本發(fā)明涉及基因工程，涉及一種融合蛋白及其制備方法；尤其涉及一種抗豬流行性腹瀉病毒的融合蛋白及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、豬流行性腹瀉病毒(porcine?epidemic?diarrhea?virus，pedv)是一種單股正鏈rna病毒，屬于冠狀病毒科，α-冠狀病毒屬。其病毒粒子形態(tài)呈圓形或多邊形，直徑范圍為90～190nm，平均直徑130nm。pedv的病毒粒子由四個(gè)主要結(jié)構(gòu)組成，分別是外膜蛋白(m蛋白)、包膜蛋白(e蛋白)、核衣殼蛋白(n蛋白)和纖突蛋白(s蛋白)。

2、豬流行性腹瀉病毒可導(dǎo)致豬引起一種病毒性疾病豬流行性腹瀉(porcineepidemic?diarrhea，ped)，引起豬的腹瀉、嘔吐、食欲不振等癥狀。pedv可通過(guò)糞便、呼吸道分泌物等途徑傳播，病毒顆粒在環(huán)境中具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，容易在豬場(chǎng)等集約化養(yǎng)殖場(chǎng)所傳播。pedv對(duì)幼豬的影響尤其嚴(yán)重，感染后的幼豬易出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀，病死率較高。目前，針對(duì)pedv的疫苗已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)，但是pedv的變異性較大，疫苗的研發(fā)和應(yīng)用仍面臨一定的挑戰(zhàn)。目前市面上的疫苗以滅活疫苗和弱毒活疫苗為主，因?yàn)閭鹘y(tǒng)疫苗存在毒力返強(qiáng)、滅活不徹底等安全問(wèn)題，所以長(zhǎng)期使用傳統(tǒng)疫苗為pedv在田間不斷重組變異提供了有利條件，致使其保護(hù)力逐年降低。由于豬流行性腹瀉病毒的s蛋白表達(dá)量低，重組亞單位疫苗的研究和生產(chǎn)也面臨極大的阻礙和挑戰(zhàn)。如何開(kāi)發(fā)一種高效、安全、低成本的新型疫苗成為領(lǐng)域內(nèi)極受關(guān)注的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為了研究一種可有效預(yù)防豬流行性腹瀉病毒的亞單位疫苗，并使該疫苗具有較高的免疫原性和穩(wěn)定性，本發(fā)明提出了一種融合蛋白及其制備方法；具體是提供一種能穩(wěn)定高效表達(dá)豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)s蛋白的亞單位融合蛋白rsmut2-his及其在cho或293t細(xì)胞系統(tǒng)中構(gòu)建和表達(dá)方法，該蛋白形成三聚體的比例可以達(dá)95.2％。本發(fā)明針對(duì)豬流行性腹瀉病毒s片段進(jìn)行分析和突變，篩選了可顯著增加蛋白穩(wěn)定性、蛋白免疫原性和表達(dá)量顯著提高的突變體，其序列如seq?id?no.3所示。本發(fā)明獲得的可以分泌表達(dá)亞單位融合蛋白rsmut2-his的單克隆細(xì)胞株，其表達(dá)產(chǎn)量高達(dá)1.6g/l。在之前相關(guān)研究中，s蛋白全長(zhǎng)表達(dá)量?jī)H1g/l，我們通過(guò)優(yōu)化，將s蛋白表達(dá)量提高了60％，由1g/l提高至1.6g/l。篩選的突變型rsmut2蛋白中和效價(jià)是野生型rs蛋白的2.37倍。

2、本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：

3、<第一方面>

4、本發(fā)明提供以下重組融合蛋白，含有豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)的野生型s單體蛋白，其氨基酸序列如seq?id?no.1所示；

5、或，含有豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)的突變型smut1單體蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.2所示；

6、或，含有豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)的突變型smut2單體蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.3所示；

7、或，含有豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)的突變型smut3單體蛋白，其氨基酸序列如seq?idno.4所示；

8、作為一個(gè)實(shí)施方案，smut1或smut2或smut3的c端連接6×his標(biāo)簽。

9、作為一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明提供以下重組(亞單位)融合蛋白：rs-his、rsmut1-his、rsmut2-his、rsmut3-his，優(yōu)選rsmut2-his。

10、作為一個(gè)實(shí)施方案，所述重組融合蛋白rs-his為氨基酸序列如seq?id?no.5所示的蛋白。

11、作為一個(gè)實(shí)施方案，所述重組融合蛋白rsmut1-his為氨基酸序列如seq?id?no.6所示的蛋白。

12、作為一個(gè)實(shí)施方案，所述重組融合蛋白rsmut2-his為氨基酸序列如seq?id?no.7所示的蛋白。

13、作為一個(gè)實(shí)施方案，所述重組融合蛋白rsmut3-his為氨基酸序列如seq?id?no.8所示的蛋白。

14、作為一個(gè)實(shí)施方案，所述重組融合蛋白的表達(dá)系統(tǒng)包括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞。

