專利名稱:一種用于城市剩余污泥中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種用于城市剩余污泥中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)中城市剩余污 泥的病原菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
沙門氏菌屬腸桿菌科，革蘭氏陰性腸道桿菌，感染沙門氏菌的人或帶菌者的糞便 污染食品，食用后會(huì)導(dǎo)致食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國(guó)所有種類的細(xì)菌性食物中毒中， 沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)細(xì)菌性食物中毒也以沙門氏菌為首位。 2010年8月17日加利福尼亞州衛(wèi)生部門宣布，加州多個(gè)地區(qū)暴發(fā)沙門氏菌疫情，自6月迄 今接到266例患病報(bào)告。初步調(diào)查顯示，多數(shù)病人食用雞蛋后染病。這些雞蛋被證實(shí)遭到 沙門氏菌污染。
城市剩余污泥由于來(lái)自城市生活污水處理，其中含有大量的腸道細(xì)菌、病毒、原生 動(dòng)物、寄生蟲等，這些微生物絕大部分都將隨污水處理進(jìn)入污泥，在污泥的農(nóng)業(yè)土地利用過(guò) 程中，通過(guò)污染地表水、地下水、形成氣溶膠等多種途徑而擴(kuò)散到環(huán)境中，這些隨污泥進(jìn)入 環(huán)境中的病原微生物對(duì)人體健康和環(huán)境安全造成了巨大的潛在威脅。而沙門氏菌作為其中 主要的病原菌之一，為防止其擴(kuò)散污染環(huán)境，對(duì)其進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量檢測(cè)具有重要的意 義。
目前對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)多見于食品檢測(cè)及醫(yī)療衛(wèi)生分析，技術(shù)手段也大多數(shù)只關(guān) 注定性鑒定，例如食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沙門氏菌的檢驗(yàn)(GB 4789. 4
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的本發(fā)明目的是提供一種定量檢測(cè)城市剩余污泥中沙門氏菌的方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種用于城市剩余污泥中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法，步驟 為
(1)污泥樣品的梯度稀釋以及前增菌培養(yǎng)
稱取5g城市剩余污泥，加入盛有45mL緩沖蛋白胨水(BPW)的250mL錐形瓶中，渦旋 震蕩5-lOmin，混合均勻得泥水混合物；用緩沖蛋白胨水稀釋混勻的泥水混合物，得到各 個(gè)稀釋梯度，設(shè)5-7個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)3-5個(gè)重復(fù)樣，于 36°C 士 1°C培養(yǎng)8 h-18h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；此階段采用普通高營(yíng)養(yǎng)、無(wú)選擇性培養(yǎng)基直接梯度稀釋，一方面可以實(shí)現(xiàn)MPN法定量 檢測(cè)，另一方面可以使那些“致傷”的細(xì)菌復(fù)蘇及使所有微生物生長(zhǎng)。
(2)選擇性增菌培養(yǎng)
移取步驟(1)所得各管中菌液0. l-o. 5mL加入到裝有5mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液TTB 的試管中，42 °C培養(yǎng)18-24h ；
四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)作為一種沙門氏菌選擇性增菌液選擇性較強(qiáng)，能促進(jìn)沙 門氏菌的生長(zhǎng)，強(qiáng)烈抑制污泥中非沙門氏菌的生長(zhǎng)。
(3)顯色培養(yǎng)基分離鑒別
分別用接種環(huán)取步驟(2)所得各管中的菌液一環(huán)劃線接種到亞硫酸鉍瓊脂BS平板上， 36°C 士 1°C培養(yǎng)40h-48h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落；
根據(jù)生化鑒定結(jié)果，沙門氏菌菌落為黑色有金屬光澤、棕褐色或灰色，菌落周圍培養(yǎng)基 可呈黑色或棕色；有些菌株形成灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。
(4)用MPN計(jì)數(shù)軟件計(jì)算得出結(jié)果
根據(jù)生化鑒定結(jié)果，確定最大或然數(shù)MPN結(jié)果，用MPN Calculator軟件計(jì)算得出污泥 中最大可能的沙門氏菌濃度。
所述緩沖蛋白胨水BPW的配置配方為蛋白胨lO.Og，氯化鈉5. 0g，磷酸氫二鈉 (含12個(gè)結(jié)晶水)9. 0g，磷酸二氫鉀1.5g，用蒸餾水定容至1000mL。將上述成分?jǐn)嚮炀鶆颍?靜置約lOmin，煮沸溶解，調(diào)節(jié)最終pH至7. 2 士0. 2 ;121°C高壓滅菌15min。
所述四硫磺酸鈉煌綠增菌液TTB的配置配方為蛋白胨9g，牛肉膏粉4. 5g，氯 化鈉2. 7g，碳酸鈣40. 5g，無(wú)水硫代硫酸鈉31. 9g，牛膽鹽5g，用蒸餾水或去離子水定容至 1000mL。取上述成分充分混合，調(diào)節(jié)最終pH至7.0 士 0.2。攪拌加熱煮沸至完全溶解，分裝 于三角瓶中，每瓶100mL。將三角瓶放入滅菌鍋中，121°C高壓滅菌20min，冷卻至30°C，每 100mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入四硫磺酸鈉煌綠增菌液配套試劑(SR0040) 2支，混合均勻。即配即 用，不宜放置過(guò)久。
所述亞硫酸鉍瓊脂BS的配置配方為蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，葡萄糖5g，硫酸 亞鐵0. 3g，磷酸氫二鈉4g，瓊脂18g，亞硫酸鈉6g，檸檬酸鉍銨2g，煌綠0. 025g。稱取上 述成分充分混合后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入蒸餾水或去離子水定容至lOOOmL，調(diào)節(jié)最終pH至 7. 5士0.2。攪拌加熱煮沸至完全溶解，冷至55°C，搖勻，傾入無(wú)菌平皿中備用，無(wú)需高壓滅 菌。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明通過(guò)MPN計(jì)數(shù)方法結(jié)合沙門氏菌檢驗(yàn)食品安全國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)方法，僅利用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法既實(shí)現(xiàn)了城市剩余污泥中沙門氏菌定量檢測(cè)的需要，又由于 選擇性效果明顯，避免了污泥中大量雜菌的干擾，有利于沙門氏菌的準(zhǔn)確快速定量。本發(fā)明 為制定和改進(jìn)城市剩余污泥處理處置以及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)等方面具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際指
導(dǎo)意義o


圖1城市剩余污泥中沙門氏菌在TTB增菌液中的培養(yǎng)特征。
圖2城市剩余污泥中沙門氏菌在BS培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。
圖3MPN Calculator初始化時(shí)顯示結(jié)果。[0017]圖4輸入脫水前實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算后MPN Calculator顯示結(jié)果。
圖5輸入脫水后實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算后MPN Calculator顯示結(jié)果。
具體實(shí)施方式
測(cè)定江蘇無(wú)錫某污水處理廠二沉池脫水前后剩余污泥中沙門氏菌的數(shù)量，具體步 驟如下
⑴污泥樣品的梯度稀釋以及前增菌培養(yǎng)稱取脫水前后剩余污泥各5g污泥樣品加入 盛有45mL緩沖蛋白胨水(BPW)的250mL錐形瓶中，渦旋震蕩lOmin，使混合均勻，取混勻的 泥水混合液0. 5mL加入到盛有4. 5mL緩沖蛋白胨水的試管中依次得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)6 個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度設(shè)三個(gè)重復(fù)，于36°C培養(yǎng)8 h。
⑵選擇性增菌培養(yǎng)分別移取梯度稀釋前增菌各管中菌液0. lmL加入到裝有 5mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液(TTB)的試管中，42°C培養(yǎng)24h。
⑶顯色培養(yǎng)基分離鑒別分別用接種環(huán)取各管中的菌液一環(huán)劃線接種到亞硫酸鉍 瓊脂(BS)平板上，36°C培養(yǎng)40h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落，發(fā)現(xiàn)平板上菌落特征唯一， 選擇性效果比較好，菌落為黑色有金屬光澤，菌落周圍培養(yǎng)基呈黑色或棕色；有些菌株形成 灰綠色的菌落，周圍培養(yǎng)基不變。挑取典型菌落進(jìn)行生化鑒定(廣東環(huán)凱研制的生化鑒定 盒)，證實(shí)為沙門氏菌。
⑷用MPN計(jì)數(shù)軟件計(jì)算得出結(jié)果根據(jù)生化鑒定結(jié)果，對(duì)平板上肉眼可見的特征 性菌落進(jìn)行確認(rèn)，確定有沙門氏菌的平板為陽(yáng)性，沒有沙門氏菌的平板為陰性，按陰性和陽(yáng) 性反應(yīng)所對(duì)應(yīng)的稀釋度，記錄試驗(yàn)結(jié)果(見表1、2)，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)輸入MPN Calculator軟件， 計(jì)算樣品中沙門氏菌的含量。
表1脫水前剩余污泥中沙門氏菌試驗(yàn)結(jié)果
稀釋度10—11(T21(T310_41(T51(T6重復(fù)管數(shù)333333陽(yáng)性管數(shù)333330管中污泥含量(g)0. 50. 050. 0050. 00050.000050.000005
表2脫水后剩余污泥中沙門氏菌MPN結(jié)果
稀釋度10—11(T21(T310_41(T51(T6重復(fù)管數(shù)333333陽(yáng)性管數(shù)333320管中污泥含量(g)0. 50. 050. 0050. 00050.000050.000005
MPN計(jì)數(shù)是一種應(yīng)用概率理論來(lái)估算細(xì)菌濃度的方法。MPN計(jì)數(shù)是將待測(cè)樣品作一系 列稀釋，一直稀釋到將少量(如lmL)的稀釋液接種到新鮮培養(yǎng)基中沒有或極少出現(xiàn)生長(zhǎng)繁 殖。根據(jù)沒有生長(zhǎng)的最低稀釋度與出現(xiàn)生長(zhǎng)的最高稀釋度，采用“最大或然數(shù)”理論，可以 計(jì)算出樣品單位體積中細(xì)菌數(shù)的近似值。具體地說(shuō)，菌液經(jīng)多次10倍稀釋后，一定量菌液 中細(xì)菌可以極少或無(wú)菌，然后每個(gè)稀釋度取3—5次重復(fù)接種于適宜的液體培養(yǎng)基中。培養(yǎng) 后，將有菌液生長(zhǎng)的最后3個(gè)稀釋度(即臨界級(jí)數(shù))中出現(xiàn)細(xì)菌生長(zhǎng)的管數(shù)作為數(shù)量指標(biāo)，由 最大或然數(shù)表上查出近似值，再乘以數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù)，即為原菌液中的含菌 數(shù)。
以往研究者往往通過(guò)相應(yīng)稀釋法測(cè)數(shù)統(tǒng)計(jì)表(如GB/T 4789. 38-2008中用MPN計(jì)數(shù)大腸桿菌數(shù)量使用了大腸桿菌MPN檢索表)查得細(xì)菌近似值。而本發(fā)明應(yīng)用了 MPN Calculator軟件，一方面應(yīng)用此軟件使得計(jì)數(shù)更為簡(jiǎn)單方便，另一方面MPN檢索表只限于 3-4個(gè)稀釋度，而MPN Calculator軟件能達(dá)到7個(gè)稀釋度，且稀釋度選擇并不需要像MPN檢 索表那樣標(biāo)準(zhǔn)化，每個(gè)稀釋度下的重復(fù)管數(shù)也可以不同。
在實(shí)施例中，具體計(jì)算過(guò)程如下選擇稀釋度為6個(gè)稀釋度，輸入表1、2中的結(jié)果， 即每個(gè)稀釋度下重復(fù)管數(shù)和得出的陽(yáng)性管數(shù)以及各稀釋梯度試管中污泥的含量，見圖3可 通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算即得出污泥中最大可能的沙門氏菌濃度，單位為MPN/g。計(jì)算結(jié)果為脫水前 污泥樣品中沙門氏菌的濃度為4. 8X 104MPN/g濕泥(圖4)，脫水后污泥樣品中沙門氏菌的濃 度為1.9X104MPN/g濕泥(圖5)。此方法使用單位為MPN/g，主要是與GB/T 4789. 38-2008 中MPN方法計(jì)數(shù)大腸桿菌形成統(tǒng)一，大腸菌群的是MPN/100g，MPN是一個(gè)估算值，由于方法 不一樣，和cfu/g或個(gè)/g并不能直接換算。
權(quán)利要求
一種用于城市剩余污泥中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法，其特征在于步驟為(1)污泥樣品的梯度稀釋以及前增菌培養(yǎng)稱取5g城市剩余污泥，加入盛有45mL緩沖蛋白胨水BPW的250mL錐形瓶中，渦旋震蕩5 10min，混合均勻得泥水混合物；用緩沖蛋白胨水稀釋混勻的泥水混合物，得到各個(gè)稀釋梯度，設(shè)5 7個(gè)稀釋度；采用三管或者五管平行法，每個(gè)稀釋度設(shè)3 5個(gè)重復(fù)樣，于36℃±1℃培養(yǎng)8 h 18h，直至試管中混合液只呈輕微渾濁停止培養(yǎng)，稱之為菌液；(2)選擇性增菌培養(yǎng)移取步驟(1)所得各管中菌液0.1 0.5mL加入到裝有5mL四硫磺酸鈉煌綠增菌液TTB的試管中，42℃培養(yǎng)18 24h；(3)顯色培養(yǎng)基分離鑒別分別用接種環(huán)取步驟(2)所得各管中的菌液一環(huán)劃線接種到亞硫酸鉍瓊脂BS平板上，36℃±1℃培養(yǎng)40h 48h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落；(4)用MPN計(jì)數(shù)軟件計(jì)算得出結(jié)果根據(jù)生化鑒定結(jié)果，確定最大或然數(shù)MPN結(jié)果，用MPN Calculator軟件計(jì)算得出污泥中最大可能的沙門氏菌濃度。
專利摘要
一種用于城市剩余污泥中沙門氏菌的定量檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)中城市剩余污泥的病原菌檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域：
。檢測(cè)步驟如下①污泥樣品的梯度稀釋以及前增菌培養(yǎng)；②選擇性增菌培養(yǎng)；③顯色培養(yǎng)基分離鑒別；④用MPN計(jì)數(shù)軟件計(jì)算得出結(jié)果。本發(fā)明結(jié)合了MPN方法和食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中沙門氏菌檢測(cè)方法，既實(shí)現(xiàn)了城市剩余污泥中沙門氏菌檢測(cè)的需要，又由于選擇性效果明顯，避免了污泥中大量雜菌的干擾，有利于沙門氏菌的快速定量。本發(fā)明為制定和改進(jìn)城市剩余污泥處理處置以及應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)等方面具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際指導(dǎo)意義。
文檔編號(hào)C12Q1/10GKCN101993909SQ201010567097
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年12月1日
發(fā)明者劉和, 王燕, 符波, 陳燕 申請(qǐng)人:江南大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan