本發(fā)明屬于基因工程及發(fā)酵工程領域，具體涉及一種生產視黃醇棕櫚酸酯的解脂耶氏酵母重組菌及其構建方法與應用。

背景技術：

1、維生素a是二萜類化合物，也一種脂溶性維生素，被稱為“美容維生素”和“抗干眼病維生素”，廣泛應用于飼料、醫(yī)藥化妝品和食品等領域。維生素a生物活性形式是視黃醇、視黃醛和視黃酸，它們在生物體內可以相互轉化，在生理功能上，視黃醇和視黃醛能夠維持正常的視覺，促進視覺細胞內感光色素的形成，調試眼睛適應外界光線強弱的能力，降低夜盲癥和視力減退的發(fā)生，有助于對多種眼疾(如眼球干燥與結膜炎等)的治療；視黃醇還具有類固醇激素相似的作用，促進糖蛋白的合成、機體生長和發(fā)育，強壯骨骼，維護頭發(fā)、牙齒和牙床的健康；視黃酸能夠調控基因表達，減弱上皮細胞向鱗片狀的分化，增加上皮生長因子的數量，維持上皮的完整與健全；維生素a還有一定的抗氧化作用，可以清除一些有害的自由基。在人體中，維生素a以棕櫚酸酯、亞油酸脂或油酸酯的形式儲存于肝臟中。

2、維生素a可從動物組織中提取，但步驟繁瑣、提取率低、成本高。目前商業(yè)化的維生素a都是通過化學法合成的，合成方法分為roche法和basf法，都以檸檬醛為中間體。檸檬醛受制于巴斯夫、日本第一制藥等國際維生素中間體供應商?；瘜W合成法能耗成本較高，而且需要復雜的純化步驟并易產生有毒害的異構體以及一系列污染物。通過微生物將糖類等可再生的生物資源轉化成維生素a，溫和的反應條件和強選擇專一性使其能夠實現綠色清潔生產，可以擺脫對石油資源的依賴。

3、微生物發(fā)酵生產維生素a最大的瓶頸在于如何提高產量使其達到工業(yè)化水平，雖然目前有很多利用遺傳改造微生物工程菌合成維生素a的報道，但改造解脂耶氏酵母產維生素a卻鮮有報道，而且僅有報道的解脂耶氏酵母產維生素a只強化從乙酰輔酶a經甲羥戊酸到視黃醇這一代謝通路的基因表達，沒有考慮充分利用脂質在過氧化物酶體β氧化產生的巨量乙酰coa以及視黃醇不穩(wěn)定，導致無法突破產量以滿足工業(yè)生成的要求。

技術實現思路

1、本發(fā)明的第一個方面目的，在于針對現有技術中產視黃醇棕櫚酸酯的類胡蘿卜素合成途徑相關限速酶活性較低、乙酰coa供應不充足等缺陷，提供一種核酸分子。

2、本發(fā)明的第二個方面目的，在于提供一種表達系統(tǒng)，含有上述的核酸序列。

3、本發(fā)明的第三個方面目的，在于提供一種重組細胞，含有上述的表達系統(tǒng)。

4、本發(fā)明第四個方面的目的，在于提供上述核酸分子、表達系統(tǒng)、重組細胞的應用本發(fā)明的第五個方面目的，在于提供一種高產視黃醇棕櫚酸酯的方法。

5、本發(fā)明所采取的技術方案是：

6、本發(fā)明的第一方面，提供一種核酸分子，包含：

7、(i)視黃醇棕櫚酸酯合成途徑相關基因；和

8、(ii)甲羥戊酸途徑相關基因；和

9、(iii)強化解脂耶氏酵母外源類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因。

10、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述甲羥戊酸途徑相關基因包括催化乙酰輔酶a縮合成乙酰乙酰輔酶a的基因atob、催化乙酰乙酰輔酶a和乙酰輔酶a縮合成hmg-coa的基因hmgs，其中催化hmg-coa還原為甲羥戊酸的基因hmgr。

11、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述核酸分子還包括定位至過氧化物酶體的甲羥戊酸途徑。

