本發(fā)明屬于土壤污染修復(fù)，具體涉及一種塑料降解復(fù)合微生物制劑及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、塑料地膜覆蓋在農(nóng)作物種植中有著廣泛的應(yīng)用，其具有提高土壤溫度，保持土壤水分，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量等優(yōu)點。但是隨著塑料地膜對農(nóng)作物的覆蓋率提高，一季農(nóng)事活動后，由于農(nóng)膜厚度過薄，農(nóng)膜未得到回收，大量滯留在土壤中。

2、農(nóng)用土壤中廢棄農(nóng)膜碎片的積累，會導(dǎo)致嚴(yán)重后果，具體如下：

3、1）會使農(nóng)田土壤結(jié)構(gòu)破壞，水分流動遇阻，導(dǎo)致土壤水分不均，引起板結(jié)，土壤抗旱性和保水性就會降低；另外，土壤殘留的大粒徑農(nóng)膜碎片會直接阻礙作物根系伸長，導(dǎo)致植物根系欠發(fā)達，吸水、吸肥能力減弱，以上均會影響農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。

4、2）塑料地膜殘留物部分降解后會產(chǎn)生有機化合物以及粒徑≤5mm的微塑料，這些物質(zhì)的長期累積將影響植物生長和土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性。

5、3）納米微塑料有進入植物組織的可能，從而產(chǎn)生進入食物鏈的風(fēng)險。

6、目前，我國使用最廣泛的農(nóng)用塑料地膜材質(zhì)是聚乙烯（pe），它是由乙烯單體經(jīng)聚合得到一類熱塑性樹脂，具有良好的穩(wěn)定性、電絕緣性，耐低溫性、無臭無毒、疏水性強、耐強酸強堿等優(yōu)點。正因為這些特性，聚乙烯在土壤中極難降解，研究人員通過對c14標(biāo)記的聚乙烯地膜降解情況進行跟蹤監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，在土壤填埋10年后，其降解率僅為0.2%?~?0.5%?，F(xiàn)有塑料的降解方式主要有非生物降解和生物降解兩種方式。其中，非生物降解指的是由于光、機械力、空氣或溫度等環(huán)境因素的作用，使塑料中的碳?xì)浠衔锇l(fā)生理化性質(zhì)變化。而生物降解指的是微生物利用自身吸附作用在廢棄塑料表面形成“生物膜”（或稱“塑料圈”），然后通過分泌相關(guān)酶參與一系列的生物氧化反應(yīng)將高分子塑料聚合物最終分解成ch4、h2o、co2、生物質(zhì)和無機化合物。

7、生物降解塑料的方式具有環(huán)保性、生物安全性、減少填埋和焚燒等優(yōu)點，但是在實際應(yīng)用過程中，微生物降解的速度較慢，需要很長時間才能觀察到降解效果，另外許多能夠降解塑料的微生物需要在特定環(huán)境下進行反應(yīng)，在自然環(huán)境中難以持續(xù)維持其降解效率，這嚴(yán)重影響了生物降解塑料的發(fā)展。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種塑料降解復(fù)合微生物制劑及其制備方法，以解決上述采用微生物進行生物降解塑料的過程，降解效率較慢，以及微生物在自然環(huán)境中難以維持其降解效率的問題。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明第一方面提供了一種塑料降解復(fù)合微生物制劑，塑料降解復(fù)合微生物制劑包括混合菌和固體吸附載體；

4、混合菌的原料包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱棲熱菌、熱噬淀粉芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、溶蛋白芽孢桿菌、鮑側(cè)支鐵還原單胞菌、解脂復(fù)膜孢酵母；

5、固體吸附載體包括分子篩以及分布于分子篩中的tio2、zno、cu2o和fe3o4。其中，tio2、zno、cu2o和fe3o4的質(zhì)量比為1：1：（0.5~0.8）：（0.2~0.4）。

