分化的第三個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的標(biāo)志物；結(jié)合激活素A(分圖G)或GDF-8(分圖H)進(jìn)行處理的分化的第四個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的標(biāo)志物；結(jié)合激活素A(分圖I)或GDF-8(分圖J)進(jìn)行處理的分化的第五個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的標(biāo)志物。在分化的第五個(gè)步驟結(jié)束時(shí)，進(jìn)行高內(nèi)涵分析以測(cè)量在使用激活素A(分圖K)或GDF-8(分圖M)的分化的第一個(gè)步驟期間對(duì)應(yīng)處理的回收細(xì)胞數(shù)。高內(nèi)涵分析還用于測(cè)量在分化的第五個(gè)步驟結(jié)束時(shí)回收細(xì)胞群體中的胰高血糖素和胰島素強(qiáng)度，對(duì)應(yīng)于在分化的第一個(gè)步驟期間用激活素A(分圖A)或GDF-8(分圖N) 進(jìn)行的處理。
圖22示出了根據(jù)實(shí)例18所述方法處理的細(xì)胞中多種蛋白質(zhì)和RT-PCR標(biāo)志物的表達(dá)。將Hl細(xì)胞進(jìn)行如下處理用lOOng/ml激活素A或lOOng/ml⑶F-8處理總共三天，結(jié)合用20ng/ml Wnt3a處理第一天或僅在第一天結(jié)合使用2. 5 μ M化合物40或2. 5 μ M化合物202處理全部三天。圖22分圖A示出了在分化的第一個(gè)步驟后的細(xì)胞中，定形內(nèi)胚層標(biāo)志物CXCR4的FACS分析。CXCR4表達(dá)用熒光抗體探針和流式細(xì)胞術(shù)來測(cè)量，得到所示的陽性細(xì)胞百分比。在圖22分圖B中，示出了與在分化的第一個(gè)步驟期間使用激活素A/Wnt3a 或GDF-8/化合物40或GDF-8/化合物202進(jìn)行的各種處理相對(duì)應(yīng)的分化的第四個(gè)步驟后回收的細(xì)胞中多種分化標(biāo)志物的歸一化RT-PCR值。
圖23示出了在接受如實(shí)例18所述分化方案第四個(gè)步驟結(jié)束時(shí)的細(xì)胞的 SCID-beige小鼠中檢測(cè)到的C肽水平。
圖M分圖A示出了在實(shí)例19所述分化方案的第一個(gè)步驟結(jié)束時(shí)細(xì)胞中由FACS 確定的CXCR4表達(dá)。分圖B示出了在實(shí)例19所述分化方案的第四個(gè)步驟結(jié)束時(shí)細(xì)胞中由 RT-PCR確定的多種基因的表達(dá)。示出了兩次不同的實(shí)驗(yàn)重復(fù)(重復(fù)1和重復(fù)2)，每一者均經(jīng)歷相同的處理方案。分圖C示出了接受了細(xì)胞的SCID-beige小鼠中檢測(cè)到的C肽水平， 所述細(xì)胞是在體外分化的第一個(gè)步驟期間用GDF-8和Wnt3a處理的分化方案的步驟四結(jié)束時(shí)的細(xì)胞。分圖D示出了接受了細(xì)胞的SCID-beige小鼠中檢測(cè)到的C肽水平，所述細(xì)胞是在體外分化的第一個(gè)步驟期間用GDF-8和化合物觀處理的分化方案的步驟四結(jié)束時(shí)的細(xì)胞。
圖25示出了根據(jù)實(shí)例22所述的本發(fā)明方法處理過的微載體珠上生長的細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)(分圖A)和CXCR4表達(dá)(分圖B)。將細(xì)胞在未處理的CytodeX3珠上培養(yǎng)(未分化)或在用lOOng/ml激活素A與20ng/ml Wnt3a組合進(jìn)行處理的CytodeX3珠上培養(yǎng) (AA/ffnt3a)或在采用了多種如下的組合⑶F-8進(jìn)行的處理的CytodeX3珠上培養(yǎng)50ng/ml GDF-8 與 2· 5 μ M 化合物 34 (化合物 34+8)；或 50ng/ml GDF-8 與 2· 5 μ M 化合物 34 和 50ng/ml PDGF (化合物 34+8+D)；或 50ng/ml GDF-8 與 2. 5 μ M 化合物 34 和 50ng/mlPDGF 及 50ng/ ml VEGF (化合物 34+8+D+V)；或 50ng/ml GDF-8 與 2. 5 μ M 化合物 34 和 50ng/ml PDGF 以及 50ng/ml VEGF 和 20ng/ml 蠅蕈醇(化合物 34+8+D+V+M)。
圖沈示出了如實(shí)例23所述在用本發(fā)明化合物處理后細(xì)胞的增殖。分圖B至分圖 I示出了使用化合物結(jié)合GDF-8的處理并在開始分化測(cè)定法后的第1天、第2天和第3天測(cè)量MTS OD讀數(shù)的分析結(jié)果。
圖27示出了在根據(jù)本發(fā)明方法處理過的微載體珠上生長細(xì)胞的多種蛋白質(zhì)和基因的表達(dá)。分圖A示出了在實(shí)例M所述分化方案的步驟一結(jié)束時(shí)細(xì)胞中由FACS確定的 CXCR4、⑶99和⑶9的陽性表達(dá)百分比。分圖B示出了從顯示分化通過分化方案步驟三的處理回收的細(xì)胞。分圖C示出了如在步驟中所示地處理并通過該方案的步驟三分化的細(xì)胞中表達(dá)的多種基因標(biāo)志物的ddCT值。
具體實(shí)施方式
將本發(fā)明的具體實(shí)施方式
部分分成以下幾個(gè)分部分，來描述或舉例說明本發(fā)明的某些特征、實(shí)施例或應(yīng)用，這是為了使公開內(nèi)容清楚起見，并非限制本發(fā)明。
定義
干細(xì)胞是由它們?cè)趩渭?xì)胞水平上既自我更新又分化產(chǎn)生子代細(xì)胞的能力來定義的未分化細(xì)胞，包括自我更新祖細(xì)胞、非更新祖細(xì)胞和末端分化細(xì)胞。干細(xì)胞的特征還在于其具有在體外由多種胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)分化成各種細(xì)胞譜系的功能細(xì)胞以及移植后產(chǎn)生多種胚層的組織和注入胚泡后基本上有助于大部分(如果不是所有的話) 組織形成的能力。
