本發(fā)明涉及分子生物學(xué)，更具體的說(shuō)是涉及一株重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、d-阿洛酮糖作為一種重要的稀有糖類(lèi)，其甜度類(lèi)似蔗糖，但不經(jīng)過(guò)人體代謝，因而具有低卡路里的特性，所以廣受關(guān)注。目前主要采用化學(xué)合成法和生物合成法制備d-阿洛酮糖?；瘜W(xué)合成法主要是利用某些化學(xué)反應(yīng)合成d-阿洛酮糖。但無(wú)論是哪一種化學(xué)合成方法，都面臨生成副產(chǎn)物、分離困難、反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜導(dǎo)致污染過(guò)大等諸多缺陷。生物合成法，即以某些特定的酶或微生物細(xì)胞為催化劑，制造出以較廉價(jià)的單糖(如果糖、葡萄糖)作為原料的d-阿洛酮糖。在此過(guò)程中，d-阿洛酮糖-3差向異構(gòu)酶(dpe)顯得異常重要。該方法利用dpe純酶或產(chǎn)dpe工程菌通過(guò)全細(xì)胞催化完成從d-果糖到d-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化反應(yīng)。

2、已報(bào)道的dpe約30種，平衡轉(zhuǎn)化率基本處于24％～33％。dpe主要來(lái)源于植物和微生物。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，人們將能夠通過(guò)基因工程等手段對(duì)dpe進(jìn)行改良和優(yōu)化，提高其催化效率和穩(wěn)定性，從而更好地滿(mǎn)足不同領(lǐng)域的需求。目前，已經(jīng)從許多不同的菌株中鑒定分離出一些dpe，但是野生型菌株酶的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期，無(wú)法應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。因此，構(gòu)建表達(dá)載體并在異源生物中表達(dá)，對(duì)酶的特性研究及工業(yè)化應(yīng)用，具有十分重大的意義。

3、近些年，有關(guān)表達(dá)dpe的工程菌表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母菌以及枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌具有基因表達(dá)水平較高，表達(dá)系統(tǒng)較為完善，且易于培養(yǎng)等多個(gè)優(yōu)點(diǎn)；但在工業(yè)生產(chǎn)中，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)往往不是較好的選擇，一方面，大腸桿菌具有內(nèi)毒素并不是公認(rèn)的安全(gras)宿主；另一方面，大腸桿菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，具有雙重膜，因而蛋白的分泌性較差，大多數(shù)工業(yè)蛋白是在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生，這使得dpe的純化過(guò)程較為復(fù)雜。酵母菌同樣可以作為dpe的宿主菌對(duì)其進(jìn)行表達(dá)，且許多酵母菌是食品級(jí)微生物(gras)。酵母菌表達(dá)系統(tǒng)具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、操作難度較低等優(yōu)點(diǎn)。但其克隆基因表達(dá)效果較低、發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、上清液多糖濃度較高不利于蛋白純化。

4、近些年來(lái)，越來(lái)越多的研究人員開(kāi)始將枯草芽孢桿菌作為宿主菌表達(dá)dp?e。這主要是因?yàn)榭莶菅挎邨U菌是食品級(jí)微生物(gras)，適合應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，而且它是革蘭氏陽(yáng)性菌，只有一層膜，有利于蛋白的分泌，且還具備發(fā)酵過(guò)程簡(jiǎn)單、沒(méi)有密碼子偏好性等優(yōu)點(diǎn)。

5、因此，提供一株重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一株重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，解決了dpe在表達(dá)系統(tǒng)選擇的安全性及重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中表達(dá)的不穩(wěn)定性等問(wèn)題。

2、由于枯草芽孢桿菌具有諸多優(yōu)點(diǎn)，及目前研究都是利用重組質(zhì)粒在宿主菌中進(jìn)行表達(dá)，為了克服質(zhì)粒不穩(wěn)定性和抗生素等不安全因素，本發(fā)明選擇枯草芽孢桿菌作為表達(dá)宿主，并將dpe整合在基因組上表達(dá)，以提高dpe在枯草芽孢桿菌中的酶活及穩(wěn)定性。

3、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

4、一種重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe，依次含有16sdna基因序列、dpe基因序列、ccdpe基因序列；

5、所述16sdna基因序列如seq?id?no.3所示；所述dpe基因序列如se?q?id?no.1所示；所述ccdpe基因序列如seq?id?no.2所示。

6、進(jìn)一步，構(gòu)建重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe的基礎(chǔ)載體為pwb980載體。

7、進(jìn)一步，所述的重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe在提高dp?e酶活性中的應(yīng)用。

8、進(jìn)一步，一種重組枯草芽孢桿菌，含有所述的重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe。

9、進(jìn)一步，所述的重組枯草芽孢桿菌在提高dpe酶活性中的應(yīng)用。

10、經(jīng)由上述的技術(shù)方案可知，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明公開(kāi)提供了一種重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，該重組枯草芽孢桿菌通過(guò)以枯草芽孢桿菌的16sdna為整合位點(diǎn)，將兩個(gè)不同來(lái)源的d-阿洛酮糖-3差向異構(gòu)酶的基因整合在枯草芽孢桿菌基因組上，采用食品安全菌株枯草芽孢桿菌作為底盤(pán)菌進(jìn)行異源表達(dá)，有效促進(jìn)d-阿洛酮糖-3差向異構(gòu)酶(dpe)的表達(dá)，使搖瓶發(fā)酵產(chǎn)dpe的酶活為3655.42u/ml，較原始對(duì)照組提高了36％，并提高了dpe在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的穩(wěn)定性。

技術(shù)特征：

1.一種重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe，其特征在于，依次含有16sdna基因序列、dpe基因序列、ccdpe基因序列；

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-cc?dpe，其特征在于，基礎(chǔ)載體為pwb980載體。

3.權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe在提高dpe酶活性中的應(yīng)用。

4.一種重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，含有權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體pwb980-16sdna-dpe-ccdpe。

5.權(quán)利要求4所述的重組枯草芽孢桿菌在提高dpe酶活性中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明公開(kāi)的一種重組枯草芽孢桿菌，通過(guò)以枯草芽孢桿菌的16sDNA為整合位點(diǎn)，將兩個(gè)不同來(lái)源的D?阿洛酮糖?3差向異構(gòu)酶的基因整合在枯草芽孢桿菌基因組上，采用食品安全菌株枯草芽孢桿菌作為底盤(pán)菌進(jìn)行異源表達(dá)，有效促進(jìn)D?阿洛酮糖?3差向異構(gòu)酶(DPE)的表達(dá)，使搖瓶發(fā)酵產(chǎn)DPE的酶活為3655.42U/ml，較原始對(duì)照組提高了36％，并提高了DPE在枯草芽孢桿菌中表達(dá)的穩(wěn)定性。

技術(shù)研發(fā)人員：張?jiān)扑?劉佳慧,趙偉,董玘鑫,楊倩,姚瑩瑩,黃微煜
受保護(hù)的技術(shù)使用者：山東福洋生物科技股份有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19