專利名稱:通過改進谷物產(chǎn)量和品質(zhì)增加谷物價值的方法
通過改進谷物產(chǎn)量和品質(zhì)增加谷物價值的方法
發(fā)明背景 發(fā)明領域
本發(fā)明涉及表達轉(zhuǎn)基因檸檬酸合酶(⑶)的轉(zhuǎn)基因植物和使用方法。與同基因品 系對照(isoline control)相比較時，表達轉(zhuǎn)基因CS的轉(zhuǎn)基因植物、特別是在種子中表達 或在種子中表達并進一步靶向細胞區(qū)室如質(zhì)體時的轉(zhuǎn)基因植物具有更高水平的谷物產(chǎn)量 和/或氨基酸、尤其半胱氨酸、和/或油，其中所述的同基因品系對照不含有與種子偏好的 啟動子連接或還與細胞區(qū)室靶向序列有效連接的轉(zhuǎn)基因。
背景技術：
禾谷植物谷粒是人和動物的最重要可再生能量來源之一。隨著世界人口增加并且 可耕地有限，對食物、飼料、纖維和生物燃料的需求正在增加。增加每英畝谷物產(chǎn)量和增強 每英畝谷物營養(yǎng)價值以滿足這些需求是必需的和非常寶貴的。由于超過90%的谷物粒現(xiàn) 今用于動物飼料和乙醇生產(chǎn)，谷物是動物營養(yǎng)的最重要作物之一。黃色凹陷谷物的谷粒由 60-70%淀粉、8-10%蛋白質(zhì)和3-4%油組成。但是，即便含有這些有價值的飼料組分，黃色 凹陷谷物不含有充分的熱量和必需氨基酸以支持大多數(shù)動物中的最佳生長和發(fā)育。因此， 為彌補這些缺點，需要用其他養(yǎng)分補充基于黃色凹陷谷物的飼料。最常見地，黃色凹陷谷物 與豆粕混合以改善飼料的氨基酸組成。不幸地，動物缺少消化豆粕中存在的非淀粉基于的 多糖必需的酶，并且谷物和大豆飼料混合物產(chǎn)生高的糞便體積。此外，豆粕昂貴。另外，為 改進熱量含量，基于谷物的動物飼料也用脂肪補充，如動物內(nèi)臟和飼料級動物脂肪和植物 脂肪，所述的脂肪可以包括餐館、制皂和精煉工業(yè)的副產(chǎn)品。使用動物下水來補充牛飼料已 經(jīng)停止了，因為它與有關牛海綿狀腦病和克-雅氏病有關。改善谷物產(chǎn)量和谷物粒的營養(yǎng) 品質(zhì)將增加每英畝價值、每英畝能量，并且改善飼料效率并減少對環(huán)境的影響和與肉生產(chǎn) 相關的其他成本。
呼吸作用，包括三羧酸(TCA)循環(huán)，不僅提供用于合成貯藏化合物的能量，還產(chǎn)生 用于油和氨基酸生物合成的中間體。檸檬酸合酶(⑶)催化檸檬酸從草酰乙酸和乙酰CoA形 成。這是TCA循環(huán)中的第一關鍵步驟，所述的TCA循環(huán)通常存在于線粒體中。CS在TCA循環(huán) 和代謝中發(fā)揮重要作用。已經(jīng)嘗試工程化檸檬酸合酶以改進作物生產(chǎn)力。US2005/0137386 描述了用于獲得具有改善的養(yǎng)分攝取能力和有毒化合物耐受性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其 中所述的有毒化合物存在于土壤中。de la Fuente等人所做的研究顯示，煙草中銅綠假 單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)檸檬酸合酶基因的表達提高鋁耐受性(Science 276 1566-1568，1997)。Lopez等人報道了因有機酸增溶磷酸鹽的低可溶形式所致增強的磷攝取 (Nature Biotech 18 :450_453，2000)。但是，這種方法似乎受環(huán)境影響，因為使用這些相同 的植物以及被工程化表達檸檬酸合酶基因至更高水平的植物，另一個研究小組不能夠重復 這些研究結(jié)果(Delhaize 等人 Plant Physiology 125 :2059-2067,2001)
WO 2004/056968公開了通過近紅外光譜法測量時，與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ障啾容^，擬南芥屬(Arabidopsis)檸檬酸合酶基因(At3g58750)的過量表達引起籽油增加多 達7%。美國專利申請公開號2003/0233670和2005/0108791公開了來自苛養(yǎng)木桿菌 (Xyllelafastidia)、大腸桿菌(E. coli)、稻、玉米和大豆的檸檬酸合酶和它們在改善轉(zhuǎn)基 因植物的磷酸鹽攝取中的用途。已經(jīng)報道了過量表達線粒體形式和胞質(zhì)形式的檸檬酸合酶 改善模型植物中的磷酸鹽攝取(Lopez-Bucio等人，2000 ;Kayama等人，2000)。但是，存在 以下報道煙草中銅綠假單胞菌檸檬酸合酶基因的表達與增強的檸檬酸積累或流出不相關 (Plant Physiology，2001，第125卷2059-2067)。所述作者提出植物中的CS表達不太可 能是用于增強作物的鋁耐受性和磷營養(yǎng)的有力和輕易可再現(xiàn)策略。
盡管結(jié)合的氨基酸(蛋白質(zhì)組成)占據(jù)谷物種子中90-99%的總氨基酸，但是游 離氨基酸占據(jù)1-10%的總氨基酸。存在進一步增加必需氨基酸含量的嚴重挑戰(zhàn)。一個挑 戰(zhàn)是增加游離氨基酸濃度不總是導致總氨基酸增加，因為游離氨基酸流和摻入蛋白質(zhì)可以 變得有限的。再者，游離氨基酸的積累經(jīng)常與不利的農(nóng)藝性能如矮化生長(因而影響銷售 性)相關。從營養(yǎng)品質(zhì)角度看，理想谷粒將是具有改善含量的油、蛋白質(zhì)和必需氨基酸如纈 氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和/或精氨酸的谷粒。
持續(xù)存在對增加的谷物產(chǎn)量和對下述植物谷粒的需求，其中所述的植物谷粒具有 想要的農(nóng)藝特征和提高的必需氨基酸、蛋白質(zhì)或油水平。
發(fā)明概述
本發(fā)明提供了在轉(zhuǎn)基因植物種子中或在種子的胞內(nèi)區(qū)室中表達編碼檸檬酸合酶 (CS)蛋白的基因的轉(zhuǎn)基因植物和其部分，其中與不以這種方式表達轉(zhuǎn)基因檸檬酸合酶蛋白 的同基因品系(isoline)植物或種子相比較時，該CS賦予更高水平的谷物產(chǎn)量和/或更高 水平的氨基酸(如半胱氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和/或纈氨酸)和/或油。 本發(fā)明也包括使用本文中所述多核苷酸和載體以賦予所得轉(zhuǎn)基因植物和其部分經(jīng)濟重要 性狀的方法。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物和其部分，其包含在種子中或在種 子的胞內(nèi)細胞區(qū)室中表達的編碼異源檸檬酸合酶的多核苷酸，其中多核苷酸選自由以下多 核苷酸組成的組a)具有如SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的 多核苷酸；b)編碼具有如SEQ ID而16、17、18、19、22、23、對或25中所定義序列的多肽的 多核苷酸；c)與具有如SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核 苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；d)編碼與具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、 23,24或25中所定義序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；e)在嚴格 條件下與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、13、14或15中所定義序列的多核苷酸雜交 的多核苷酸；f)在嚴格條件下與編碼具有如SEQ ID而16、17、18、19、22、23、對或25中所 定義序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸；和g)與a)至f)的任一多核苷酸互補的多 核苷酸。