干細(xì)胞根據(jù)其發(fā)育潛能分為(1)全能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎和胚胎外細(xì)胞類型；( 多能，指能夠產(chǎn)生所有的胚胎細(xì)胞類型；C3)專能，指能夠產(chǎn)生細(xì)胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統(tǒng)內(nèi)能產(chǎn)生所有的細(xì)胞(例如造血干細(xì)胞(HSC)可產(chǎn)生的后代細(xì)胞包括HSC(自我更新型)、局限于血細(xì)胞的寡能祖細(xì)胞以及作為血液正常組分的所有細(xì)胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產(chǎn)生比多能干細(xì)胞更有限的細(xì)胞譜系亞群；以及( 單能干，指能夠產(chǎn)生單一細(xì)胞譜系(如生精干細(xì)胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的細(xì)胞獲得特化細(xì)胞(如神經(jīng)細(xì)胞或肌肉細(xì)胞)的特征的過程。分化的細(xì)胞或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞是已經(jīng)在細(xì)胞譜系中占據(jù)更特化的(“定向的”)位置的細(xì)胞。術(shù)語“定向的”當(dāng)應(yīng)用到分化的過程時(shí)，指在分化途徑中已經(jīng)進(jìn)行到這么一種程度的細(xì)胞在正常環(huán)境下，它會(huì)繼續(xù)分化成特定的細(xì)胞類型或細(xì)胞類型子集，且在正常環(huán)境下不能分化成另一細(xì)胞類型或回復(fù)到分化程度較低的細(xì)胞類型。去分化指細(xì)胞回復(fù)到細(xì)胞的譜系當(dāng)中特化(或定向)程度較低的地位的過程。如本文所用，“細(xì)胞的譜系”限定細(xì)胞的遺傳關(guān)系，即它來自哪些細(xì)胞和它能產(chǎn)生什么細(xì)胞。細(xì)胞譜系將細(xì)胞定位于發(fā)育和分化的遺傳計(jì)劃內(nèi)。譜系特異性標(biāo)志物是指與所關(guān)注譜系的細(xì)胞表型特異性相關(guān)并能夠用于評(píng)價(jià)非定向細(xì)胞向所關(guān)注譜系的分化的特征。
“ β -細(xì)胞譜系”是指對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子PDX-I和下列轉(zhuǎn)錄因子中的至少一種具有陽性基因表達(dá)的細(xì)胞NGN3、NKX2. 2、NKX6. U NEUROD, ISL1、HNF_3 3、MAFA、PAX4 或 PA)(6。表達(dá) β細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括β細(xì)胞。[0061]如本文所用，“表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”、或“第1階段細(xì)胞”或 “第ι階段”指表達(dá)至少一種如下標(biāo)志物的細(xì)胞SOX17、GATA4、HNF-3 0、GSC、CERl、Nodal、 FGF8、Brachyury、Mix樣同源盒蛋白、FGF4 CD48、脫中胚蛋白(eomesodermin，EOMES)、DKK4、 FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99或0TX2。表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括原條前體細(xì)胞、原條細(xì)胞、中內(nèi)胚層細(xì)胞和定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”是指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞PDX1、HNF-I β ,PTFl α、HNF6或HB9。表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞、原腸管細(xì)胞和后前腸細(xì)胞。
如本文所用，“表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞”或“第5階段細(xì)胞”或 “第5階段”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞NGN3、NEUR0D、ISL1、PDX1、NKX6. 1、PAX4或 PTF-Ia。表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞包括胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞、胰激素表達(dá)細(xì)胞、胰激素分泌細(xì)胞和b-細(xì)胞譜系的細(xì)胞。
如本文所用，“定形內(nèi)胚層”指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產(chǎn)生的細(xì)胞的特性并形成胃腸道及其衍生物的細(xì)胞。定形內(nèi)胚層細(xì)胞表達(dá)下列標(biāo)志物HNF-3i3、GATA4、 S0X-17, Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 或 MIXLl。
如本文所用，“胚胎外內(nèi)胚層”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞群體S0X7、AFP 或 SPARC。
如本文所用的，“標(biāo)志物”是在所關(guān)注細(xì)胞中差異表達(dá)的核酸或多肽分子。關(guān)于這一點(diǎn)，差異表達(dá)意指陽性標(biāo)志物的水平增加，而陰性標(biāo)志物的水平降低。與其他細(xì)胞相比， 所關(guān)注細(xì)胞中的核酸或多肽標(biāo)志物的可檢測(cè)水平足夠高或足夠低，使得可以使用本領(lǐng)域已知的多種方法識(shí)別所關(guān)注細(xì)胞，并將所關(guān)注細(xì)胞與其他細(xì)胞區(qū)相區(qū)分。
