本發(fā)明涉及單細胞懸液制備，尤其是涉及一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑及其應用。

背景技術：

1、隨著當今科技的發(fā)展，多種細胞生物學實驗技術手段不斷涌現(xiàn)，諸如細胞培養(yǎng)、流式細胞分析和單細胞測序技術等，大大增加了科研工作者從組織中制備出單細胞懸液的需求。其中單細胞測序技術能夠在一定程度上詳細解析復雜樣本中不同類型細胞之間的特定差異，解析不同細胞在特定生理、病理狀態(tài)下的功能，鑒別不同細胞在發(fā)育或疾病進展中的作用，從而揭示深刻的分子機理機制。鑒于單細胞測序技術帶來的詳盡數(shù)據(jù)的強大功能，該技術自問世以來，革新了眾多領域的研究范式與基本方法，對生命科學研究產(chǎn)生了顛覆式的影響。從組織中制備出高質量的單細胞懸液是進行細胞分析的先決條件，也是進行單細胞測序等下游實驗成敗的關鍵環(huán)節(jié)。

2、單細胞懸液的細胞產(chǎn)量、細胞活率、細胞成團情況以及細胞碎片等問題均會對后續(xù)的細胞分析實驗有著決定性的影響。因此，去除從動物組織解離成單細胞懸液過程中產(chǎn)生的細胞團塊及碎片，對于制備出高質量單細胞懸液至關重要。目前，在制備單細胞懸液過程中多數(shù)采用低速離心的方法去除細胞碎片，然而這種方法一方面并不能將細胞碎片去除的很徹底，同時這種方法并不適用于多種類型組織。因此，本發(fā)明提供一種可用于多種動物組織解離的去碎片試劑及其使用方法，將正?；罴毎c細胞碎片分離開來，從而獲得純化的單細胞懸液，提高后續(xù)諸如單細胞測序等實驗的成功率。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑及其應用，可以顯著去除動物組織解離成單細胞懸液過程中產(chǎn)生的細胞團塊及碎片，從而得到高活力細胞且最小碎片的單細胞懸液，為后續(xù)單細胞測序奠定基礎。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑，包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%?w/v?edta、0.5～2.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和5.0～8.5?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

3、進一步地，包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%?w/v?edta、1.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和7.0?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

4、本發(fā)明還提供了上述試劑在動物組織解離成單細胞懸液過程中，去除細胞團塊及碎片的應用。

5、本發(fā)明還提供了一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的方法，包括以下步驟：

6、s1、將需要去除碎片的單細胞懸液收集到離心管中，300～500×g，4℃離心3～5min，然后緩慢倒掉上清，獲得細胞沉淀；

7、s2、向離心管中加入適量的1×pbs溶液，用巴氏吸管輕輕吸吹重懸細胞沉淀，使細胞濃度為1×106～1×107個/ml；

8、s3、采用含鈣鎂離子的1×pbs緩沖液將上述試劑按20%～30%的體積比例稀釋，然后取稀釋好的試劑于新的離心管中；

9、s4、用巴氏吸管將調整好細胞濃度的單細胞懸液沿管壁緩慢滴加到試劑上部，同時保證細胞懸液與試劑互不干擾，形成清晰的兩相后梯度離心；

10、s5、去掉上層碎片，加適量含10%?fbs的1×pbs溶液重懸離心管底部沉淀，得到純化后的單細胞懸液。

11、進一步地，步驟s3中試劑按25%的體積比例進行稀釋。

12、進一步地，步驟s4中細胞懸液占試劑與細胞懸液總體積的30-50%。

13、進一步地，步驟s4中細胞懸液占試劑與細胞懸液總體積的50%。

14、進一步地，步驟s4中梯度離心條件設置為800×g轉速，4?℃條件下離心20?min，升速降速設為1。

15、本發(fā)明所述的一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑及其應用的優(yōu)點和積極效果是：

16、本發(fā)明公開的去碎片方法，采用密度介于活細胞與細胞碎片之間的去碎片試劑作為密度梯度液，將細胞混合液和密度梯度液一起離心，即可將活細胞和碎片分離開來。部分死細胞在離心過程中會因細胞膜通透性增大而導致細胞膜破裂，最終成為細胞碎片而被去除，從而提高了細胞活率。去碎片試劑中含有的edta、adh-1三氟乙酸鹽和胰蛋白酶抑制劑能夠與細胞表面蛋白諸如鈣-粘蛋白等結合，阻斷細胞間粘附，有效降低細胞結團情況。相較傳統(tǒng)離心方法，采用本發(fā)明去碎片方法不僅去除碎片更為徹底，降低了細胞結團率的同時，更加適用于多種動物組織類型，獲得的高活率、低細胞結團率和最小碎片的高質量單細胞懸液，保證了下游細胞測序實驗的成功率。

17、下面通過附圖和實施例，對本發(fā)明的技術方案做進一步的詳細描述。

技術特征：

1.一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑，其特征在于：包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%?w/v?edta、0.5～2.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和5.0～8.5?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

2.根據(jù)權利要求1所述的試劑，其特征在于：包括percoll原液、0.85%?w/v?nacl、0.5%w/v?edta、1.5?mg/ml?adh-1三氟乙酸鹽和7.0?mg/ml胰蛋白酶抑制劑。

3.如權利要求1或2所述的試劑在動物組織解離成單細胞懸液過程中，去除細胞團塊及碎片的應用。

4.一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟s3中試劑按25%的體積比例進行稀釋。

6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于：步驟s4中細胞懸液占試劑與細胞懸液總體積的30-50%。

7.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟s4中細胞懸液占試劑與細胞懸液總體積的50%。

8.根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于：步驟s4中梯度離心條件設置為800×g轉速，4?℃條件下離心20?min，升速降速設為1。

技術總結
本發(fā)明公開了一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑及其應用，涉及單細胞懸液制備技術領域。一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑，包括Percoll原液、0.85%w/v?NaCl、0.5%w/v?EDTA、0.5～2.5?mg/mL?ADH?1三氟乙酸鹽和5.0～8.5?mg/mL胰蛋白酶抑制劑。本發(fā)明采用上述的一種去除單細胞懸液中細胞團塊和碎片的試劑及其應用，可以顯著去除動物組織解離成單細胞懸液過程中產(chǎn)生的細胞團塊及碎片，從而得到高活力細胞且最小碎片的單細胞懸液，為后續(xù)單細胞測序奠定基礎。

技術研發(fā)人員：林傳勇,龐美霞,梁柳
受保護的技術使用者：廣州元信生物科技有限公司
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19