本發(fā)明涉及一種高產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構建方法及其應用，屬于生物工程。

背景技術：

1、琥珀酸又稱丁二酸，是一種重要的c4平臺化合物。它在自然界中廣泛存在，是多種生物體代謝途徑中的中間產(chǎn)物。琥珀酸及其衍生物在化工、醫(yī)藥、食品和農(nóng)業(yè)等領域有著廣泛的應用，琥珀酸被美國能源部列為12種最有潛力大宗生物基化學品中的首位。

2、傳統(tǒng)的琥珀酸生產(chǎn)主要依賴化學合成方法，包括石蠟氧化、氯乙酸甲酯氰化水解以及五氧化二釩催化加氫等技術。然而，隨著石油資源的日益稀缺和環(huán)境污染問題的加劇，這些化學合成途徑的不足之處逐漸暴露。作為替代，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸不僅能夠減少對不可再生資源石油的依賴，還能利用可再生資源，有助于二氧化碳的固定，從而減緩溫室效應，顯示出巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3、目前，研究者們已經(jīng)探索了多種微生物菌株用于琥珀酸的生產(chǎn)，主要包括產(chǎn)琥珀酸放線桿菌、產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌和大腸桿菌。產(chǎn)琥珀酸放線桿菌能夠耐受較高濃度的琥珀酸鹽，其中guettler?m等人通過使用突變株fz53，實現(xiàn)了以葡萄糖為原料在48小時內(nèi)達到110g/l的高產(chǎn)率。盡管如此，關于該菌種的生理特性、發(fā)酵性能和遺傳背景的研究還相對有限，需要進一步深入。產(chǎn)琥珀酸厭氧螺菌則能夠利用多種發(fā)酵底物，如葡萄糖、乳糖和甘油。samuelov等人的研究表明，在最佳條件下，該菌株能夠?qū)崿F(xiàn)1.2mol琥珀酸/1.0mol葡萄糖的產(chǎn)率，最高產(chǎn)量達到65.0g/l。但是，由于該菌株的發(fā)酵過程需要嚴格的厭氧條件，這在工業(yè)應用中可能面臨挑戰(zhàn)。大腸桿菌作為研究透徹的模式菌株，遺傳背景清晰，易于遺傳操作，使其成為發(fā)酵琥珀酸生產(chǎn)的研究熱點。例如，李嬌嬌等人使用大腸桿菌yl104h，通過兩階段發(fā)酵65h，實現(xiàn)了61.66g/l的琥珀酸濃度和0.95g/l/h的生產(chǎn)強度。vemuri等人利用重組大腸桿菌afp111，通過76h的兩階段發(fā)酵，達到了99.2g/l的琥珀酸濃度，產(chǎn)率達到1.1g/g葡萄糖，生產(chǎn)強度為1.3g/l/h。張學禮等人通過基因工程和適應性進化策略構建的重組大腸桿菌hx024，采用一步厭氧法發(fā)酵96h，最終產(chǎn)量達到95.9g/l，產(chǎn)率為1g/g葡萄糖。朱麗雯等人通過優(yōu)化ppc和pck基因的表達，強化了co2固定路徑，使得重組大腸桿菌afp111菌株在96h發(fā)酵后，琥珀酸產(chǎn)量達到90.7g/l。張建國等人通過優(yōu)化葡萄糖吸收代謝路徑，并敲除副產(chǎn)物乙酸編碼基因，實現(xiàn)了65h發(fā)酵后98.92g/l的琥珀酸產(chǎn)量。唐文秀等人在敲除副產(chǎn)物基因的基礎上，通過質(zhì)粒過表達特定酶基因，發(fā)酵96h，琥珀酸產(chǎn)量達到了137g/l。

4、研究表明，利用微生物發(fā)酵技術生產(chǎn)琥珀酸具備顯著的應用潛力與優(yōu)勢，尤其是在增強產(chǎn)量、提升生產(chǎn)效率以及優(yōu)化生產(chǎn)工藝等方面。然而，目前采用大腸桿菌進行琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)存在若干技術瓶頸：發(fā)酵周期較長，長期厭氧條件下導致細胞死亡率上升，糖酸轉化率降低；此外，為了維持發(fā)酵過程中的ph穩(wěn)定，需要大量添加中和劑，這不僅增加了生產(chǎn)成本，也提高了產(chǎn)品分離純化的成本。因此，開發(fā)具有快速琥珀酸生產(chǎn)能力的菌株對于縮短發(fā)酵周期至關重要。