如本文所用，“中內(nèi)胚層細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞⑶48、脫中胚蛋白(EOMES)、SOXl7、DKK4、HNF—3 β、GSC、FGF17 或 GATA—6。
如本文所用的，“胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞”或“胰腺激素表達(dá)細(xì)胞”是指能夠表達(dá)至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、胰胰高血糖素、生長抑素和胰腺多肽。
如本文所用，“胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞”或“第4階段細(xì)胞”或“第4階段”指能夠表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞NGN3、NEUROD, ISLl、PDXl、PAX4 或 NKX2. 2。
如本文所用，“胰腺激素生成細(xì)胞”指能夠生成至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、 胰胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。
如本文所用，“胰腺激素分泌細(xì)胞”指能夠分泌至少一種下列激素的細(xì)胞胰島素、 胰胰高血糖素、促生長素抑制素和胰多肽。
如本文所用，“后前腸細(xì)胞”或“第3階段細(xì)胞”或“階段3”指能夠分泌至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞PDX1、HNFl、PTF-I α、HNF6、ΗΒ-9 或 PR0X-1。
如本文所用，“前原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞=Nodal或FGF8。
如本文所用，“原腸管細(xì)胞”或“第2階段細(xì)胞”或“第2階段”指能夠分泌至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞HNFl、HNF-4a。
如本文所用，“原條細(xì)胞”指表達(dá)至少一種下列標(biāo)志物的細(xì)胞=Brachyury、Mix樣同源盒蛋白或FGF4。
多能干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增和培養(yǎng)
11[0077]多能干細(xì)胞的特件描述
可通過(例如)以下方法來確認(rèn)多能干細(xì)胞的多能性將細(xì)胞注入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠的體內(nèi)，使用4%的多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后用組織學(xué)方法檢查來自三種胚層的細(xì)胞類型的證據(jù)。或者，可通過產(chǎn)生擬胚體并評(píng)估擬胚體的與三個(gè)胚層相關(guān)的標(biāo)志物的存在來確定多能性。
可以使用標(biāo)準(zhǔn)G帶技術(shù)并比較已公布的相應(yīng)靈長類物種的核型來分析增殖的多能干細(xì)胞系的核型。希望獲得具有“正常核型”的細(xì)胞，其意指細(xì)胞為整倍體，其中所有人染色體都存在并且沒有明顯的改變。
多能干細(xì)胞的來源
可使用的多能干細(xì)胞的類型包括從妊娠后形成的組織衍生而來的確立多能細(xì)胞系，包括在妊娠期間任何時(shí)間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時(shí)間通常是但不一定是在大約10至12周妊娠前。非限制性的例子是已建立的人胚胎干細(xì)胞系或人胚胎生殖細(xì)胞系，例如人胚胎干細(xì)胞系HI、H7和H9 (WiCell)。還可設(shè)想的是，在此類細(xì)胞的初始建立或穩(wěn)定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細(xì)胞將是直接取自源組織的原代多潛能細(xì)胞。另外合適的是取自已在不存在飼養(yǎng)細(xì)胞的情況下培養(yǎng)的多能干細(xì)胞群體的細(xì)胞。同樣合適的是突變型人胚胎干細(xì)胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens，GA)。
在一個(gè)實(shí)施例中，人胚胎干細(xì)胞是如Thomson等人所述制備(美國專利 No. 5, 843, 780 ；Science 282 :1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 133 ff. ，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)所描述方法制備人胚胎干細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施例中，如Takahashi等人(Cell 131 :1-12,2007)所述制備多能干細(xì)胞。
多能干細(xì)胞的培養(yǎng)
在一個(gè)實(shí)施例中，通常在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)多能干細(xì)胞，飼養(yǎng)細(xì)胞可以多種方式支持多能干細(xì)胞?；蛘撸谂囵B(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，所述培養(yǎng)系統(tǒng)基本上不含飼養(yǎng)細(xì)胞，但同樣支持多能干細(xì)胞的增殖而不會(huì)進(jìn)行顯著的分化。使用通過此前培養(yǎng)另一細(xì)胞類型而調(diào)理過的培養(yǎng)基來支持多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基來支持多能干細(xì)胞在無飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物中生長而不分化。
可將多能干細(xì)胞接種至合適的培養(yǎng)基質(zhì)上。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基質(zhì)是胞外基質(zhì)成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯(lián)物的一部分的成分。在一個(gè)實(shí)施例中，合適的培養(yǎng)基材是MATRIGEL (Becton Dickenson) 0 MATRIGEL 是來自于EngeIbreth-HoIm-Swarm腫瘤細(xì)胞的可溶性制劑，其在室溫下會(huì)發(fā)生膠化從而形成重構(gòu)基底膜。
其他的細(xì)胞外基質(zhì)組分和組分混合物適合作為替代物。取決于所擴(kuò)增的細(xì)胞類型，這可包括單獨(dú)的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙酰肝素等或者它們的各種組合。
可在存在可促進(jìn)細(xì)胞存活、增殖和保持理想特性的培養(yǎng)基存在的情況下，以合適的分布將多能干細(xì)胞接種于所述基質(zhì)上。所有這些特性可得益于對(duì)接種分布的認(rèn)真考慮并可容易地由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。[0089]合適的培養(yǎng)基可以由下列組分制成，例如為達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，Gibco#l 1965-092 ；Knockout達(dá)爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(K0 DMEM)， Gibco#10829-018 ；Ham ‘ s F12/50 % DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基；200mM 的 L-谷氨酰胺， Gibco#15039-027 ；非必需氨基酸溶液，Gibcol 1140-050 ； β -巰基乙醇，Sigma#M7522 ；人重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)，Gibco# 13256-0 。
帕育奸_遞月_體傾_
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供一種從多能干細(xì)胞產(chǎn)生胰腺激素生成細(xì)胞的方法， 該方法包括如下步驟
a.培養(yǎng)多能干細(xì)胞，
b.使多能干細(xì)胞分化成表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，
c.使表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，并且
d.使表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞分化成表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是胰腺激素生成細(xì)胞。在一個(gè)替代方面， 胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞是表達(dá)細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。表達(dá)細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞可表達(dá)PDXl和至少一種下列轉(zhuǎn)錄因子NGN3、NKX2. 2、NKX6. 1、NEUROD, ISLU HNF-3 β、MAFA, ΡΑΧ4或1^x6。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)β _細(xì)胞譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞是β-細(xì)胞。
適用于本發(fā)明的多能干細(xì)胞包括例如人胚胎干細(xì)胞系Η9(ΝΙΗ編碼WA09)、人胚胎干細(xì)胞系Hl (NIH編碼WA01)、人胚胎干細(xì)胞系H7(NIH編碼WA07)和人胚胎干細(xì)胞系 SA002 (Cellartisj^W )。同樣適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種下列多能細(xì)胞特征性標(biāo)志物的細(xì)胞ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、連接蛋白 43、連接蛋白 45、0CT4、S0X2、Nanog、hTERT、 UTF-I、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60 或 Tra 1-81。
可在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)多能干細(xì)胞。或者，可在細(xì)胞外基質(zhì)上培養(yǎng)多能干細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)可以是從小鼠肉瘤細(xì)胞提取的可溶性基底膜制劑(其可由BD Biosciences以商品名MATRIGEL 銷售)。或者，細(xì)胞外基質(zhì)可以是低生長因子MATRIGEL ?；蛘?，細(xì)胞外基質(zhì)可以是纖粘蛋白。在一個(gè)替代實(shí)施例中，將多能干細(xì)胞在包被有人血清的組織培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)和分化。
可在對(duì)組織培養(yǎng)基底進(jìn)行包被前，將細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行稀釋。用于稀釋細(xì)胞外基質(zhì)以及用于包被組織培養(yǎng)基材的合適方法的例子可見于Kleinman，H. K.等人，Biochemistry 25 :312(1986)和 Hadley，Μ. Α.等人，J. Cell. Biol. 101 :1511 (1985)。
在一個(gè)實(shí)施例中，細(xì)胞外基質(zhì)是MATRIGEL 。在一個(gè)實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 10稀釋的MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 15稀釋的MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 30稀釋的MATRIGEL 。 在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 60稀釋的MATRIGEL 。在一個(gè)實(shí)施例中， 細(xì)胞外基質(zhì)是低生長因子MATRIGEL 。在一個(gè)實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 10稀釋的低生長因子MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 15稀釋的低生長因子MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 30稀釋的低生長因子MATRIGEL 。在一個(gè)替代實(shí)施例中，組織培養(yǎng)基材包被有以1 60稀釋的低生長因子 MATRIGEL 。
定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自S0X17、GATA4、HNF-3 β、GSC、CERU Nodal、 FGF8、Brachyury, Mix 樣同源盒、FGF4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGFl7、GATA6、 CXCR4、C-Kit,⑶99和0TX2。適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為原條前體細(xì)胞。在一個(gè)替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為中內(nèi)胚層細(xì)胞。在一個(gè)替代方面，表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為定形內(nèi)胚層細(xì)胞。
胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物選自PDXl、HNF-I β、PTFl α、HNF6、ΗΒ9和PROXl。 適用于本發(fā)明的是表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞。
胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物選自NGN3、NEUROD, ISLU PDXU ΝΚΧ6. 1、ΡΑΧ4和 PTF-Ia。在一個(gè)實(shí)施例中，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞能夠表達(dá)以下激素中的至少一種胰島素、胰胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用于本發(fā)明的細(xì)胞為表達(dá)至少一種胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)方面，表達(dá)胰腺內(nèi)分泌譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞。胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰激素表達(dá)細(xì)胞?；蛘?，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞可以是胰激素分泌細(xì)胞。
胃汰娜_尉普胃紐龍力___成,
在本發(fā)明的一個(gè)方面，多能干細(xì)胞可通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞而分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含足夠量的GDF-8以引起多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
可在含有足夠量的GDF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天至約七天?；蛘?，可在含有足夠量GDF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天至約六天?；蛘?，可在含有足夠量 GDF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天至約五天?；蛘撸稍诤凶銐蛄縂DF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天至約四天。或者，可在含有足夠量GDF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天至約三天?；蛘?，可在含有足夠量GDF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天至約二天?；蛘?，可在含有足夠量GDF-8的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞約一天。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的⑶F-8。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的GDF-8。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 5ng/ml至約25ng/ml的⑶F-8。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約25ng/ml的⑶F-8。