15、作為一個(gè)實(shí)施方案，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞包括cho細(xì)胞、293t細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為cho細(xì)胞。

16、<第二方面>

17、本發(fā)明提供了一種重組融合蛋白的制備方法，包括如下步驟：

18、s1、將所述重組融合蛋白編碼的基因克隆到真核表達(dá)載體中得到含有重組融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；

19、如將rs-his融合蛋白編碼的基因克隆到真核表達(dá)載體中得到含有rs-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；

20、或?qū)smut1-his融合蛋白編碼的基因克隆到真核表達(dá)載體中得到含有rsmut1-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；

21、或?qū)smut2-his融合蛋白編碼的基因克隆到真核表達(dá)載體中得到含有rsmut2-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；

22、或?qū)smut3-his融合蛋白編碼的基因克隆到真核表達(dá)載體中得到含有rsmut3-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒；

23、s2、將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞株中；

24、如將含rs-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至cho細(xì)胞株中；

25、或?qū)⒑瑀smut1-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至cho細(xì)胞株中；

26、或?qū)⒑瑀smut2-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至cho細(xì)胞株中；

27、或?qū)⒑瑀smut3-his融合蛋白編碼基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至cho細(xì)胞株中；

28、s3、發(fā)酵培養(yǎng)、純化，篩選出重組融合蛋白表達(dá)細(xì)胞株；

29、具體包括：發(fā)酵培養(yǎng)步驟s2所述瞬時(shí)表達(dá)的cho細(xì)胞，純化后得到各重組融合蛋白；篩選出表達(dá)量高，免疫原性好的重組融合蛋白表達(dá)細(xì)胞株；

30、s4、通過(guò)培養(yǎng)、篩選、馴化步驟s3中篩選到的重組融合蛋白表達(dá)細(xì)胞株，得到高度表達(dá)的細(xì)胞株；

31、s5、發(fā)酵培養(yǎng)所述高度表達(dá)的細(xì)胞株，純化后得到所述重組融合蛋白。

32、作為一個(gè)實(shí)施方案，步驟s1中，rs-his融合蛋白編碼的基因序列如seq?id?no.9所示；rsmut1-his、rsmut2-his、rsmut3-his融合蛋白編碼的基因序列分別如seq?id?no.10、seq?id?no.11、seq?id?no.12所示。

33、作為一個(gè)實(shí)施方案，步驟s1中，所述真核表達(dá)載體為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體。優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體包括pee6.4、pee12.4、pgl4.13、pcdna3.1，更優(yōu)選地，所述真核表達(dá)載體為pcdna3.1。

34、作為一個(gè)實(shí)施方案，步驟s1中，所述細(xì)胞株為cho細(xì)胞株。用于表達(dá)重組(亞單位)融合蛋白rsmut2-his的細(xì)胞為cho細(xì)胞。優(yōu)選地，所述cho細(xì)胞株包括dg44、dxb11、cho-k1或cho-s細(xì)胞株。更優(yōu)選地，所述cho細(xì)胞株為cho-k1。

35、<第三方面>

36、本發(fā)明提供了一種cho細(xì)胞株，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏時(shí)間為2024年9月3日，保藏名稱為中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞slpcb07，保藏編號(hào)為cctcc?no:c2024299。

37、<第四方面>

38、本發(fā)明提供了上述重組融合蛋白或cho細(xì)胞株在制備預(yù)防病毒性疾病豬流行性腹瀉的疫苗中的應(yīng)用。

39、<第五方面>

40、本發(fā)明提供了上述重組融合蛋白或cho細(xì)胞株在制備預(yù)防和/或治療病毒性疾病豬流行性腹瀉的藥物中的應(yīng)用。

41、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

42、1)本發(fā)明構(gòu)建并篩選了懸浮穩(wěn)定高效分泌表達(dá)豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)s蛋白的重組亞單位融合蛋白rsmut2-his的cho細(xì)胞株，該細(xì)胞株表達(dá)重組亞單位融合蛋白rsmut2-his產(chǎn)量高達(dá)1.6g/l、易于純化，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的目的蛋白純度都能達(dá)到85％以上，只需一步親和層析就能使目的蛋白純度達(dá)到95％以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足亞單位疫苗和診斷試劑的需求，易于大規(guī)模生產(chǎn)。

43、2)本發(fā)明構(gòu)建了rsmut2-his融合蛋白突變體，且本突變體相對(duì)于野生型的融合蛋白，免疫原性顯著提高。

44、3)本發(fā)明構(gòu)建的rsmut2-his融合蛋白tm值顯著提高，其形成的三聚體蛋白比例高達(dá)95.2％。

45、4)另外，由于生產(chǎn)用的cho細(xì)胞株在培養(yǎng)時(shí)可控制性高、質(zhì)控容易、生產(chǎn)蛋白批次間穩(wěn)定，生物安全高，沒(méi)有病毒，不存在散毒的風(fēng)險(xiǎn)。