6、優(yōu)選的，復(fù)合微生物制劑的含水率低于28%，總菌數(shù)含量大于2.5×109?cfu/g。

7、針對目前現(xiàn)有技術(shù)中微生物降解塑料的降解速率較慢的問題，本發(fā)明針對性地對微生物種類進行了設(shè)計，本發(fā)明中的微生物包括嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱棲熱菌、熱噬淀粉芽胞桿菌、解淀粉芽孢桿菌、溶蛋白芽孢桿菌、鮑側(cè)支鐵還原單胞菌、解脂復(fù)膜孢酵母，多種微生物協(xié)同作用，提高了制劑對塑料的降解效率。分析原因：嗜熱脂肪芽孢桿菌通常能夠產(chǎn)生多種酶，如脂肪酶、蛋白酶等，可以分解脂肪和蛋白質(zhì)類物質(zhì)，在高溫條件下，它可以幫助快速分解塑料中的脂肪族聚酯成分。嗜熱棲熱菌能在高溫環(huán)境中生存并活躍，它可以產(chǎn)生多種熱穩(wěn)定的酶，有助于降解塑料中耐熱的成分。熱噬淀粉芽胞桿菌能產(chǎn)生α-淀粉酶等多種酶類，有助于分解塑料中的淀粉基成分或其他碳水化合物。解淀粉芽孢桿菌同樣是產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，它可以通過分解塑料中的淀粉基質(zhì)，為其他微生物提供易于利用的碳源。溶蛋白芽孢桿菌可以產(chǎn)生蛋白酶，有助于分解塑料中含有的蛋白質(zhì)或其他肽鏈結(jié)構(gòu)。鮑側(cè)支鐵還原單胞菌能夠還原鐵離子并可能參與電子轉(zhuǎn)移過程，有助于塑料降解過程中的氧化還原反應(yīng)，加速降解。解脂復(fù)膜孢酵母可以產(chǎn)生多種酶，特別是脂酶，能夠分解脂肪酸和其他脂類物質(zhì)，有助于降解塑料中的脂肪族部分。本發(fā)明中使用不同微生物產(chǎn)生的酶類可以分解塑料的不同組分，如脂肪、蛋白質(zhì)、碳水化合物等，從而實現(xiàn)全面降解。某些微生物可能產(chǎn)生有助于其他微生物生長的副產(chǎn)品，或者改變環(huán)境條件（如ph值），有利于其他微生物的活動。每種微生物占據(jù)不同的生態(tài)位，有的適合在初期階段起作用，有的則在后期發(fā)揮更大作用，形成了一個有序的降解過程。因此這些微生物菌種能夠協(xié)同作用共同促進了塑料的高效降解。

8、本發(fā)明繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，塑料降解復(fù)合微生物制劑大多應(yīng)用于戶外，戶外的環(huán)境難以控制，在不同的地區(qū)又存在四季變化，夏季最高溫度可以達到45攝氏度左右，冬季最高溫度可以低至-30攝氏度，甚至更低，單獨的微生物菌劑很容易受到環(huán)境的影響。針對此問題，首先，本發(fā)明在微生物菌劑的成分設(shè)計上出發(fā)，包括嗜熱菌類和非嗜熱菌類，嗜熱菌類通常在較高溫度下（通常是50℃以上）表現(xiàn)出最佳活性，它們的酶具有較高的熱穩(wěn)定性，能夠在高溫下保持活性，從而保證在高溫環(huán)境下的降解效率。非嗜熱菌產(chǎn)生的酶則在較低溫度下更加活躍，它們的酶活性不會因為溫度下降而顯著降低。在高溫條件下，嗜熱菌的代謝活動可能會產(chǎn)生一些中間產(chǎn)物或副產(chǎn)品，這些物質(zhì)可以為非嗜熱菌提供養(yǎng)料。反之亦然，非嗜熱菌在較低溫度下的代謝活動也可能為嗜熱菌創(chuàng)造更有利的條件。這種相互利用的機制有助于提高整個體系的代謝效率，進而提高塑料降解效率。其次，本發(fā)明中將液體混合菌吸附于固體吸附載體中，其中的分子篩能夠為微生物提供一個物理屏障，減少外界環(huán)境（如溫度變化、水分流失等）對微生物的影響，從而保護微生物的活性，這種保護作用尤其在高溫或低溫條件下尤為重要，因為極端溫度可能會直接損害微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。固體吸附載體還可以為微生物創(chuàng)造一個相對穩(wěn)定的微環(huán)境，即使外部環(huán)境溫度變化，載體內(nèi)部的小環(huán)境仍可以保持相對恒定的狀態(tài)，有助于微生物維持其代謝活動。另外，固體吸附載體的存在還可以促進微生物在塑料表面的附著，增加了微生物與塑料基質(zhì)的接觸面積，有助于提高降解效率。此外，附著在載體上的微生物更容易在溫度變化時維持其位置，減少了因溫度波動導(dǎo)致的微生物脫落損失。因此本發(fā)明通過液體混合菌和固體吸附載體的協(xié)同使用提高了制劑在自然環(huán)境下使用的壽命。

9、還需要說明的是，本發(fā)明中使用的固體吸附載體不是簡單的分子篩，還具有特定比例的tio2、zno、cu2o和fe3o4光催化劑，在實際應(yīng)用過程中，這些材料不僅能夠利用光催化作用降解塑料，還能夠與微生物菌種產(chǎn)生協(xié)同作用，促進微生物活性。尤其是fe3o4與鮑側(cè)支鐵還原單胞菌之間的協(xié)同作用，鮑側(cè)支鐵還原單胞菌可以將電子傳遞給fe3o4，將其還原成fe2+。這一過程不僅為微生物提供了能量，而且有助于塑料的降解，因為電子傳遞過程中可能伴隨著有機物的氧化。fe3o4作為電子受體的存在可以促進鮑側(cè)支鐵還原單胞菌的生長和代謝活動，進而提高其對塑料的降解能力。fe3o4的還原過程也可能產(chǎn)生一些中間產(chǎn)物，這些產(chǎn)物可能進一步促進其他微生物的降解活動。

10、本發(fā)明第二方面提供了一種塑料降解復(fù)合微生物制劑的制備方法，包括以下步驟：

11、（1）將活化培養(yǎng)完成的嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱棲熱菌、熱噬淀粉芽胞桿菌接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌液一；

12、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱棲熱菌和熱噬淀粉芽胞桿菌的接種數(shù)量之比為（1.5~2）:（3~4）：1；

13、（2）將活化培養(yǎng)完成的解淀粉芽孢桿菌、溶蛋白芽孢桿菌、鮑側(cè)支鐵還原單胞菌和解脂復(fù)膜孢酵母接種至發(fā)酵培養(yǎng)基上發(fā)酵培養(yǎng)，得到菌液二；

14、解淀粉芽孢桿菌、溶蛋白芽孢桿菌、鮑側(cè)支鐵還原單胞菌和解脂復(fù)膜孢酵母的接種數(shù)量之比為（2~3）：（1~5）：（1~2）：1；

15、（3）將菌液一和菌液二混合，得到液體菌；

16、（4）將硅源加入到含有鈉源和鋁源的堿性水溶液中，混合得到分子篩前驅(qū)體溶液；

17、向分子篩前驅(qū)體溶液中加入tio2、zno、cu2o和fe3o4攪拌均勻，分別在20℃、40℃和60℃下恒溫攪拌12~24h，得到形成晶核的分子篩前驅(qū)體溶液；

18、在形成晶核的分子篩前驅(qū)體溶液于密閉反應(yīng)釜中加熱至90~100℃進行晶化反應(yīng)，過濾和干燥后，得到固體吸附載體；

19、（5）將液體菌與固體吸附載體按質(zhì)量比1：（1.5~3）進行混合，經(jīng)載體吸附和干燥，獲得微生物制劑。

20、優(yōu)選的，步驟（1）和步驟（2）中，

21、發(fā)酵培養(yǎng)基以質(zhì)量百分比計，組成如下：3~5%大豆蛋白胨，5~10%葡萄糖，3~5%蜜糖，8~10%玉米酵粉，0.01~2%磷酸氫二鉀，0.01~2%磷酸二氫鉀，0.01~2%檸檬酸三胺，0.2~1%硫酸鎂以及8~12%稻殼粉，余量為水。

22、優(yōu)選的，步驟（1）中，嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱棲熱菌和熱噬淀粉芽胞桿菌于發(fā)酵罐中完成發(fā)酵，發(fā)酵罐攪拌速度為30~60rpm，發(fā)酵條件為：溫度50~62℃，發(fā)酵時長24~36小時，溶氧值do?3.5~4.5mg/l，ph為6~8。

23、優(yōu)選的，步驟（2）中，解淀粉芽孢桿菌、溶蛋白芽孢桿菌、鮑側(cè)支鐵還原單胞菌和解脂復(fù)膜孢酵母于發(fā)酵罐中完成發(fā)酵，發(fā)酵罐攪拌速度為30~60rpm，發(fā)酵條件為：溫度25~35℃，發(fā)酵時長48~60小時，溶氧值do?3.0~4.0mg/l，ph為6~8。

24、優(yōu)選的，步驟（1）和步驟（2）中，活化培養(yǎng)過程中，將嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜熱棲熱菌和熱噬淀粉芽胞桿菌分別接種至第一培養(yǎng)基中，于搖床轉(zhuǎn)速150~160rpm，30~40℃下培養(yǎng)24~36h；將解淀粉芽孢桿菌、溶蛋白芽孢桿菌、鮑側(cè)支鐵還原單胞菌和解脂復(fù)膜孢酵母分別接種至第二培養(yǎng)基中，于搖床轉(zhuǎn)速150~160rpm，25~28℃培養(yǎng)36~48h，得到單一菌種的一級種子培養(yǎng)液；

25、第一培養(yǎng)基以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計組成如下：0.4~0.6%大豆蛋白胨，0.4~0.6%酵母浸粉，0.8~1.2%葡萄糖，1.8~2.2%瓊脂，0.2~0.4%牛肉膏，0.6~1.0%磷酸二氫鉀，0.6~1.0%磷酸氫二鉀以及0.06~0.1%硫酸錳，余量為水；第一培養(yǎng)基中的相對濕度為56-60%；第二培養(yǎng)基為pda液體培養(yǎng)基。

26、優(yōu)選的，步驟（4）中，按照摩爾比na2o：al2o3：sio2：h2o=(0.5~0.9)：(0.1~0.4)：1：(40~80)混合得到分子篩前驅(qū)體溶液。

27、優(yōu)選的，步驟（4）中，sio2和tio2的質(zhì)量比為（15~20）：1。

28、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為：

29、1、本發(fā)明中的液體混合菌中包含了多種微生物，這些微生物在不同的代謝途徑中發(fā)揮作用，可以針對塑料的不同組分進行分解，從而提高整體的降解效率。

30、2、本發(fā)明還使用了適宜的固體吸附載體，不僅有助于保持微生物的數(shù)量和活性，還能提供額外的催化功能，進一步提高了制劑的降解效率。

31、3、本發(fā)明中制劑添加的微生物種類多樣，能夠在不同的溫度條件下發(fā)揮降解作用，這使得該制劑能夠在自然環(huán)境中適應(yīng)變化的條件。同時，固體載體的存在也為微生物提供了一個相對穩(wěn)定的微環(huán)境，即使外部條件有所改變，也能維持一定的降解效率。

32、4、本發(fā)明利用固體吸附載體不僅能夠保護微生物免受外界不利因素的影響，還能幫助微生物附著在塑料表面，增加接觸面積，進而提高降解效率。