在一個(gè)實(shí)施例中，包含足夠量⑶F-8的培養(yǎng)基還含有至少一種其他因子。在一個(gè)實(shí)施例中，所述至少一種其他因子選自EGF、FGF4、PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, VEGF, 蠅蕈醇、PD98059、LY294002, U0124、UO126 和丁酸鈉。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的EGF。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的EGF。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約50ng/ ml 的 EGF。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的FGF4。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的FGF4。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 50ng/ml 的 FGF4。[0111]在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的PDGF-A。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的PDGF-A。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 50ng/ml 的 PDGF-A。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的PDGF-B。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的PDGF-B。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 50ng/ml 的 PDGF-B。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的PDGF-C。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的PDGF-C。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 50ng/ml 的 PDGF-C。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的PDGF-D。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的PDGF-D。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 50ng/ml 的 PDGF-D。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約500ng/ml的VEGF。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約5ng/ml至約50ng/ml的VEGF。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 50ng/ml 的 VEGF。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約ΙμΜ至約200μΜ的蠅蕈醇。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約1 μ M至約20 μ M的蠅蕈醇。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約20 μ M
的蠅蕈醇。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約0. 1 μ M至約10 μ M的PD98059。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約0. 1 μ M至約1 μ M的PD98059。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約1 μ M 的 PD98059。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約0. 25μΜ至約25μΜ的LY^4002。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約0. 25 μ M至約2. 5 μ M的LY^4002。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 2. 5μΜ 的 LY294002。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約0. ΙμΜ至約ΙΟμΜ的U0124。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約0. ΙμΜ至約ΙμΜ的U0124。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約1 μ M的 U0124。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約0. ΙμΜ至約ΙΟμΜ的U0126。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約0. ΙμΜ至約ΙμΜ的U0126。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約1 μ M的 U0126。
在一個(gè)實(shí)施例中，使用濃度為約0.05 μ M至約5μ M的丁酸鈉。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約0. 05 μ M至約0. 5 μ M的丁酸鈉。在一個(gè)替代實(shí)施例中，使用濃度為約 0. 5μΜ的丁酸鈉。
在一個(gè)替代實(shí)施例中，所述至少一種其他因子選自苯胺-吡啶并三嗪、環(huán)苯胺-吡啶并三嗪、Ν-{[1-(苯基甲基)氮雜環(huán)庚烷-4-基]甲基}-2_吡啶-3-基乙酰胺、4-{14-(4-{[2-(吡啶-2-基氨基)乙基]氨基}-1，3，5_三嗪-2-基)批啶_2_基] 氧基} 丁-I-醇、3-({3-[4-({2-[甲基(吡啶-2-基)氨基]乙基}氨基)-1，3，5_三嗪-2-基]吡啶-2-基}氨基)丙-1-醇、N 4 -[2-(3-氟代苯基)乙基]-N 2 -[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基]吡啶并[2，3-d]嘧啶_2，4-二胺、1-甲基-N-[(4-吡
15啶-3-基_2-{[3-(三氟甲基)苯基]氨基}-1，3_噻唑-5-基)甲基]哌啶-4-甲酰胺、 1，1_ 二甲乙基{2-[4-({5-[3-(3-羥丙基)苯基]-4H-1，2，4-三唑_3_基}氨基)苯基] 乙基}氨基甲酸酯、1，1-二甲乙基{[3-({5-[5-(3-羥丙基)-2-(甲氧基)苯基]-1，3-噴唑_2_基}氨基)苯基]甲基}氨基甲酸酯、1-({5-[6-({4-[(4_甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-醇、1-({4-[6-({4-[(4_甲基哌嗪-1-基)磺酰基]苯基}氨基)吡嗪-2-基]噻吩-2-基}甲基)哌啶-4-甲酰胺和 2-{[4-(1-甲基乙基)苯基]氨基}-N-(2-噻吩-2-基乙基)-7，8-二氫吡啶并[4，3_d]嘧啶-6(5H)_甲酰胺。
本發(fā)明的化合物
本發(fā)明提供能夠使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物細(xì)胞的化合物。
在一個(gè)實(shí)施例中，能夠使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物細(xì)胞的化合物是式(1)的苯胺-吡啶并三嗪
N-氧化物形成藥用加成鹽及其立體異構(gòu)形式，其中
m代表1至4的整數(shù)；η代表1至4的整數(shù)；Z代表N或C ；
R1和R8各自獨(dú)立地代表氫、Het14、氰基、鹵素、羥基、Cp6烷氧基-、(^_6烷基_、單-或二(Ci_4烷基)氨基-羰基-、單-或二(Ci_4烷基)氨基-磺?；⒈畸u素取代的CV6烷氧基或者R1代表被一個(gè)或可能兩個(gè)或更多個(gè)選自羥基或鹵素的取代基取代的Cp6烷基；
R2和R9各自獨(dú)立地代表氫、Cp4烷基、C2_4烯基、Het^Het4-CV4烷基^Het5-CV4烷基羰基-、單-或二(CV4烷基)氨基-CV4烷基-羰基-或任選被一個(gè)或可能兩個(gè)或更多個(gè)選自氫、羥基、氨基或Cy烷氧基-的取代基取代的苯基；
R3和R7各自獨(dú)立地代表氫、C^4烷基、Het6Aet7-Ch4烷基_、任選被Het8-C^4烷氨基羰基-取代的c2-4烯基羰基-、c2-4烯基磺酰基-、C1^4烷氧基CV4烷基-或任選被一個(gè)或可能兩個(gè)或更多個(gè)選自氫、羥基、氨基或Ci_4烷氧基的取代基取代的苯基；
R4、R5、R6和Riq各自獨(dú)立地代表氫或任選被羥基取代的C^4烷基、Het9或C1^烷
氧基；
Het1和Het2各自獨(dú)立地代表選自吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、批啶基、嘧啶基、批嗪基、咪唑烷基或吡唑烷基的雜環(huán)，其中所述Het1和Het2任選被氨基、羥基、C1^4烷基、羥
基-C 1-4
烷基-、苯基、苯基-C 1-4 焼基 _、。—4 烷基-氧基-Ch烷基-單-或二(CH烷基)氨基-或氨基-羰基-取代；
Het3和Het6各自獨(dú)立地代表選自吡咯烷基或哌啶基的雜環(huán)，其中所述Het3和Het6 任選被一個(gè)或可能兩個(gè)或更多個(gè)選自(V4烷基、c3_6環(huán)烷基、羥基-(V4烷基-、cv4烷氧基CV4
W
權(quán)利要求
1.一種使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法，所述方法包括用培養(yǎng)基處理所述多能干細(xì)胞，持續(xù)足以使所述多能干細(xì)胞分化為表達(dá)所述定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的一段時(shí)間，所述培養(yǎng)基缺少激活素A且含有選自如下的化合物EGF、FGF4、PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D、VEGF、GDF-8、蠅蕈醇、PD98059、LY294002、 U0124.U0126 和丁酸鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的方法，其中所述缺少激活素A還含有至少一種其他選自如下的化合物苯胺-吡啶并三嗪和環(huán)苯胺-吡啶并三嗪。
專利摘要
本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化的方法。具體來講，本發(fā)明涉及使多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞的方法和組合物，所述方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述多能干細(xì)胞，所述培養(yǎng)基包含足夠量的GDF-8以引起所述多能干細(xì)胞分化為表達(dá)定形內(nèi)胚層譜系特征性標(biāo)志物的細(xì)胞。
文檔編號(hào)GKCN102159703SQ200980134123
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2009年6月30日
發(fā)明者C·帕門特, J·劉, J·戴維斯, P·G·A·邦尼特 申請(qǐng)人:森托科爾奧索生物科技公司導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan