本發(fā)明犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的核酸組合物、試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、犬冠狀病毒（ caninecoronavirus，ccv）為單股正鏈rna病毒，有6~7種多肽，其中4種是糖肽，不含rna聚合酶及神經(jīng)氨酸酶。犬冠狀病毒是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)犬業(yè)、經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)的病毒性傳染病病源?？墒谷l(fā)生程度不同的胃腸炎癥狀，特征有頻繁嘔吐、腹瀉、沉郁、厭食等癥狀。本病一年四季均可發(fā)生，以冬季多發(fā)，病犬是主要的傳染源，犬可通過呼吸道、消化道、糞便及污染物傳染。該病一旦發(fā)生，同窩犬同室犬很難控制均可造成感染。該病經(jīng)常和犬細(xì)小病毒，輪狀病毒及其他胃腸道疾病混合感染，幼犬死亡率較高。犬細(xì)小病毒（ canineparvovirus，cpv）屬細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。cpv主要感染犬，尤其幼犬，傳染性極強(qiáng)，死亡率也較高。

2、常見的ccv和cpv檢測方法主要有臨床癥狀觀察、血清學(xué)檢測、免疫血清學(xué)試驗(yàn)、病毒分離、膠體金試紙板檢測、免疫熒光試紙檢測、普通pcr擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測、實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測等。病毒分離培養(yǎng)是鑒定ccv和cpv的金標(biāo)準(zhǔn)，特異性較強(qiáng)，但操作復(fù)雜并費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要實(shí)驗(yàn)操作熟練的技術(shù)人員在專業(yè)的細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備中培養(yǎng)增殖，并且病毒分離和血凝試驗(yàn)在病毒感染前期容易造成假陰性結(jié)果，靈敏度不高。應(yīng)用電子顯微鏡可以對病毒這類超微小的病原體進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，這是直接對病原體進(jìn)行判定的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是受制于設(shè)備昂貴、養(yǎng)護(hù)復(fù)雜，還要求觀測人員有熟練判別的經(jīng)驗(yàn)，不能實(shí)時(shí)檢測并且難以應(yīng)用于現(xiàn)場診斷，故存在一定局限性。膠體金試紙板檢測是通過膠體金免疫層析法，樣本抗原與膠體金標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成金標(biāo)抗原抗體復(fù)合物并檢測出結(jié)果，此方法操作簡單迅速，但當(dāng)病毒含量較低時(shí)容易出現(xiàn)假陰性，導(dǎo)致醫(yī)生漏診。免疫熒光實(shí)驗(yàn)是將帶有標(biāo)記熒光分子的抗體或抗原與對應(yīng)的抗原或抗體特異性結(jié)合后，利用熒光顯微鏡觀測特異性熒光進(jìn)行病原檢測的方法，這種方法雖然靈敏度較高，但也存在非特異性結(jié)合，且切片不易長期保存，成本也較高，無法廣泛應(yīng)用于基層單位。實(shí)時(shí)熒光pcr檢測是通過將標(biāo)有熒光素的taq-man探針與樣本抗原dna和引物混合并擴(kuò)增，擴(kuò)增過程中通過特定光照射游離的熒光素產(chǎn)生熒光，進(jìn)而求得ct值。此方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確，可同時(shí)檢測多個(gè)樣本，但成本高，操作耗時(shí)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的核酸組合物、試劑盒及應(yīng)用，以至少一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。

2、本發(fā)明目的之一提供檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的核酸組合物。所述核酸組合物包括：如seq?id?no:1~4所述的dna分子。

3、本發(fā)明目的之一提供檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的比色傳感試劑盒。該試劑盒包括：生物素化如seq?id?no:1的dna分子，生物素化如seq?id?no:3的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:2的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:4的dna分子。

4、具體的，所述烷氨基化為丁氨基化。

5、具體的，該試劑盒還包括偶聯(lián)物。

6、具體的，所述偶聯(lián)物的制備方法包括：

7、（1）取5mg鐵基金屬有機(jī)骨架重懸于4.4mlpbs緩沖液（10mmol/l，ph7.4）中，超聲5min；

8、（2）然后加入250μledc（1.0mol/l）和250μlnhs（0.4mol/l）溶液，室溫孵育1h；

9、（3）然后加入100μl丁氨基適配體2（10μmol/l）和丁氨基適配體4（10μmol/l），37℃孵育12h；

10、（4）反應(yīng)結(jié)束后以10000r/min離心10min，去上清，沉淀用pbs（10mmol/l，ph7.4）洗滌3次，將制備的鐵基金屬有機(jī)骨架與丁氨基適配體2以及丁氨基適配體4的偶聯(lián)物分散于5mlph7.4的結(jié)合緩沖液中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

11、本發(fā)明的目的之一提供一種檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的方法。該方法包括：

12、（1）將生物素化如seq?id?no:1的dna分子或生物素化如seq?id?no:3的dna分子用結(jié)合緩沖液稀釋至100nmol/l，取200μl加入到酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，溫育20min；

13、（2）每孔用pbst緩沖液（10mmol/pbs，0.05%tween-20）洗滌3次，棄去孔內(nèi)溶液，加入200μl?bsa（10g/l）封閉溶液，4℃條件下封閉2h，棄去封閉液，以pbst洗滌3次；

14、（3）加入200μl待測樣品溶液，同時(shí)做空白對照和陽性對照孔，室溫孵育20min，棄去待測液，pbst洗滌；

15、（4）加入200μl偶聯(lián)物（0.8mg/ml）溶液，室溫孵育20min，棄去孔中反應(yīng)液，pbst洗滌。加入100μltmb-h2o2顯色液，室溫反應(yīng)20min后加入50μl硫酸（2mol/l）；

16、（5）采用酶標(biāo)儀測定652nm處的吸光度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測病毒的含量。

17、具體的，結(jié)合緩沖液為含1.6g/ml?nacl、0.04g/ml?kcl、0.04g/ml?kh2po4、0.02g/ml?cacl2、0.23g/ml?na2hpo4和0.02g/ml?mgcl2?的ph7.4溶液。

18、本發(fā)明的目的之一提供一種核酸組合物在檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒中的應(yīng)用。該核酸組合物包括：如seq?id?no:1~4所述的dna分子。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

20、本發(fā)明提供的檢測犬冠狀病毒的適配體，具有與ccv的e蛋白的高度親和性，能夠有效捕獲和檢測病毒體。

21、本發(fā)明提供的檢測犬細(xì)小病毒的適配體，具有與cpv的vp2蛋白的高度親和性，能夠有效捕獲和檢測病毒體。

22、本發(fā)明提供的檢測犬細(xì)小病毒的試劑盒，通過制備生物素化的適配體和烷氨基化適配體，并以生物素化適配體作為捕獲病毒的載體，以偶聯(lián)于鐵基金屬有機(jī)骨架的適配體作為檢測載體，能夠構(gòu)建比色傳感檢測試劑盒。該試劑盒能夠單獨(dú)或同時(shí)檢測ccv或cpv，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)。并且，該檢測試劑盒能有效避免其他類似病毒干擾，無交叉反應(yīng)性。

23、另外，本發(fā)明提供的試劑盒相對于商業(yè)elisa試劑盒具有更高的檢測敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，檢測過程具有無創(chuàng)、簡便、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，于犬病毒檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的核酸組合物，所述核酸組合物包括：如seq?id?no:1~4所示的dna分子。

2.檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的比色傳感試劑盒，包括：生物素化如seq?id?no:1所示的dna分子，生物素化如seq?id?no:3所示的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:2所示的dna分子，烷氨基化如seq?id?no:4所示的dna分子。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，所述烷氨基化為丁氨基化。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，還包括偶聯(lián)物。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，所述偶聯(lián)物的制備方法包括：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明犬細(xì)小病毒的檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測犬冠狀病毒和犬細(xì)小病毒的核酸組合物、試劑盒及應(yīng)用。該試劑盒通過制備生物素化的適配體和烷氨基化適配體，并以生物素化適配體作為捕獲病毒的載體，以偶聯(lián)于鐵基金屬有機(jī)骨架的適配體作為檢測載體，能夠構(gòu)建比色傳感檢測試劑盒。該比色傳感試劑盒能夠單獨(dú)或同時(shí)檢測CCV或CPV，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)。并且，該檢測試劑盒能有效避免其他類似病毒干擾，無交叉反應(yīng)性。

技術(shù)研發(fā)人員：黃挺,李杰,孫堯
受保護(hù)的技術(shù)使用者：上?；`生物科技有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19