前述轉(zhuǎn)基因植物的額外實施方案提供了該植物是單子葉植物或雙子葉植物，或更 具體地，該植物選自由玉米、小麥、稻、大麥、燕麥、黑麥、高粱、香蕉、黑麥草、豌豆、苜蓿、大 豆、胡蘿卜、旱芹、番茄、馬鈴薯、棉花、煙草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花 椰菜、萵苣和擬南芥(Arabidopsis thaliana)組成的組。前述轉(zhuǎn)基因植物的又一實施方案 提供了，其中該多核苷酸的表達能夠賦該植物經(jīng)濟相關的性狀并進一步其中該經(jīng)濟相關性 狀選自由以下性狀組成的組油含量超過同基因品系油含量增加至少2%、半胱氨酸含量超過同基因品系半胱氨酸含量增加至少4%和每英畝蒲式耳產(chǎn)量超過同基因品系每英畝蒲 式耳產(chǎn)量增加至少3蒲式耳。前述轉(zhuǎn)基因植物的另一個實施方案提供其中植物在谷物產(chǎn)量 上具有超過同基因品系谷物產(chǎn)量的每英畝約3-19蒲式耳增加。
另一個實施方案提供前述轉(zhuǎn)基因植物的種子，其中(a)該種子在選自由蘇氨酸、 半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和精氨酸組成的組中的一種或多種氨基酸方面具有超 過所述氨基酸在同基因品系中量的至少3%增加；或(b)該種子在半胱氨酸含量方面具有 超過同基因品系半胱氨酸含量的約4%-27%增加；或(c)該種子在甲硫氨酸含量方面具有 超過同基因品系甲硫氨酸含量的約2%-13%增加；或(c)該種子在油含量方面具有超過同 基因品系油含量的2%-10%增加。其他實施方案提供了從前述轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的種子，其 中該種子包含所述多核苷酸，并且又一實施方案提供了其中該多核苷酸在種子中的表達賦 予該種子不以同基因品系中相同水平存在的經(jīng)濟相關性狀。
在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了在所述種子中表達CS基因的轉(zhuǎn)基因植物種 子，其中所述種子包含農(nóng)藝或營養(yǎng)重要的經(jīng)濟相關性狀，其選自由以下性狀組成的組
a)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加至少3蒲式耳；
b)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加至少3蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多至少4%的半胱氨酸；
C)谷物產(chǎn)量超過同基因品系增加至少3蒲式耳/英畝并且種子比同基因品系種子 具有至少4%的半胱氨酸增加和至少2%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加至少3蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多至少4%的半胱氨酸和多至少2%的油。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及產(chǎn)生具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中 該方法包括步驟:A)將包含與多核苷酸有效連接的種子偏好轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的表達載體導 入該植物，其中該多核苷酸編碼能夠賦予經(jīng)濟相關性狀的多肽并且其中該多核苷酸選自由 以下多核苷酸組成的組
a)具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核苷 酸；
b)編碼具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽的
多核苷酸；
c)與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核
苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；
d)編碼與具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽
具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在嚴格條件下與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
義序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；
f)在嚴格條件下與編碼具有如SEQ ID NO 16、17、18、19、22、23、24或25中所定 義序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸；和
g)與a)至f)的任一多核苷酸互補的多核苷酸，和B)選擇具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn) 基因植物。
本發(fā)明的另一個實施方案提供了在種子的胞質(zhì)中過量表達活性異源檸檬酸合酶的轉(zhuǎn)基因植物和其部分，其中分離的CS蛋白被選自由以下多核苷酸組成的組中的多核苷 酸編碼
a)具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核苷 酸；
b)編碼具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽的
多核苷酸；
c)與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核
苷酸具有至少70%序列同一性的多核苷酸；
d)編碼與具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽
具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在嚴格條件下與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
義序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；
f)在嚴格條件下與編碼具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24或25中所定 義序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸；和
g)與a)至f)的任一多核苷酸互補的多核苷酸。
本發(fā)明的又一實施方案提供了包含與多核苷酸有效連接的種子偏好轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元 件的表達載體，其中多核苷酸選自由以下多核苷酸組成的組
a)具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核苷 酸；
b)編碼具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽的
多核苷酸；
c)與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核
苷酸具有70%序列同一性的多核苷酸；
d)編碼與具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽
具有至少70%序列同一性的多肽的多核苷酸；
e)在嚴格條件下與具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
義序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；
f)在嚴格條件下與編碼具有如SEQ ID NO 16、17、18、19、22、23、24或25中所定
義序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸；和
g)與a)至f)的任一多核苷酸互補的多核苷酸。
該表達載體還可以與胞內(nèi)靶向序列有效連接。另外，表達載體的種子偏好轉(zhuǎn)錄調(diào) 節(jié)元件可以是胚乳偏好的啟動子。本發(fā)明人確定了活性異源CS在種子的質(zhì)體或胞質(zhì)中的 靶向表達有效增加谷物產(chǎn)量和/或增加谷物養(yǎng)分含量如必需氨基酸半胱氨酸。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及產(chǎn)生具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中 該方法包括步驟:A)將包含如上所述的本發(fā)明多核苷酸的表達載體導入植物，其中該多核 苷酸的表達賦予該植物經(jīng)濟相關性狀；和B)選擇具有該經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物。在一 個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物的經(jīng)濟相關性狀選自由以下性狀組成的組
a)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加至少3蒲式耳；
b)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加至少3蒲式耳并且種子具有比同基因品系種子多至少4%的半胱氨酸；
C)谷物產(chǎn)量超過同基因品系增加至少3蒲式耳/英畝并且種子比同基因品系種子 具有至少4%的半胱氨酸增加和至少2%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加至少3蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多至少4%的半胱氨酸和多至少2%的油。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及產(chǎn)生具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中 該方法包括步驟:A)將包含如上所述的本發(fā)明多核苷酸的表達載體導入植物，其中該多核 苷酸的表達賦予該植物經(jīng)濟相關性狀；和B)選擇具有該經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物。在一 個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物的經(jīng)濟相關性狀選自由以下性狀組成的組
a)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加約3-19蒲式耳；
b)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加約3-19蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多約4-27%的半胱氨酸；
c)谷物產(chǎn)量超過同基因品系增加約3-19蒲式耳/英畝并且種子比同基因品系種 子具有約4-27%的半胱氨酸增加和約2-18%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加約3-19蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多約4-27%的半胱氨酸和多約2-7%的油。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及產(chǎn)生具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中 該方法包括步驟:A)將包含如上所述的本發(fā)明多核苷酸的表達載體導入植物，其中該多核 苷酸的表達賦予該植物經(jīng)濟相關性狀；和B)選擇具有該經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物。在一 個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物的經(jīng)濟相關性狀選自由以下性狀組成的組
a)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加約3-10蒲式耳；
b)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加約3-10蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多約4-15%的半胱氨酸；
c)谷物產(chǎn)量超過同基因品系增加約3-10蒲式耳/英畝并且種子比同基因品系種 子具有約4-15%的半胱氨酸增加和約2-10%的甲硫氨酸增加；和
d)谷物產(chǎn)量超過同基因品系每英畝增加約3-10蒲式耳并且種子具有比同基因品 系種子多約4-15%的半胱氨酸和多約2-5%的油。
本發(fā)明的另一個實施方案涉及產(chǎn)生具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中 該方法包括步驟:A)將包含如上所述的本發(fā)明多核苷酸的表達載體導入植物，其中該多核 苷酸的表達賦予該植物經(jīng)濟相關性狀；和B)選擇具有該經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物。在一 個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物的經(jīng)濟相關性狀選自由以下性狀組成的組
a)油含量超過同基因品系油含量的至少2%增加；
b)半胱氨酸含量超過同基因品系半胱氨酸含量的至少4%增加；
c)半胱氨酸含量超過同基因品系半胱氨酸含量的約4% -27%增加；
d)在選自由蘇氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸和精氨酸組成的組中的 一種或多種氨基酸方面超過所述氨基酸在同基因品系中量的至少約3%增加；和
e)種子中的油含量超過同基因品系種子中油含量的約2-10%增加。
本發(fā)明的另一個實施方案是由任一前述方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物和其部分。
附圖簡述[0065]圖la-b顯示基因和元件以及相應的SEQ ID NO。
圖 2 顯示 AnaCS (SEQ ID NO 19)、大腸桿菌 CSl (SEQ ID NO 16)、玉米 CSl (SEQ ID NO :24)、玉米 CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 CS (SEQ IDNO :20)、稻 CSl (SEQ ID NO :22)、稻 CS2 (SEQ ID NO :23)、酵母 CS1(SEQID NO :17)和酵母 CS2 (SEQ ID NO :18)的蛋白質(zhì)序列總 體同一性/相似性百分數(shù)。序列分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10， 空位延伸罰分=0. 05，空位分離罰分=8)。
圖 3 顯示 AnaCS (SEQ ID NO 19)、大腸桿菌 CSl (SEQ ID NO 16)、玉米 CSl (SEQ ID NO :24)、玉米 CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 CS (SEQ IDNO :20)、稻 CSl (SEQ ID NO :22)、稻 CS2 (SEQ ID NO :23)、酵母 CS1(SEQID NO :17)和酵母 CS2 (SEQ ID NO :18)的蛋白質(zhì)序列局 部同一性/相似性百分數(shù)。序列分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10， 空位延伸罰分=0. 05，空位分離罰分=8)。
圖 4 顯示 AnaCS (SEQ ID NO :7)、大腸桿菌 CSl (SEQ ID NO 1)、玉米 CSl (SEQ ID NO :14)、玉米 CS2(SEQ ID NO 15)、南瓜 CS (SEQ ID NO :9)、稻 CSl (SEQ ID NO: 12)、稻 CS2 (SEQ ID NO :13)、酵母 CSl (SEQ ID NO :3)和酵母 CS2 (SEQ ID NO :5)的 DNA 序列總體 同一性百分數(shù)。DNA分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10，空位延伸罰 分=0. 05，空位分離罰分=8)。
圖5顯示蛋白質(zhì)魚腥藻屬_CS (SEQ ID NO 19)、大腸桿菌_CS1 (SEQID NO :16)、 玉米 _CS1(SEQ ID NO :24)、玉米 _CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 _CS(SEQ ID N0:20)、稻_ CSl (SEQID NO :22)4S_CS2(SEQ ID NO :23)、酵母 _CS1 (SEQ ID NO 17)和酵母 _CS2 (SEQ ID NO 18)的系統(tǒng)發(fā)育關系。序列分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10， 空位延伸罰分=0. 05，空位分離罰分=8)。
圖6a-c 顯示魚腥藻屬 _CS (SEQ ID NO 19)、大腸桿菌 _CS1 (SEQ IDNO :16)、玉米 _ CSl (SEQ ID NO :24)、玉米_CS2(SEQ ID NO :25)、南瓜 _CS (SEQ ID NO :20) 4S_CS1 (SEQ ID NO :22)、稻 _CS2(SEQ ID NO :23)、酵母 _CS1 (SEQ ID NO 17)和酵母 _CS2 (SEQ ID NO 18) 的蛋白質(zhì)序列比對。序列分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10，空位延 伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。相同和保守的氨基酸以粗體大寫字母表示，而相似的 氨基酸以小寫字母表示。
圖 7 顯示玉米 _CS2 (SEQ ID NO :25)、南瓜 _CS (SEQ ID NO :20)和稻 CS2 (SEQ ID NO 23)的蛋白質(zhì)序列比對。序列分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10， 空位延伸罰分=0.05，空位分離罰分=8)。相同和保守的氨基酸以粗體大寫字母表示，而 相似的氨基酸以小寫字母表示。
圖 8 顯示玉米_CS1(SEQ ID NO :24)、南瓜 _CS (SEQ ID NO :20)、稻 _CS1 (SEQ ID NO :22)、酵母_CS1(SEQ ID NO :17)和酵母_CS2 (SEQ IDNO :18)的蛋白質(zhì)序列比對。序歹丨J 分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10，空位延伸罰分=0. 05，空位分離 罰分=8)。相同和保守的氨基酸以粗體大寫字母表示，而相似的氨基酸以小寫字母表示。
圖9顯示魚腥藻屬_CS (SEQ ID NO 19)和大腸桿菌_CS1 (SEQ IDNO :16)的蛋白 質(zhì)序列比對。序列分析在Vector NTI9軟件包中進行(空位開口罰分=10，空位延伸罰分 =0.05，空位分離罰分=8)。相同和保守的氨基酸以粗體大寫字母表示，而相似的氨基酸 以小寫字母表示。[0074]圖IOa顯示正在發(fā)育的玉米種子03DAP)中酵母CS2 (構(gòu)建體CS1008)的活性。實 心正方塊表示來自同基因品系對照谷物種子的天然CS活性并且空心正方塊表示玉米CS峰 和酵母CS2在級分四附近的額外活性峰。圖IOb顯示正在發(fā)育的玉米種子03DAP)中酵 母CS1(構(gòu)建體CS1012)的活性。實心正方塊表示來自同基因品系對照谷物種子的天然CS 活性并且空心正方塊表示玉米天然CS峰和酵母CSl在級分25附近的額外活性峰。按照以 下的相同模式實心正方塊表示未轉(zhuǎn)化的同基因品系中的天然玉米CS峰并且空心正方塊 表示正在發(fā)育的玉米種子03DAP)中轉(zhuǎn)基因CS的天然玉米CS峰和額外的活性峰；圖IOc 顯示酵母CSl (CS1001)在約第25級分處的活性峰，圖IOd顯示大腸桿菌CSl (CS 1002)在 約第33級分處的活性峰，圖IOe顯示大腸桿菌CSl (CS1004)在約第32級分處的活性峰，圖 IOf顯示魚腥藻屬CS(CS10(^)在約第30級分處的活性峰，圖IOg顯示魚腥藻屬CS(CS1007) 在約第30級分處的活性峰。

圖11顯示表達包含異源CS的多種構(gòu)建體中的CS對T2種子中谷粒養(yǎng)分組成的影 響。
圖12顯示在(通過事件與專利近交種B雜交產(chǎn)生的)谷物雜種中表達(尤其與 種子偏好的啟動子有效連接或與種子偏好的啟動子和胞內(nèi)靶向序列有效連接的)異源CS 對谷物產(chǎn)量和組成的影響(通過3-6個位置所測試的全部事件的平均數(shù))。
圖13顯示在個體事件(選自對谷物產(chǎn)量(6個位置)和組成(來自3個位置的F2 谷粒)測試過的構(gòu)建體中的兩個事件)中(通過事件與專利近交種B雜交產(chǎn)生)的谷物雜 種中表達(尤其與種子偏好的啟動子有效連接或與種子偏好的啟動子和胞內(nèi)靶向序列有 效連接的)異源CS對谷物產(chǎn)量和組成的影響。
圖14顯示(通過事件與專利近交種A、B和C分別雜交產(chǎn)生的)3個谷物雜種中表 達異源CS (大腸桿菌CSl和酵母CS》的影響。在跨越4個中西部州的12個位置測試谷物 產(chǎn)量。在3個位置進行F2谷粒的養(yǎng)分組成測試。
圖15顯示(通過事件與專利近交種A、B和C分別雜交產(chǎn)生的)3個谷物雜種中表 達異源CS(具有不同啟動子和胞內(nèi)靶向作用的酵母CSl)的影響。谷物產(chǎn)量在跨越4個中 西部州的12個位置測試。在3個位置進行F2谷粒的養(yǎng)分組成測試。
發(fā)明詳述
可以通過參考本發(fā)明實施方案的以下詳述和其中所包含的實施例更輕易地理 解本發(fā)明。除非另外說明，本文中所用的術語將根據(jù)相關領域技術人員的常規(guī)用法進 行理解。除了下文所提供術語的定義之外，分子生物學領域中常見術語的定義也可以 在 Rieger 等人，1991Glossary of Genetics !Classical and Molecular,第 5 版，柏林 Springer-Verlag ；禾口在 CurrentProtocols in Molecular Biology, F. Μ· Ausubel 等人編 著，CurrentProtocols,Greene Publishing Associates,Inc 與 John Wiley & Sons,Inc. 之間的合資公司(1998Supplement)中找到。
在本申請書的全文范圍內(nèi)，參考了多種出版物。全部這些出版物及在這些出版物 中引用的那些參考文獻的公開因而以全文并入本申請作為參考，以更充分地描述本發(fā)明所 屬領域的狀態(tài)。本申請要求美國臨時專利申請60/061，231的優(yōu)先權(quán)益，該文獻因而通過 引用方式并入本申請。用于克隆、DNA分離、擴增與純化、用于涉及DNA連接酶、DNA聚合 酶、限制性核酸內(nèi)切酶等的酶促反應的標準技術和多種分離技術是本領域技術人員已知并通常采用的那些技術。在 Sambrook 和 Russell，2001MolecularCloning，第 3 版，Cold Spring Harbor, Plainview, New York ;Sambrook 等人，1989Molecular Cloning,第 2 版， Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, New York ；Mani at is 等人，1982Molecular Cloning, Cold SpringHarbor Laboratory, Plainview, New York ；Wu (編著)1993Meth. Enzymo 1. 218，第 I 部份；Wu (編著)1979Meth Enzymo 1. 68 ;Wu 等人，(編著)1983Meth. Enzymo1. 100 和 101 ；Grossman 和 Moldave(編著)1980Meth. Enzymol. 65 ；Miller(編 著)1972Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York ；Old 和 Primrose,1981Principles of Gene Manipulation, University of CaliforniaPress,Berkeley ;Schleif 和Wensink, 1982Practical Methods in MolecularBiology ；Glover (編著)1985DNA Cloning，第 I 和 II 卷，IRL Press, Oxford, UK ；Hames 和 Higgins (編著)1985Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, UK ； 以及 Setlow 和 Hollaender 1979Genetic Engineering !Principles and Methods,第 1-4 卷，Plenum Press, New ^rk中描述了眾多標準技術。使用的縮寫和命名視為該領域中的 標準并且通常用于專業(yè)期刊(如本文中所引用的那些期刊)中。
如本文中所用的術語“轉(zhuǎn)基因”指通過實驗操作導入細胞的基因組中的任何多核 苷酸。轉(zhuǎn)基因可以是天然DNA或非天然DNA?！疤烊弧?DNA (也稱作“內(nèi)源” DNA)意指一種多 核苷酸，其可以天然存在于向其中導入該多核苷酸的宿主物種的細胞中。“非天然”DNA(也 稱作“外源”DNA)意指從不同于宿主物種的細胞中起源的多核苷酸。非天然DNA可以包括 具有一些修飾的天然DNA，其中不可以在宿主生物中找到所述的修飾。
如本文中所用的“轉(zhuǎn)基因植物種子”意指具有穩(wěn)定整合至種子基因組中的目的轉(zhuǎn) 基因的植物種子。“植物種子”可以包括但不限于近交種子、通過雄性親本系與雄性親本系 雜交所產(chǎn)生的Fl雜交種子、從Fl雜交種長出的F2種子和來自群體的任意種子?！巴?品系(isoline)” 或“等基因系(isogenic line) ” 或“等基因植物(isogenic plant)” 意 指從其衍生本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的未轉(zhuǎn)化的親本系或任意植物種子。
根據(jù)上下文，如本文中所用的術語“植物”可以理解為意指完整植物、植物細 胞、植物器官、植物種子和其后代。詞語“植物”也指任意植物，包括其部分，并且可以包 括但不限于作物植物。植物部分包括但不限于莖、根、小苗、果實、胚珠、雄蕊、葉、胚、分 生組織區(qū)、愈傷組織、配子體、孢子體、花粉、小孢子、下胚軸、子葉、花藥、萼片、花瓣、花 粉、種子等。植物的類別總體上如適用于轉(zhuǎn)化技術的高等和低等植物那么廣泛，所述植 物包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物、木賊屬(horsetail)、 裸蕨類植物(psilophyte)、苔蘚類植物和多細胞藻類。所述植物可以源于選自苜蓿 屬(Medicago)、番爺屬(Lycopersicon)、蕓苔屬(Brassica)、黃瓜屬(Cucumis)、爺屬 (Solanum)、胡桃屬(Juglans)、錦葵屬(Gossypium)、蘋果屬(Malus)、葡萄屬(Vitis)、金 魚草屬(Antirrhinum)、楊屬(Populus)、草莓屬(Fragaria)、擬南芥屬(Arabidopsis)、 云杉屬(Picea)、辣椒屬(Capsicum)、藜屬(Chenopodium)、菊屬(Dendranthema)、牽 牛屬(Pharbifis)、松屬(Pinus)、豌豆屬(Pisum)、稻屬(Oryza)、玉蜀黍?qū)?Zea)、小 麥屬(Triticum)、黑小麥屬(Triticale)、黑麥屬(Secale)、黑麥草屬(Lolium)、大 麥屬(Hordeum)、大豆屬(Glycine)、黃杉屬(Pseudotsuga)、伽藍菜屬(Kalanchoe)、 甜菜屬(Beta)、向日葵屬(Helianthus)、煙草屬(Nicotiana)、甜瓜屬(Cucurbita)、薔薇屬(Rosa)、草莓屬(Fragaria)、百脈根屬(Lotus)、苜蓿屬(Medicago)、驢食草屬 (Onobrychis)、車軸草屬(trifolium)、胡盧巴屬(Trigonella)、豇豆屬(Vigna)、柑橘屬 (Citrus)、亞麻屬(Linum)、老鸛草屬(Geranium)、木薯屬(Manihot)、胡蘿卜屬(Daucus)、 蘿卜屬(Raphanus)、白芥屬(Sinapis)、顛茄屬(Atropa)、曼陀羅屬(Datura)、天仙子 屬(Hyoscyamus)、煙草屬(Nicotiana)、碧冬茄屬(Petunia)、毛地黃屬(Digitalis)、 Majorana、菊芋屬(Ciahorium)、萵苣屬(Lactuca)、雀麥屬(Bromus)、天門冬屬 (Asparagus)(Antirrhinum) >(Heterocallis) >7Κ^ 1]Μ (Nemesis)
葵屬(Pelargonium)、稷屬(Panieum)、狼尾草屬(Pennisetum)、毛直屬(Ranunculus)、千里 光屬(Senecio)、喇叭舌屬(&ilpiglossis)、紫水晶屬(Browaalia)、菜豆屬(Phaseolus)、 燕麥屬(Avena)和蔥屬(Allium)組成的組中的屬。如本文中所用的“植物”可以是 單子葉作物植物，如，例如禾谷類，包括小麥(普通小麥(Triticus aestivum))、大麥 (Hordeum vulgare)、高粱(兩色蜀黍(Sorghum bicolor))、黑麥(Secalecereala)、黑小麥 (triticale)、玉米(玉蜀黍(Zea mays))、稻(Oryza sativa)、甘蔗，和樹，包括蘋果樹、桃 樹、柑桔樹(quince)、李樹(plum)、櫻桃樹(cherry)、梨樹(peach)、油桃樹(nectarine)、 杏樹(apricot)、木瓜(papaya)、芒果(mango)、楊樹(poplar)、松(pine)、紅杉(sequoia)、 雪松(cedar)和櫟樹(oak)?！爸参铩笨梢允请p子葉作物植物，如豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿 卜、旱芹、番茄、馬鈴薯、棉花、煙草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜 (broccoli)、萵苣和擬南芥。
“產(chǎn)量”是每個土地面積收獲的谷物。例如，在谷類作物的情形時，產(chǎn)量一般被度量 為每英畝的蒲式耳數(shù)或每公頃的噸數(shù)。
當談及本發(fā)明的CS蛋白使用時，“酶促活性的”意指在轉(zhuǎn)基因植物中表達的轉(zhuǎn)基因 具有CS活性。
術語“約”在本文中用來意指大約、大致、左右和在...范圍內(nèi)。當術語“約”與一 個數(shù)字范圍一起使用時，它通過擴展界限值高于和低于所述數(shù)值而修飾此范圍。通常，術語 “約”在本文中用來修飾某數(shù)值高于和低于所述值達10%以上或以下(更高或更低)的變
已
如本文中所用的，“氨基酸含量”意指總氨基酸的量，包括游離氨基酸和蛋白質(zhì)形 式的結(jié)合性氨基酸。本文中提及的氨基酸、蛋白質(zhì)、油和淀粉的全部百分數(shù)是干重百分數(shù)。 在本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物種子中增加的氨基酸優(yōu)選地選自由天冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、半胱 氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和色氨酸組成的組。更優(yōu)選地， 本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物種子在選自由天冬氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、甲硫氨 酸、異亮氨酸、組氨酸、賴氨酸、精氨酸和色氨酸組成的組中的一種或多種氨基酸方面顯示 超過等基因植物種子的所述氨基酸增加至少5%。
本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物種子的油含量超過等基因植物種子的油含量增加至少2%。 在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物種子的油含量超過等基因植物種子的油含量增加至少 4%。在另一個實施方案中，轉(zhuǎn)基因植物種子的油含量超過等基因植物種子的油含量增加約 2-10%。
本發(fā)明包括了用包含分離的多核苷酸的表達載體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因植物。在另一個實 施方案中，本發(fā)明的該多核苷酸具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義的序列。在另一個實施方案中，該多核苷酸編碼具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、 23、對或25中所定義序列的多肽。在又一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含了與具有 如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核苷酸至少約50-60% 或至少約 60-70% 或至少約 70-80%、80-85%、85-90 %、90-95% 或至少約 95%、96%、 97^^98^^99%或更多同一或相似的多核苷酸或其部分。在又一個實施方案中，本發(fā)明的 多核苷酸包含了編碼多肽的多核苷酸，其中所述多肽與具有如SEQ ID NO 16,17,18,19, 22，23，對或25中所定義序列的多肽至少約50-60%或至少約60-70%或至少約70_80%、 80-85%、85-90%、90-95%或至少約 95%、96%、97%、98%、99%或更多同一或相似。序列 同一性和序列相似性定義如下。
實施方案之一包括具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定
義序列的多核苷酸或編碼多肽的多核苷酸的等位基因變體，其中所述的多肽具有如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24或25中所定義的序列。如本文中所用的，術語“等位基因變體” 指含有多態(tài)性的多核苷酸，其中所述的多態(tài)性導致由該核苷酸編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列 改變并存在于天然群體(例如，植物物種或變種)內(nèi)部。此類天然等位基因變異一般可以 導致編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸的1-5%差異或所編碼蛋白質(zhì)的1-5%差異。等位基因的變體 可以通過對許多不同植物中的目的核酸測序進行鑒定，所述的測序可以通過使用例如用來 鑒定那些植物中相同基因遺傳基因座的雜交探針輕易地實施。一種多核苷酸的任意及全部 此類核酸變異和所得氨基酸多態(tài)性或作為天然等位基因變異之結(jié)果并且不改變所編碼蛋 白質(zhì)的功能活性的蛋白質(zhì)變異意圖處在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
如本文中所用，術語“在嚴格條件下雜交”意圖描述用于雜交和洗滌的條件，在所 述的條件下彼此至少60%相似或相同的核苷酸序列一般仍保持相互雜交。在另一個實施方 案中，所述條件是這樣的，從而彼此至少約65 %或至少約70 %或至少約75 %或至少約80 % 或更多相似或同一的序列一般仍保持相互雜交。此類嚴格條件是本領域技術人員已知的并 且描述如下。嚴格條件的優(yōu)選的非限制例子是在6X氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中在約45°C 雜交，隨后在50-65°C于0. 2X SSC, 0. 1% SDS中進行一次或多次洗滌。
在又一個實施方案中，分離的核酸互補于如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、 14或15中所定義的多核苷酸，或編碼具有如SEQ IDNO 16、17、18、19、22、23、24或25中所 定義序列的多肽的多核苷酸，或與如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定 義多核苷酸具有70%序列同一性的多核苷酸，或編碼與如SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、 M或25中所定義多肽具有70%序列同一性的多肽的多核苷酸，或與如SEQ ID N0:l、2、 3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義多核苷酸雜交的多核苷酸，或與編碼具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、23、24或25中所定義序列的多肽的多核苷酸雜交的多核苷酸。如本 文中所用，“互補的”多核苷酸指根據(jù)標準Watson-Crick互補性法則能夠進行堿基配對的那 些多核苷酸。具體而言，嘌呤將與嘧啶進行堿基配對以形成鳥嘌呤與胞嘧啶配對(G:C)和 在DNA情況下腺嘌呤與胸腺嘧啶配對(A:T)或在RNA情況下腺嘌呤與尿嘧啶配對(A:U)的 組合。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸包含了具有如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、 7、8、12、13、14或15中所定義序列的多核苷酸或編碼具有如SEQ ID NO :16、17、18、19、22、 23,24或25中所定義序列的多肽的多核苷酸或前述多核苷酸同源物之任一種，其中所述多核苷酸編碼賦予植物中經(jīng)濟相關性狀的CS。另外，本發(fā)明的多核苷酸可以僅包含如SEQ ID NO :1、2、3、4、5、6、7、8、12、13、14或15中所定義的多核苷酸的或編碼下述多肽的多核苷酸 的或其同源物的編碼區(qū)的一部分，例如，可以用作探針或引物的片段，其中所述多肽具有如 SEQ ID N0:16、17、18、19、22、23、24 或 25 中所定義的序列。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物種子可以通過使用轉(zhuǎn)化單子葉植物或雙子葉植物的任何 已知方法將CS基因轉(zhuǎn)化入植物來產(chǎn)生。用于將多核苷酸導入植物基因組和用于從植物 組織或植物細胞再生植物的許多方法是已知的。例如見Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC 出版社，BocaRaton，F(xiàn)lorida))，第 6/7 章，第 71-119 頁(199 ；White FF(1993)Vectorsfor Gene Transfer in Higher Plants ；Transgenic Plants,第 1 卷， Engineering and Utilization, Kung 禾口 Wu R 編著，Academic Press, 15-38 ；Jenes B 等 Α (1993)Techniques for Gene Transfer :Transgenic Plants，第 1 卷，Engineering and Utilization，Kung禾口 R. Wu編著，Academic Press，第 128—143 頁；Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol42 :205-225 ；Halford NG,Shewry PR(2000)Br Med Bull 56(1) :62-73 中。
轉(zhuǎn)化方法可以包括直接和間接轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導的 DNA攝入、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化(US 4，536，475)、使用基因槍的生物彈射擊法(Fromm ME等 人，(1990)Bio/Technology. 8(9) :833-9 ;Gordon-Kamm 等人，(1990)Plant Cell 2:603)、 電穿孔法、在包含DNA的溶液中孵育干燥胚和顯微注射。在這些直接轉(zhuǎn)化法的情況下，所用 的質(zhì)粒不需要滿足任何特殊要求?？梢允褂煤唵蔚馁|(zhì)粒，如PUC系列、pBR322、M13mp系列 等那些質(zhì)粒。如果欲從轉(zhuǎn)化的細胞再生完整的植物，則額外的選擇標記基因優(yōu)選地位于該 質(zhì)粒上。直接轉(zhuǎn)化技術同樣地適用于雙子葉植物和單子葉植物。
也可以借助農(nóng)桿菌(Agrobacterium)通過細菌感染(EP 0116718)、借助病毒載 體通過病毒感染(EP 0067553 ；US 4, 407, 956 ；WO 95/34668 ；WO 93/03161)或借助花粉 (EP 0270356 ；WO 85/01856 ；US 4, 684,611)實施轉(zhuǎn)化。基于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化技術是本領域 熟知的。農(nóng)桿菌菌株(例如，根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumrhizogenes))包含質(zhì)粒(Ti或Ri質(zhì)粒)和T-DNA元件，所述質(zhì)粒(Ti或 Ri質(zhì)粒)和T-DNA元件在用農(nóng)桿菌感染后轉(zhuǎn)移至植物。T-DNA(轉(zhuǎn)移的DNA)整合入植物細 胞的基因組。該T-DNA可以位于Ri-或Ti-質(zhì)粒上或分別地包含于所謂雙元載體中。用 于農(nóng)桿菌介導的轉(zhuǎn)化的方法在例如Horsch RB等人(198Qkience 225 :1229中描述。在 例如 White FF, Vectors for GeneTransfer in Higher Plants, Transgenic Plants,第 1 卷，Engineering andUtilization, S. D. Kung 禾口 R. Wu 編著，Academic Press, 1993,第 15-38 頁；Jenes B 等人，Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants,第 1 卷， Engineering and Utilization, S. D. Kung 禾口 R. Wu 編著，AcademicPress, 1993,第 128-143 M ；Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol PlantMolec Biol 42 :205-225 ^ ! 過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物。
使用如美國專利號4, 945, 050 ；5，036，006 ；5，100，792 ；5，302，523 ；5，464，765 ； 5，120,657 ；6, 084, IM等中所述的粒子轟擊法，可以將CS基因轉(zhuǎn)化到谷物植物中?？梢允?用如美國專利號 5，591,616 ；5，731，179 ；5, 981,840 ；6，162,965 ；6，420，630，美國專利申請 公開號2002/0104132等中所述的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，制備本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因谷物種子。備選地，可以使用適用于谷物中的質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因谷物種子。煙草中的質(zhì)體轉(zhuǎn)化 法在例如^)1^6111 )等人(1994)Nucleic Acids Res. 22,3819-3824 ；Ruf 等人(2001)Nature Biotechnol. 19，870-875 ；Kuroda 等人 O001)PlantPhysiol. 125,430-436 ；Kuroda 等人 (2001)Nucleic Acids Res. 29，970-975 ;Hajdukiewica 等人(2001)Plant J. 27，161-170 ； 和Corneille等人(2001)Plant J. 72，171-178中描述。使用phiC31噬菌體整合酶的額外 質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法在Lutz等人QO(M)The Plant J. 37，906中公開。額外的轉(zhuǎn)化方法包括但不 限于表1中的以下原材料和方法
表 1
權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)基因植物和其部分，包含編碼異源檸檬酸合酶的多核苷酸，該多核苷酸在種子中 或在種子的胞內(nèi)細胞區(qū)室中或在種子的胞質(zhì)中表達，其中多核苷酸選自由以下多核苷酸組 成的組a)具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸；b)編碼具有SEQID NO 18中所定義序列的多肽的多核苷酸；c)與具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性的多 核苷酸；d)編碼與具有SEQID NO :18中所定義序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的 多核苷酸；e)在嚴格條件下與具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；f)在嚴格條件下與編碼具有SEQID NO :18中所定義序列的多肽的多核苷酸雜交的多 核苷酸；和g)與a)至f)的任一多核苷酸互補的多核苷酸。
2.從權(quán)利要求
1的植物產(chǎn)生的種子，其中多核苷酸在種子中的表達賦予該種子在同基 因品系中不存在的或不以同基因品系中相同水平存在的經(jīng)濟相關性狀。
3.權(quán)利要求
2的種子，其中經(jīng)濟相關性狀是谷物產(chǎn)量相對于同基因品系而言增加每英 畝至少3蒲式耳。
4.權(quán)利要求
1的植物，其中多核苷酸具有SEQID NO :5或6中所定義的序列或多核苷 酸編碼具有SEQ ID NO 18中所定義序列的多肽。
5.權(quán)利要求
1的植物，其中多核苷酸與具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷 酸具有至少70%序列同一性或多核苷酸編碼與具有SEQ ID NO :18中所定義序列的多肽具 有至少70%序列同一性的多肽。
6.權(quán)利要求
1的植物，其中植物是單子葉植物、雙子葉植物或選自由玉米、小麥、稻、 大麥、燕麥、黑麥、高粱、香蕉、黑麥草、豌豆、苜蓿、大豆、胡蘿卜、旱芹、番茄、馬鈴薯、棉花、 煙草、辣椒、油菜籽油菜、甜菜、卷心菜、花椰菜、青花椰菜、萵苣和擬南芥(Arabidopsis thaliana)組成的組。
7.權(quán)利要求
1的植物，其中植物在谷物產(chǎn)量上具有超過同基因品系谷物產(chǎn)量的每英畝 約3-19蒲式耳增加。
8.表達載體，其包含與多核苷酸有效連接的種子偏好的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件，其中多核苷酸 選自由以下多核苷酸組成的組a)具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸；b)編碼具有SEQID NO 18中所定義序列的多肽的多核苷酸；c)與具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸具有70%序列同一性的多核苷酸；d)編碼與具有SEQID NO :18中所定義序列的多肽具有至少70%序列同一性的多肽的 多核苷酸；e)在嚴格條件下與具有SEQID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸雜交的多核苷酸；f)在嚴格條件下與編碼具有SEQID NO :18中所定義序列的多肽的多核苷酸雜交的多 核苷酸；和g)與a)至f)的任一多核苷酸互補的多核苷酸。
9.權(quán)利要求
8的表達載體，其中種子偏好的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件還與胞內(nèi)細胞區(qū)室靶向序列 有效連接。
10.權(quán)利要求
8的表達載體，其中種子偏好的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件是胚乳偏好的啟動子。
11.權(quán)利要求
8的表達載體，其中多核苷酸具有SEQID NO :5或6中所定義的序列或 多核苷酸與具有SEQ ID NO :5或6中所定義序列的多核苷酸具有至少70%序列同一性。
12.權(quán)利要求
8的表達載體，其中多核苷酸編碼具有SEQID NO :18中所定義序列的多 肽或多核苷酸編碼與具有SEQ ID NO :18中所定義序列的多肽具有至少70%序列同一性的 多肽。
13.產(chǎn)生包含經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中該方法包括步驟a)將權(quán)利要求
8、9或10的表達載體導入植物中，其中多核苷酸編碼能夠賦予經(jīng)濟相關 性狀的多肽；和b)選擇顯示經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物。
14.權(quán)利要求
13的方法，其中經(jīng)濟相關性狀是每英畝蒲式耳產(chǎn)量超過同基因品系每 英畝蒲式耳產(chǎn)量增加至少3蒲式耳或是谷物產(chǎn)量超過同基因品系谷物產(chǎn)量每英畝增加約 3-19蒲式耳。
15.由權(quán)利要求
13或14的方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因植物和其部分。
專利摘要
本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物，其表達編碼檸檬酸合酶(CS)的轉(zhuǎn)基因，其中本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物種子的特征是與不表達該轉(zhuǎn)基因的同基因品系相比較時，蛋白質(zhì)、必需氨基酸或油的產(chǎn)量增加和/或水平增強；并且本發(fā)明也提供了產(chǎn)生具有經(jīng)濟相關性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法并提供了包含編碼檸檬酸合酶的多核苷酸的表達載體。
文檔編號C12N15/82GKCN102066565SQ200980122107
公開日2011年5月18日 申請日期2009年6月10日
發(fā)明者S·哈丁, 關漢平, 徐範錫 申請人:巴斯夫植物科學有限公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan