技術(shù)特征：

1.高產(chǎn)率琥珀酸的重組大腸桿菌，其特征在于，在出發(fā)菌株的基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)谷氨酸棒桿菌來(lái)源的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ptsg，并過(guò)表達(dá)gadbc基因。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌還將gadbc的啟動(dòng)子替換為pj23119，并將gadbc的rbs序列替換為rbs34。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述gadbc基因整合在ilvg和/或rph位點(diǎn)上。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述過(guò)表達(dá)是分別在ilvg和rph位點(diǎn)整合gadbc。

5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述出發(fā)菌株包括但不限于大腸桿菌fmme-n-5。

6.一種發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，其特征在于，將權(quán)利要求1～5任一所述的重組大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行有氧-厭氧兩階段發(fā)酵。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，用于發(fā)酵的培養(yǎng)基含有：葡萄糖40-45g/l，玉米漿10-15g/l，(nh4)2so4?2-4g/l，k2hpo4?1～3g/l，kh2po4?0.5～0.9g/l，mgso4·7h2o0.5～0.9g/l。

8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述有氧-厭氧兩階段發(fā)酵是先在有氧環(huán)境下發(fā)酵直至發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡，且od600達(dá)到40～55時(shí)，轉(zhuǎn)為厭氧發(fā)酵。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在厭氧階段控制葡萄糖濃度不超過(guò)5g/l。

10.權(quán)利要求1～5任一所述的重組大腸桿菌或權(quán)利要求6～9任一所述方法在生產(chǎn)琥珀酸或含琥珀酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種高產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將大腸桿菌中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ptsG替換為來(lái)自谷氨酸棒狀桿菌的同源基因，并上調(diào)谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadBC的表達(dá)，以增強(qiáng)菌株的耐酸性能。并通過(guò)優(yōu)化RBS序列和啟動(dòng)子，實(shí)現(xiàn)了對(duì)ptsG、gadBC系統(tǒng)的精確調(diào)控。本發(fā)明構(gòu)建的重組大腸桿菌無(wú)需抗生素抗性基因，展現(xiàn)出良好的耐低pH環(huán)境和高效琥珀酸生產(chǎn)特性。采用兩階段發(fā)酵策略，36小時(shí)內(nèi)琥珀酸產(chǎn)量可達(dá)104.23g/L，全階段琥珀酸產(chǎn)率達(dá)到0.90g/g葡萄糖，生產(chǎn)強(qiáng)度為2.89g/L/h，具有顯著的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

技術(shù)研發(fā)人員：陳修來(lái),唐永圣,顧子蘊(yùn),陶雨萱,李瑩瑩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：江南大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19