12、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述定位至過氧化物酶體的甲羥戊酸途徑相關基因包括催化乙酰輔酶a縮合成乙酰乙酰輔酶a的基因atob、催化乙酰乙酰輔酶a和乙酰輔酶a縮合成hmg-coa的基因hmgs和催化hmg-coa還原為甲羥戊酸的基因hmgr；其中atob、hmgs和hmgr基因分別與編碼過氧化物酶體定位信號肽epts1(lgrgrrskl(seq?id?no.80))的基因序列的連接形成atobepts1、hmgsepts1和hmgrepts1基因；在此基礎上，atob、hmgs和hmgr基因編碼的蛋白羧基端都融合了過氧化物酶體定位信號肽epts1。甲羥戊酸途徑基因過表達并定位至過氧化物酶體，利用脂肪酸降解生成的乙酰輔酶a為前體能高效合成甲羥戊酸及下游化合物；epts1是一種增強型的過氧化物酶體定位信號，它能有效地將蛋白定位至過氧化物酶體。

13、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述atob來源于大腸桿菌。

14、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述atob來源于大腸桿菌bl21(de3)；但并不局限于此，只要來源于大腸桿菌菌株的atob均可以達到類似的效果。

15、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述hmgs和hmgr來源于解脂耶氏酵母；優(yōu)選為來源于解脂耶氏酵母w29。

16、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述atobepts1優(yōu)化序列如seq?id?no:1所示，hmgsepts1優(yōu)化序列如seq?id?no:2所示，hmgrepts1優(yōu)化序列如seq?id?no:3所示。

17、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述強化解脂耶氏酵母外源β-胡蘿卜素合成途徑關鍵基因包括：催化甲羥戊酸磷酸化為甲羥戊酸-5-磷酸的基因erg12、催化甲羥戊酸-5-磷酸生成甲羥戊酸-5-焦磷酸的基因erg8、催化甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧生成異戊二烯焦磷酸的基因erg19、催化異戊二烯焦磷酸異構為二甲基烯丙基焦磷酸的基因idi、催化異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸生成法尼基焦磷酸的基因erg20、催化法尼基焦磷酸結合一分子異戊二烯焦磷酸生成雙香葉基焦磷酸的基因ggs1、直接催化二甲烯丙基焦磷酸生成雙香葉基焦磷酸的多功能性酶基因gps、將外源的催化茄紅素脫氫生成番茄紅素的基因carb、催化兩分子雙香葉基焦磷酸生成茄紅素以及催化番茄紅素環(huán)化生成β-胡蘿卜素的雙功能基因carrp。

18、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述erg12、erg8、erg19、erg20和ggs1來源于解脂耶氏酵母。

19、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述erg12、erg8、erg19、erg20和ggs1來源于解脂耶氏酵母w29。

20、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述gps來源于古細菌硫細菌。

21、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述carb和carrp來源于卷枝毛霉。

22、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述carb基因的優(yōu)化序列如seq?id?no:4所示，所述carrp基因的優(yōu)化序列如seq?id?no:5所示。

23、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述視黃醇棕櫚酸酯合成途徑相關基因包括β-胡蘿卜素15，15’-單加氧酶基因blh、視黃醇結合蛋白的基因crbp以及催化視黃醇生成視黃醇棕櫚酸酯的基因lrat。

24、優(yōu)選地，所述blh來源于海洋細菌66a03。

25、優(yōu)選地，所述crbp和lrat來源于人類基因組。

26、本發(fā)明的第二方面，提供一種表達系統(tǒng)，包含本發(fā)明第一方面所述的核酸分子。

27、在本發(fā)明的一些實施方式中，將所述核酸分子的基因拆解為1個或多個組別，分別插入于不同的表達載體中。

28、優(yōu)選地，所述表達載體的骨架質粒包括puc、pbr322、pacyc、pet、psc101。

29、優(yōu)選地，所述puc包括puc18、puc19。

30、在本發(fā)明的一些實施方式中，為了確保個基因可以在表達系統(tǒng)或者重組細胞中高效表達，在每個基因的上游添加啟動子序列，下游增加終止子序列。

31、在本發(fā)明的一些實施方式中，所選用的啟動子序列包括但不限于：ptef、pexp、pfba和pgpd。

32、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述終止子序列包括但不限于：tlip、tidi、txpr2、tcyc1、mig1t。

