本發(fā)明涉及生物酶工程，具體涉及一種合成l-草銨膦的雙酶共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、草銨膦(2-amino-4-hydroxymethylphosphinylbutanoic?acid，phosphinothricin)，化學(xué)名為2-氨基-4-?[羥基?(甲基)膦?；鵠丁酸銨，又名草丁膦，是一種高效廣譜、非傳導(dǎo)型的觸殺滅生性有機(jī)磷類除草劑。草銨膦的除草機(jī)理是通過抑制谷氨酰胺合成酶的活性進(jìn)而抑制光合作用，并進(jìn)一步引起植物體內(nèi)氨累積從而導(dǎo)致植物中毒死亡；同時(shí)，當(dāng)植物吸收草銨膦后，植物體內(nèi)以谷氨酸為前體的氨基酸合成受阻，阻斷了植物體內(nèi)氨基酸代謝。

2、目前市售的草銨膦，通常為l型和d型草銨膦的外消旋混合物，其中僅l-草銨膦具有除草活性，植物的莖葉能迅速吸收l-草銨膦，通過蒸騰作用在植物體內(nèi)進(jìn)行傳導(dǎo)，發(fā)揮其除草活性，而l-草銨膦進(jìn)入土壤后會被微生物降解而迅速失活；d-草銨膦對植物無毒性，但d-草銨膦的使用會增加農(nóng)民的生產(chǎn)成本和環(huán)境壓力，若使用l-草銨膦的純光學(xué)異構(gòu)體，能夠減少50%的草銨膦使用量，這對于推進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展、建設(shè)美麗中國具有重要意義。草銨膦是全球三大除草劑之一，且近年來草銨膦在全球農(nóng)藥市場的比重逐年增加，因此實(shí)現(xiàn)環(huán)境友好型的工業(yè)化生產(chǎn)l-草銨膦已成為當(dāng)今農(nóng)藥生產(chǎn)的目標(biāo)。

3、生成光學(xué)純l-草銨膦的方法有：化學(xué)合成法和生物催化法；化學(xué)合成法中的手性輔助試劑誘導(dǎo)法需要在-78℃低溫反應(yīng)，工藝條件苛刻、所需試劑昂貴，且產(chǎn)率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；天然氨基酸手性源法工藝中不僅需要用到價(jià)格昂貴的試劑，同時(shí)使用了劇毒試劑，易發(fā)生安全事故，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)；不對稱合成法中的?strecker?反應(yīng)和不對稱michael?加成法合成路線復(fù)雜、需要用到大量的催化劑，且副產(chǎn)物容易導(dǎo)致分離純化工藝復(fù)雜，大大增加了生產(chǎn)成本，且收率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；外消旋體拆分法易造成原料浪費(fèi)，增加了生產(chǎn)成本。同時(shí)化學(xué)合成過程中易產(chǎn)生大量“三廢”，工業(yè)三廢的處理成本不僅增加了生產(chǎn)成本，同時(shí)增加了環(huán)境壓力。

4、生物催化法具有反應(yīng)條件溫和、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為近年來l-草銨膦合成法的研究熱點(diǎn)；傳統(tǒng)的生物催化包括：（1）催化水解?l-草銨膦前體合成?l-草銨膦，此方法中l(wèi)-草銨膦前體價(jià)格昂貴且不易得；（2）酶拆分外消旋混合物?d/l-草銨膦前體合成l-草銨膦，但該方法的理論收率僅為50%，會造成原料浪費(fèi)。近年來發(fā)現(xiàn)了以草銨膦脫氫酶和ω-轉(zhuǎn)氨酶去消旋合成l-草銨膦的方法，具體為d-草銨膦經(jīng)d-氨基酸氧化酶或ω-轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化生成ppo，ppo再經(jīng)草銨膦脫氫酶突變體或谷氨酸脫氫酶催化合成l-草銨膦，同時(shí)結(jié)合醇脫氫酶進(jìn)行輔酶再生，但這兩種酶催化方法在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中存在酶利用效率低、l-草銨膦收率低等局限性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、鑒于此，本發(fā)明提供了一種合成l-草銨膦的雙酶共表達(dá)重組載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，該重組載體中同時(shí)攜帶谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段。含有該重組載體的菌株能夠高效發(fā)酵，培養(yǎng)一次的發(fā)酵液能夠同時(shí)得到表達(dá)量和活力相當(dāng)?shù)墓劝彼崦摎涿负蚽adp異丙醇脫氫酶，可用于以ppo為底物合成l-草銨膦的反應(yīng)及該反應(yīng)過程中nadph的循環(huán)再生，減少發(fā)酵次數(shù)。

2、本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

3、一種谷氨酸脫氫酶突變體，所述谷氨酸脫氫酶來源于坦氏不動桿菌（acinetobacter?tandoii）；所述谷氨酸脫氫酶突變體由ncbi基因序列庫中編號為wp_171284991.1的序列經(jīng)突變獲得，突變位點(diǎn)為i58a，a150g，g251q，v352a中的一個(gè)或多個(gè)。

4、優(yōu)選的，所述突變位點(diǎn)包含以下幾種：i58a，a150g，g251q，v352a，i58a/a150g，i58a/g251q，i58a/v352a，a150g/g251q，a150g/v352a，i58a/a150g/g251q，i58a/a150g/v352a，a150g/g251q/v352a，i58a/a150g/g251q/v352a。

5、優(yōu)選的，谷氨酸脫氫突變體由ncbi基因序列庫中編號為wp_171284991.1的氨基酸序列經(jīng)58位丙氨酸取代異亮氨酸、150位甘氨酸取丙氨酸、251位谷氨酰胺取代甘氨酸，352位丙氨酸取代纈氨酸得到，該谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列如seq?id?no.1所示，氨基酸序列seq?id?no.2。

6、一種共表達(dá)谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段，包括谷氨酸脫氫酶突變體基因序列和nadp異丙醇脫氫酶基因序列；

7、其中，谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列如seq?id?no.1所示；

8、nadp異丙醇脫氫酶來源于嗜麥芽窄食單胞菌（stenotrophomonas?maltophilia），由ncbi基因序列庫中編號wp_088028380.1的氨基酸序列經(jīng)密碼子優(yōu)化后得到，其堿基序列如seq?id?no.3所示，氨基酸序列如seq?id?no.4所示；

9、將seq?id?no.1所示的堿基序列和seq?id?no.3所示的堿基序列用1個(gè)rbs序列連接，得到共表達(dá)谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的基因片段，該基因片段的堿基序列如seq?id?no.5所示。

10、一種含有seq?id?no.5所示基因片段的重組載體，該重組載體的堿基序列如seqid?no.6所示。

11、上述重組載體，構(gòu)建方法為：

12、將seq?id?no.1所示的堿基序列酶切連接于載體pet-28a(+)的酶切位點(diǎn)bamhⅰ和xhoⅰ兩酶切位點(diǎn)之間；

13、將seq?id?no.3所示的堿基序列酶切連接于載體pet-28a(+)的酶切位點(diǎn)ndeⅰ和hindⅲ之間；

14、seq?id?no.1所示的堿基序列和seq?id?no.3所示的堿基序列的n端同時(shí)攜帶his標(biāo)簽，可用于蛋白純化。

15、一種含有上述基因片段的雙酶共表達(dá)菌株的應(yīng)用，過程為：

16、（1）將重組載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞得到合成l-草銨膦的雙酶共表達(dá)菌株；

17、（2）將雙酶共表達(dá)菌株的菌種按照1:100的接種比例接種于含100mg/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃、200rpm培養(yǎng)4~6h至od600=2.0，得到種子液；

18、（3）將種子液按照1:100的比例轉(zhuǎn)接至5l發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，培養(yǎng)至od600=25~30時(shí)，加入iptg至終濃度0.1mmol/l，25℃誘導(dǎo)表達(dá)16h后于4℃、10000rpm離心15min，棄上清后收獲濕菌體；

19、（4）將濕菌體破碎后離心，得到含有谷氨酸脫氫酶和nadp異丙醇脫氫酶的粗酶液，該粗酶液能夠直接用于ppo轉(zhuǎn)化生成l-草銨膦。

20、優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌 e.coli?bl21(de3)。

21、優(yōu)選的，在應(yīng)用過程中，粗酶液以ppo為底物催化生成l-草銨膦時(shí)，ppo底物濃度≤50g/l，催化溫度為35℃，催化反應(yīng)在3h內(nèi)完成。

22、一種載酶樹脂，為所述粗酶液經(jīng)蛋白純化后得到，該載酶樹脂能夠重復(fù)利用。

23、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

24、1、與現(xiàn)有的nadp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶單獨(dú)表達(dá)菌株相比，本發(fā)明提供了一種能夠?qū)adp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶共表達(dá)的菌株，實(shí)現(xiàn)了一次菌株發(fā)酵即可同時(shí)得到兩種蛋白表達(dá)量基本一致的nadp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶，在催化ppo生產(chǎn)l-草銨膦的過程中，無需再加入醇脫氫酶進(jìn)行輔酶nadph的循環(huán)再生，有效減少酶的使用量，在工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)中減少了工藝流程并降低了生產(chǎn)成本。

25、2、本發(fā)明提供了谷氨酸脫氫酶突變體的堿基序列和氨基酸序列，所表達(dá)的酶能夠高效催化ppo生成l-草銨膦，在100g/l的濃度下，催化時(shí)間3h底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)95%。

26、3、本發(fā)明對nadp異丙醇脫氫酶進(jìn)行密碼子優(yōu)化后，與谷氨酸脫氫酶突變體能夠同時(shí)進(jìn)行蛋白純化，純化后的載酶樹脂中nadp異丙醇脫氫酶和谷氨酸脫氫酶的載酶量基本一致，可重復(fù)利用，滿足高濃度ppo催化合成l-草銨膦，減少了酶的發(fā)酵次數(shù)，顯著降低了生產(chǎn)成本。