本發(fā)明屬于熒光探針檢測及納米載藥應(yīng)用，更加具體地說，涉及一種喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針在檢測hsa中的應(yīng)用，以及進一步用于對hsa構(gòu)成的納米顆粒進行熒光標記以實現(xiàn)對藥物分子分布和代謝進行示蹤的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、人血清白蛋白（hsa）是一種分子量為66.5kda的心形單鏈蛋白，臨床上常用于治療出血、休克、燒傷、紅細胞增多、低白蛋白血癥等癥狀。hsa可以作為生物標志物，在人類健康監(jiān)測中發(fā)揮重要作用。其在血液中的正常濃度約為35-55g/l，健康個體尿液中的濃度應(yīng)低于30mg/l。精確追蹤疾病相關(guān)蛋白的含量和活性對于臨床診斷、藥物毒性監(jiān)測和疾病治療至關(guān)重要。微量白蛋白尿是糖尿病、高血壓、心血管疾病和腎臟疾病的早期指標。血漿中hsa水平低，即低白蛋白血癥，可能意味著肝硬化、肝功能衰竭和慢性肝炎。因此，準確檢測體液中的hsa水平至關(guān)重要。

2、作為可溶性載體蛋白，hsa在血液中含量最為豐富，占血漿總蛋白含量的52%-60%。它在維持血液滲透壓、運輸各種物質(zhì)以及結(jié)合激素、維生素、脂肪酸、鈣離子和藥物分子方面起著至關(guān)重要的作用。hsa作為藥物載體具有優(yōu)異的生物利用度。由于其在體內(nèi)分布廣泛、無毒、無抗原性、可生物降解，它不會在患者中引起排斥反應(yīng)。同時，藥物與hsa的結(jié)合可以減少藥物負荷和毒性，最大限度地提高治療效果。hsa可以與水溶性較差的藥物結(jié)合，促進藥物在體內(nèi)的均勻分布，延緩藥物代謝，延長藥物療效的循環(huán)時間。鉑類藥物在癌癥治療中得到了廣泛而有效的應(yīng)用，基于hsa的鉑類藥物遞送系統(tǒng)在臨床試驗中顯示出了良好的應(yīng)用前景。研究載鉑藥物的hsa納米顆粒在生物體內(nèi)的代謝和分布對于藥物開發(fā)、臨床應(yīng)用和提高患者治療效果具有重要意義。通過將熒光探針分子與hsa結(jié)合，可以對hsa納米載體在生物系統(tǒng)中進行熒光追蹤。隨后，隨著hsa的分解，熒光分子將失去其熒光特性。因此，可以實現(xiàn)檢測體內(nèi)藥物輸送和代謝的目的。

3、傳統(tǒng)的hsa檢測和分析方法包括染料結(jié)合法、熒光免疫測定法、lc-ms、電泳法等。這些方法通常需要高昂的材料和儀器成本，涉及復(fù)雜的樣品制備，特異性和抗干擾能力較差。小分子熒光探針已被證明是一種有前景的選擇，它們具有易于制備、檢測快速方便、非侵入性和在生物分子檢測中的非破壞性等優(yōu)點。到目前為止，已經(jīng)開發(fā)了各種hsa探針，用于選擇性和靈敏地檢測生物樣本中可能存在的hsa，但仍存在一些局限性。例如，某些hsa探針顯示出較差的水溶性，這阻礙了它們在生物環(huán)境中的應(yīng)用。此外，一些探針與蛋白質(zhì)的氨基或巰基共價結(jié)合，導(dǎo)致hsa變性。大多數(shù)hsa熒光探針結(jié)合到兩個經(jīng)典的hsa藥物結(jié)合位點，位點i和位點ii，因此體內(nèi)常用的藥物分子會對熒光檢測造成嚴重干擾。開發(fā)用于定性和定量檢測hsa的新型小分子探針具有巨大的實用價值和研究意義。近年來，分子自組裝hsa探針已成為構(gòu)建軟功能材料的有力工具，在材料科學(xué)和生物學(xué)中具有廣泛的應(yīng)用。小分子有機染料可以在沒有納米載體的情況下直接組裝成納米粒子，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性和生物相容性，并且在分子設(shè)計方面提供了廣泛的靈活性。喹啉作為熒光團具有高熒光量子產(chǎn)率、大斯托克斯位移、高光穩(wěn)定性、良好的生物相容性和可調(diào)熒光特性等優(yōu)勢；酰胺基可以增加與hsa的結(jié)合親和力；對其進行組裝設(shè)計，使酰肼席夫堿化合物的不同官能團表現(xiàn)出不同的親水性和親脂性；都有利于合成出的熒光探針作為hsa化學(xué)傳感器的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，可以作為高靈敏度、高選擇性的hsa熒光分析手段，和現(xiàn)有文獻中的探針（化合物）相比較，本發(fā)明的自組裝納米熒光探針具有優(yōu)異的選擇性、良好的抗干擾能力、快速響應(yīng)、高靈敏度、生物相容性好、穩(wěn)定性強、制備簡單、合成成本低等優(yōu)勢。喹啉酰肼席夫堿與hsa構(gòu)筑的納米顆粒，可以作為可視化的載體運載鉑類藥物。其優(yōu)勢為在光激發(fā)下可發(fā)射熒光，從而對納米顆粒起到示蹤作用。納米顆粒解離后熒光消失，可監(jiān)控鉑類藥物在生物體系內(nèi)的釋放。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

3、一種喹啉酰肼席夫堿熒光探針，其特征在于，具有如下所示結(jié)構(gòu)式：

4、

5、本發(fā)明進一步公開了所述喹啉酰肼席夫堿熒光探針的制備方法，其特征在于按如下的步驟進行：

6、（1）將喹啉-2-甲酸溶解于無水乙醇中，然后加入適量濃硫酸加熱回流5-7?h，待反應(yīng)體系冷卻后，用飽和nahco3溶液調(diào)節(jié)ph值至6-9，用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷層旋蒸除去溶劑，得固體喹啉-2-甲酸乙酯；

7、（2）將喹啉-2-甲酸乙酯溶解于甲醇，隨后在攪拌中逐滴加入水合肼，加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)1?h，tlc監(jiān)測反應(yīng)至喹啉-2-甲酸乙酯反應(yīng)完全停止反應(yīng)；待反應(yīng)液冷卻至室溫后，真空減壓濃縮，加入甲醇、乙醇循環(huán)交替旋蒸至反應(yīng)體系中水合肼被蒸發(fā)除去，得到喹啉-2-甲酰肼，其中喹啉-2-甲酸乙酯和水合肼的物質(zhì)的量之比為1:15-30；

8、（3）將喹啉-2-甲酰肼溶解于無水甲醇中，另將2，4-二羥基苯甲醛溶解于無水甲醇，在攪拌下緩緩滴加至喹啉-2-甲酰肼的甲醇溶液，加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)9.5?h，將反應(yīng)液冷卻至室溫后，抽濾并洗滌沉淀，真空干燥得反應(yīng)產(chǎn)物即該喹啉酰肼席夫堿熒光探針；其中喹啉-2-甲酰肼和2，4-二羥基苯甲醛的投料物質(zhì)的量比為1:1。

9、本發(fā)明更進一步公開了所述喹啉酰肼席夫堿熒光探針在用于hsa定性和定量檢測中的應(yīng)用，其特征在于喹啉酰肼席夫堿熒光探針在pbs緩沖液中形成自組裝納米熒光探針；pbs緩沖液的ph?=?7-8。將hsa加入到所述探針溶液中，在365?nm?紫外燈下，溶液由無色變?yōu)榍嗌?，實現(xiàn)對hsa的快速檢測。另外在370-420?nm激發(fā)光下，本身幾乎沒有熒光信號，與hsa作用后，在495?nm處產(chǎn)生很強的青色熒光信號，且對hsa的定量檢測濃度范圍為0-8?mm，檢測限為8.49?nm。實驗結(jié)果顯示：喹啉酰肼席夫堿熒光探針對于hsa具有良好的檢測能力，靈敏性高，熒光強度與濃度具有良好的線性關(guān)系，可準確的定量測量hsa濃度。

10、本發(fā)明也公開了喹啉酰肼席夫堿熒光探針在用于檢測活細胞和生物樣品中hsa方面的應(yīng)用。主要是喹啉酰肼席夫堿熒光探針與hsa形成納米顆粒，用于檢測氯代血紅素。實驗結(jié)果顯示：熒光探針與hsa形成的納米顆粒可定量檢測氯代血紅素，檢測限低，靈敏性好。

11、本發(fā)明還公開了喹啉酰肼席夫堿熒光探針與hsa形成熒光示蹤的納米顆粒，在用于運載鉑類藥物中的應(yīng)用。其合成方法按如下反應(yīng)制備：

12、將1?mm，hsa水溶液加入pbs緩沖液中，在高速攪拌下用移液管槍將1?mm探針分子的dmf溶液緩慢加入hsa溶液中，將上述溶液裝入已煮沸并活化過濾的透析袋中，用pbs緩沖液透析2小時，以從系統(tǒng)中去除單分子和小顆粒；然后用移液器從透析袋中提取樣品，并用少量pbs緩沖液沖洗袋內(nèi)，確保樣品的完全轉(zhuǎn)移，所得溶液密封在冰箱中4°c保持。實驗結(jié)果顯示：熒光探針與hsa形成的納米顆粒具有良好的熒光性能，可穩(wěn)定的運載鉑類藥物，納米顆粒解離后熒光消失，可實現(xiàn)對藥物載體的監(jiān)控。

13、本發(fā)明更加詳細的內(nèi)容如下

14、本發(fā)明作為hsa檢測和鉑類藥物的熒光示蹤載體的應(yīng)用通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

15、用于hsa檢測的喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，具有如下所示的結(jié)構(gòu)式：

16、

17、所述喹啉酰肼席夫堿形成的自組裝納米熒光探針用于對hsa的定性和定量檢測方面的應(yīng)用。

18、所述喹啉酰肼席夫堿形成的自組裝納米熒光探針的合成具體如下：

19、（1）將喹啉-2-甲酸溶解于無水乙醇中，然后加入適量濃硫酸加熱回流5-7?h，待反應(yīng)體系冷卻后，用飽和nahco3溶液調(diào)節(jié)ph值至6-9，用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷層旋蒸除去溶劑，得到喹啉-2-甲酸乙酯。

20、（2）將喹啉-2-甲酸乙酯溶解于甲醇，隨后在攪拌中逐滴加入水合肼（n2h4·h2o），加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)1?h。tlc監(jiān)測反應(yīng)至喹啉-2-甲酸乙酯反應(yīng)完全（石油醚：乙酸乙酯=?5：1），停止反應(yīng)。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，真空減壓濃縮，加入甲醇、乙醇循環(huán)交替旋蒸至反應(yīng)體系中水合肼被蒸發(fā)除去，得到喹啉-2-甲酰肼。

21、所述（2）中喹啉-2-甲酸乙酯和水合肼投料的物質(zhì)的量之比為1:(15-30)。

22、（3）將喹啉-2-甲酰肼溶解于無水甲醇中，另將2，4-二羥基苯甲醛溶解于甲醇，在攪拌下緩緩滴加至喹啉-2-甲酰肼的甲醇溶液，加熱攪拌，冷凝回流反應(yīng)9.5?h。將反應(yīng)液冷卻至室溫后，抽濾并洗滌沉淀，真空干燥得反應(yīng)產(chǎn)物即該喹啉酰肼席夫堿熒光探針。

23、所述（3）中喹啉-2-甲酰肼和2，4-二羥基苯甲醛的投料物質(zhì)的量比為1:1。

24、所述的合成路線如下：

25、

26、所述喹啉酰肼席夫堿在pbs緩沖液中形成自組裝納米熒光探針。

27、所述pbs緩沖液的ph?=?7-8。

28、所述喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，在激發(fā)波長范圍為370-420?nm激發(fā)下，探針本身幾乎沒有熒光信號，與hsa作用后，在495?nm處產(chǎn)生很強的熒光信號，且對hsa的定量檢測濃度范圍為0-8?mm，檢測限為8.49?nm。

29、所述喹啉酰肼席夫堿自組裝形成的納米熒光探針，激發(fā)波長范圍是370-420?nm，發(fā)射波長約為495?nm，與hsa的結(jié)合位點為fa1位點，有效的克服了水溶性差和常見藥物分子的干擾等缺點，對hsa有很好的選擇性，可以用于生物體系中hsa的檢測。