33、本發(fā)明的第三方面，提供一種重組細胞，所述重組細胞包括本發(fā)明第一方面所述的核酸分子或本發(fā)明第二方面所述的表達系統(tǒng)。

34、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述核酸分子插入于所述細胞的基因組中。

35、更進一步地，所述核酸分子通過非同源性重組生物方式插入于所述細胞的基因組中。

36、本領域技術人員可以理解，通過非同源性重組生物方式插入于所述細胞的基因組中是為了得到更多可能穩(wěn)定遺傳的菌株，僅轉化上述表達系統(tǒng)同樣可以實現本發(fā)明的目的。

37、此外，非同源性重組相比定點嵌入的方式，有幾率獲得多次嵌入的更高效的重組細胞或重組菌。

38、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述細胞為酵母細胞。

39、在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述酵母細胞為解脂耶氏酵母。

40、在本發(fā)明的一些更優(yōu)選實施方式中，所述解脂耶氏酵母為解脂耶氏酵母ztq5320。

41、本發(fā)明的第四方面，提供本發(fā)明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表達載體和/或第三方面所述的重組細胞在食品、化工或制藥領域的應用。

42、本發(fā)明還提供本發(fā)明第一方面所述的核酸分子、第二方面所述的表達載體和/或第三方面所述的重組細胞在生產視黃醇棕櫚酸酯和/或制備生產視黃醇棕櫚酸酯的產品中的應用。

43、本發(fā)明的第四方面，提供一種生產視黃醇棕櫚酸酯的方法，通過培養(yǎng)上述的重組細胞，得到視黃醇棕櫚酸酯。

44、在本發(fā)明的一些實施方式中，所述包括在本發(fā)明的一些實施方式中，通過培養(yǎng)上述的重組細胞，破胞萃取到視黃醇棕櫚酸酯。

45、具體地，重組細胞的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

46、一級種子液的培養(yǎng)；

47、二級種子液的培養(yǎng)；

48、發(fā)酵罐培養(yǎng)。

49、更具體地，重組細胞的培養(yǎng)方法包括以下步驟：

50、一級種子液的培養(yǎng)：將重組菌單菌落接種到含有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28～32℃、搖床轉速180～200rpm，培養(yǎng)24～48小時，得到一級種子液。

51、二級種子液的培養(yǎng)：將一級種子液按1％-5％(v/v)接種量轉接到含有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28～32℃、搖床轉速180～200rpm，培養(yǎng)到od600達到10，得到二級種子液。

52、發(fā)酵罐培養(yǎng)：將二級種子液按8～12％(wt)接種量轉接至含有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進行發(fā)酵，發(fā)酵溫度28～32℃、攪拌速度300～800rpm、通氣量大于2l/min、ph6.5～7.0和溶氧22～28％以上的條件下培養(yǎng)，以55～65％葡萄糖儲液繼續(xù)補料發(fā)酵。

53、優(yōu)選地，所述種子培養(yǎng)基(液體培養(yǎng)基)的成分包括：8～12g/l酵母膏、15～25g/l蛋白胨和50～70g/l葡萄糖。

54、優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基的成分包括：25～35g/l酵母膏、50～70g/l蛋白胨和80～120g/l葡萄糖。

55、本發(fā)明的有益效果是：

56、本發(fā)明提供了一種核酸分子，包含視黃醇棕櫚酸酯的合成途徑，構建了甲羥戊酸途徑和同時強化解脂耶氏酵母外源類胡蘿卜素合成途徑關鍵基因表達，還引入了定位至過氧化物酶體的甲羥戊酸途徑；本發(fā)明還提供了包含上述核酸分子的表達載體、重組細胞，通過在解脂耶氏酵母中引入上述途徑，顯著提高了視黃醇棕櫚酸酯產量，產量可達5g/l。