技術實現(xiàn)思路

1、為解決上述問題，本發(fā)明提供一種在較低ph下高產(chǎn)率琥珀酸的重組大腸桿菌構建方法及其應用，在宿主菌fmme-n-5中導入了來自谷氨酸棒桿菌葡萄糖轉運蛋白ptsg，并優(yōu)化了其啟動子和rbs，來加快葡萄糖利用速率，同時采用crispr-cas9基因編輯技術過表達谷氨酸依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc，同時優(yōu)化其啟動子、rbs和拷貝數(shù)，提高ptsg、gadbc的表達強度。

2、本發(fā)明提供了在較低ph條件下高產(chǎn)率琥珀酸的重組大腸桿菌，在出發(fā)菌株的基礎上過表達谷氨酸棒桿菌來源的葡萄糖轉運蛋白ptsg，加快葡萄糖利用速率，并過表達gadbc基因。

3、在一種實施方式中，所述重組大腸桿菌還將gadbc的啟動子替換為pj23119，并將gadbc的rbs序列替換為rbs34。

4、在一種實施方式中，所述過表達是表達一個或多個拷貝數(shù)的gadbc。

5、在一種實施方式中，所述過表達是在ilvg、rph、ylbe、ygay、adhe中的多個位點整合gadbc。

6、在一種實施方式中，所述過表達是分別在ilvg和rph位點整合gadbc。

7、在一種實施方式中，所述替換葡萄糖轉運蛋白是以整合耐酸基因后的重組大腸桿菌為宿主菌。

8、在一種實施方式中，基因ilvg的核苷酸序列如基因id：2847699所示；基因rph的核苷酸序列如基因id：948156所示；基因ylbe的核苷酸序列如基因id：938216所示；基因ygay的核苷酸序列如基因id：2847696所示；基因adhe的核苷酸序列如基因id：945837所示。

9、在一種實施方式中，基因ecptsg的核苷酸序列如seq?id?no.1所示，所述谷氨酸棒狀桿菌來源的葡萄糖轉運蛋白的編碼基因cgptsg的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。

10、在一種實施方式中，用啟動子pj23119和rbs34調(diào)控cgptsg基因的表達。

11、在一種實施方式中，所述啟動子pj23119的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；所述rbs34的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。

12、在一種實施方式中，所述gadbc基因的核苷酸序列如seq?id?no.5所示。

13、在一種實施方式中，所述大腸桿菌fmme-n-5公開于公開號為cn112239738a的專利申請文件中。

14、本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述高產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌的構建方法，包括以下步驟：

15、(1)制備大腸桿菌e.coli?fmme-n-5的感受態(tài)，將質(zhì)粒pcas-lac轉化到胞內(nèi)獲得含pcas-lac質(zhì)粒的受體菌；

16、(2)構建ptargetf-n20質(zhì)粒，根據(jù)所要替換的ptsg、gadbc的啟動子和rbs34，設計n20核苷酸序列，并進行全質(zhì)粒pcr；

17、(3)構建donordna，根據(jù)所要插入的pj23119和rbs34設計同源臂，最后進行一步同源重組整合在一起；

18、(4)通過電轉將ptargetf-n20質(zhì)粒和donordna導入至宿主菌株中；

19、(5)iptg誘導質(zhì)粒pcas-lac質(zhì)粒上sgrna的轉錄消除ptargetf-n20質(zhì)粒；

20、(6)重復步驟(1)～(5)，整合gadbc；

21、(7)不加任何抗生素37℃過夜培養(yǎng)，消除pcas-lac質(zhì)粒。

22、在一種實施方式中，葡萄糖轉運蛋白ptsg和谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc是通過crispr-cas9基因編輯技術進行操作，采用rbs序列和啟動子優(yōu)化表達谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc。

23、在一種實施方式中，在步驟(1)中制作含有pcas-lac質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)時，將質(zhì)粒pcas-lac轉化到胞內(nèi)獲得含pcas-lac質(zhì)粒的受體菌。

24、在一種實施方式中，在步驟(2)中構建ptargetf-n20質(zhì)粒時，根據(jù)所要替換的基因ptsg，pj23119-rbs34-gadbc，在網(wǎng)站(https://www.benchling.com/)上找到合適的n20核苷酸序列，并進行全質(zhì)粒pcr。

25、在一種實施方式中，在步驟(3)構建donordna時，根據(jù)所要插入的基因ptsg，pj23119-rbs34-gadbc，設計同源臂，最后進行一步同源重組整合在一起。

26、在一種實施方式中，在步驟(3)中，將根據(jù)所要替換的基因ptsg構建的ptargetf-n20質(zhì)粒及donordna采用電轉化法轉化至含有pcas-lac質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)中；步驟(3)中包括將根據(jù)pj23119-rbs34-gadbc構建的ptargetf-n20質(zhì)粒及donordna采用電轉化法轉化至含有pcas-lac質(zhì)粒的大腸桿菌感受態(tài)中的步驟。

27、在一種實施方式中，在步驟(5)中，采用iptg誘導。

28、在一種實施方式中，在步驟(5)-(6)中，通過壯觀霉素及卡那霉素抗性平板篩選獲得工程菌。

29、在一種實施方式中，步驟(3)-(6)的方法可實現(xiàn)循環(huán)的基因組編輯。

30、在一種實施方式中，在步驟(7)中不加任何抗生素37℃過夜培養(yǎng)步驟(6)構建的菌株，以消除pcas-lac質(zhì)粒。

31、本發(fā)明還提供一種發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酸的方法，所述方法采用所述的重組大腸桿菌在發(fā)酵培養(yǎng)基中進行有氧-厭氧兩階段發(fā)酵，可選地，收集發(fā)酵液中的琥珀酸。

32、在一種實施方式中，用于發(fā)酵的培養(yǎng)基含有：葡萄糖40-45g/l，玉米漿10-15g/l，(nh4)2so4?2-4g/l，k2hpo4?1～3g/l，kh2po4?0.5～0.9g/l，mgso4·7h2o?0.5～0.9g/l。

33、在一種實施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵是先在有氧環(huán)境下發(fā)酵直至發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡，且od600達到40～55時，轉為厭氧發(fā)酵。

34、在一種實施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵是在ph升高(發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖耗盡)后0.25～1小時，od600達到40～55，將有氧階段轉為厭氧階段。

35、在一種實施方式中，將有氧階段轉為厭氧階段是通過通入co2氣體或者添加按終濃度計3～7g/l碳酸氫鹽的方式進行。

36、在一種實施方式中，在厭氧階段，控制葡萄糖濃度為0～5g/l。

37、在一種實施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵的接種量，按體積百分比計，為5-15％；發(fā)酵溫度為35-38℃。

38、在一種實施方式中，所述的有氧-厭氧兩階段發(fā)酵的發(fā)酵時間為26～48h。

39、在一種實施方式中，在厭氧階段，添加ph中和劑，所述ph中和劑為na2co3、k2co3、naoh、koh、caco3、mgco3一種或幾種混合。

40、本發(fā)明還提供了所述重組大腸桿菌或所述方法在生產(chǎn)琥珀酸或含琥珀酸的產(chǎn)品中的應用。

41、有益效果：

42、(1)本發(fā)明采用crispr-cas9基因編輯技術將大腸桿菌中編碼葡萄糖轉運蛋白基因ptsg替換為谷氨酸棒狀桿菌葡萄糖轉運蛋白基因ptsg，在不影響菌體生長速度的同時加快葡萄糖的消耗速率，提高琥珀酸的積累積累效率。

43、(2)本發(fā)明還采用rbs序列和啟動子策略優(yōu)化表達谷氨酸脫羧酶依賴性耐酸系統(tǒng)gadbc，有效提高了菌株耐酸與耐高滲的能力。

44、(3)本發(fā)明構建的高產(chǎn)琥珀酸的重組大腸桿菌在5l發(fā)酵罐上采用兩階段發(fā)酵策略，發(fā)酵36h，琥珀酸產(chǎn)量達到了104.23g/l，厭氧階段琥珀酸得率達到1.09g/g葡萄糖、生產(chǎn)強度為2.89g/l/h，副產(chǎn)物乳酸、甲酸不積累，乙酸4-5g/l，菌株不含質(zhì)粒，不存在質(zhì)粒丟失的風險，發(fā)酵時不加入抗生素，且菌株發(fā)酵時間縮短，中和劑用量減少，成本降低，具有應用于工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。