本發(fā)明屬于酶制劑檢測，具體涉及一種氨肽酶的酶活檢測方法。

背景技術(shù)：

1、氨肽酶是一類能從蛋白質(zhì)和多肽n端選擇性切除氨基酸殘基產(chǎn)生游離氨基酸的外切蛋白酶，廣泛存在于不同物種的生物體內(nèi)，包括哺乳動物、植物、微生物等。由于動植物體內(nèi)成分復(fù)雜、氨肽酶含量較低，導(dǎo)致提取成本較高。隨著酶制劑行業(yè)的快速發(fā)展，為滿足市場需求，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)酶成為當(dāng)今的主流趨勢和研究熱點，微生物產(chǎn)酶量更高，提取步驟簡單，生產(chǎn)成本更低，市場上的氨肽酶產(chǎn)品基本都是利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)。鑒于氨肽酶的作用特性，其使用范圍極為廣泛。但目前關(guān)于氨肽酶的檢測方法存在空白，尚且缺乏氨肽酶的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)機檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中也缺乏相關(guān)的檢測方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)中氨肽酶檢測方法缺乏的問題。

2、為此，本發(fā)明提供了一種氨肽酶的酶活檢測方法，包括以下步驟：

3、(1)繪制對硝基酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

4、(2)稱取質(zhì)量為m的待測氨肽酶，加入緩沖液提取，將提取液稀釋n倍得到待測氨肽酶溶液；

5、(3)取待測氨肽酶溶液預(yù)熱，向其中加入底物l-亮氨酸對硝基苯胺，反應(yīng)t分鐘后加入碳酸鈉溶液，測405nm處吸光度值a1；取待測氨肽酶溶液預(yù)熱，t分鐘后加入碳酸鈉溶液，再加入底物l-亮氨酸對硝基苯胺，測405nm處吸光度值a0；

6、(4)計算待測氨肽酶的酶活x，

7、

8、其中，a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距。

9、具體的，上述步驟(3)中控制a1-a0＝0.2～0.45。

10、具體的，上述步驟(3)中t分鐘后加入濃度2-10％的碳酸鈉溶液。

11、具體的，上述步驟(3)中反應(yīng)t分鐘具體為在40℃-80℃下保溫t分鐘。

12、具體的，上述步驟(3)中預(yù)熱條件為在50℃水浴中保溫2-5min。

13、具體的，上述步驟(3)中底物為2.5mmol/l的l-亮氨酸對硝基苯胺。

14、具體的，上述步驟(3)中待測氨肽酶溶液、l-亮氨酸對硝基苯胺、碳酸鈉溶液的體積比為9:1:20。

15、具體的，上述步驟(2)中緩沖液為0.05-0.1mol/ltris-hcl緩沖液。

16、具體的，上述步驟(2)中待測氨肽酶加入緩沖液后ph＝5.0～11.0。

17、具體的，上述步驟(2)中待測氨肽酶加入緩沖液后置于水浴搖床提取20-30min，靜置10-20min后，取上清液稀釋n倍得到待測氨肽酶溶液。

18、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點和有益效果：

19、本發(fā)明提供的這種氨肽酶的酶活檢測方法優(yōu)化了氨肽酶的檢測步驟，利用酶、底物之間的反應(yīng)，能夠簡單快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確地測定氨肽酶的酶活力，提高了氨肽酶活力檢測的安全性。

20、以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細說明。

技術(shù)特征：

1.一種氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中控制a1-a0＝0.2～0.45。

3.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中t分鐘后加入濃度2-10％的碳酸鈉溶液。

4.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中反應(yīng)t分鐘具體為在40℃-80℃下保溫t分鐘。

5.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中預(yù)熱條件為在50℃水浴中保溫2-5min。

6.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中底物為2.5mmol/l的l-亮氨酸對硝基苯胺。

7.如權(quán)利要求6所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(3)中待測氨肽酶溶液、l-亮氨酸對硝基苯胺、碳酸鈉溶液的體積比為9:1:20。

8.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中緩沖液為0.05-0.1mol/ltris-hcl緩沖液。

9.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中待測氨肽酶加入緩沖液后ph＝5.0～11.0。

10.如權(quán)利要求1所述氨肽酶的酶活檢測方法，其特征在于：所述步驟(2)中待測氨肽酶加入緩沖液后置于水浴搖床提取20-30min，靜置10-20min后，取上清液稀釋n倍得到待測氨肽酶溶液。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于酶制劑檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體提供了一種氨肽酶的酶活檢測方法，包括以下步驟：(1)繪制對硝基酚濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)稱取質(zhì)量為m的待測氨肽酶，加入緩沖液提取，將提取液稀釋n倍得到待測氨肽酶溶液；(3)取待測氨肽酶溶液預(yù)熱，向其中加入底物L(fēng)?亮氨酸對硝基苯胺，反應(yīng)t分鐘后加入碳酸鈉溶液，測405nm處吸光度值A(chǔ)<subgt;1</subgt;；取待測氨肽酶溶液預(yù)熱，t分鐘后加入碳酸鈉溶液，再加入底物L(fēng)?亮氨酸對硝基苯胺，測405nm處吸光度值A(chǔ)<subgt;0</subgt;；(4)計算待測氨肽酶的酶活X。

技術(shù)研發(fā)人員：陳雪姣,徐麗,鄧曉旭,程瑛,蘇丹,程超,熊粲,任少聰
受保護的技術(shù)使用者：武漢新華揚生物股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19