本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法。

背景技術(shù)：

1、

2、細(xì)菌耐藥性對(duì)人類(lèi)的風(fēng)險(xiǎn)主要體現(xiàn)在：1.是否在人類(lèi)相關(guān)環(huán)境中富集；2.耐藥菌是否具有高致病性；3.耐藥細(xì)菌的增殖與傳播。雖然已有許多針對(duì)沼液施用土壤中細(xì)菌耐藥性的研究，但大多聚焦于獸用抗生素的耐藥性分析，忽視了沼液施用土壤中可能產(chǎn)生的臨床藥物耐藥風(fēng)險(xiǎn)，臨床使用的抗生素?zé)o疑有更高的保護(hù)價(jià)值。分離鑒定臨床抗生素的耐藥菌，分析其是否多重耐藥，可預(yù)測(cè)耐藥菌的污染流通過(guò)程，對(duì)進(jìn)一步抑制耐藥菌的傳播具有重要的意義。

3、目前的研究主要使用稀釋涂布平板法分離沼液施用土壤中耐藥菌，其種類(lèi)主要為傳統(tǒng)抗生素抗性細(xì)菌或獸用抗生素抗性細(xì)菌，所選抗生素種類(lèi)與人類(lèi)重要臨床抗生素直接關(guān)聯(lián)較少，無(wú)法聚焦沼液施用土壤中的典型高風(fēng)險(xiǎn)耐藥菌。同時(shí)，鮮有專(zhuān)利將稀釋平板法和藥敏試驗(yàn)相結(jié)合，因此無(wú)法分析沼液施用土壤中耐藥細(xì)菌的多重耐藥性及其潛在風(fēng)險(xiǎn)。

4、現(xiàn)有的技術(shù)方法主要有以下：

5、1、一種篩選鑒定抗生素抗性菌的方法，為高效批量、篩選鑒定抗生素抗性菌的方法：取土壤樣本與磷酸鹽緩沖液混合，經(jīng)稀釋后制成不同梯度的土壤懸浮液。在lb培養(yǎng)基中加入抗生素溶液(目標(biāo)抗生素為紅霉素、鏈霉素、硫酸多粘菌素b獸用藥物)，倒平板后將土壤懸浮液涂布于平板上，培養(yǎng)觀察并確定最佳稀釋梯度。在最佳梯度批量平板涂布，培養(yǎng)后用移液槍滅菌槍頭挑取菌落，震蕩培養(yǎng)并使用甘油保藏。菌株使用高通量測(cè)序鑒定。

6、2.wang?y,sutton?n?b,zheng?y?h,et?al.effect?of?wheat?crops?on?thepersistence?and?attenuation?of?antibiotic?resistance?genes?in?soil?afterswine?wastewater?application[j].journal?of?hazardous?materials,2024:133759，告知了如下方法：采集了不同類(lèi)型的土壤樣品與沼液(不同的土壤類(lèi)型分為：黏土，砂土，壤土)，向土壤樣品中施加定量的沼液，提取dna后，使用高通量測(cè)序分析不同實(shí)驗(yàn)組的耐藥性變化，實(shí)驗(yàn)組分為種有植被的土壤和裸露的土壤及不同的土壤類(lèi)型，目標(biāo)抗生素多為獸用四環(huán)素類(lèi)、磺胺類(lèi)等。

7、3.pu?chengjun?p?c?j,liu?hang?l?h,ding?guochun?d?g?c,et?al.impact?ofdirect?application?of?biogas?slurry?and?residue?in?fields:in?situ?analysis?ofantibiotic?resistance?genes?from?pig?manure?to?fields[j].2018.告知了如下方法：采集了施用10年沼液的土壤樣品及相似土壤類(lèi)型的未施加沼液土壤作為對(duì)照，將土壤樣品溶于生理鹽水中制成土壤懸浮液，梯度稀釋后涂布于選擇性培養(yǎng)基上(目標(biāo)抗生素為磺胺甲氧基吡啶(sul)；四環(huán)素(tet)、諾氟沙星(nor)、紅霉素(ery)、萬(wàn)古霉素(van)；頭孢噻肟(ctx)、鏈霉素(str)類(lèi)獸用藥物)，倒置培養(yǎng)后計(jì)數(shù)菌落數(shù)量，對(duì)比得出施加沼液是否誘導(dǎo)了耐藥細(xì)菌的富集。

8、上述現(xiàn)有技術(shù)存在缺點(diǎn)為：

9、1.選取的抗生素多為傳統(tǒng)抗生素和獸用抗生素，忽視了沼液施用土壤中耐藥細(xì)菌對(duì)重要臨床抗生素的抗性。

10、2.無(wú)法鑒別菌株的多重耐藥性，對(duì)細(xì)菌的耐藥風(fēng)險(xiǎn)分析不全面。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法。

2、說(shuō)明：臨床重要抗生素的選擇和多重耐藥性都是耐藥性的體現(xiàn)。因此，高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌包括對(duì)重要抗生素產(chǎn)生耐藥性(包括多重耐藥性)的耐藥細(xì)菌。

3、為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法，包括以下步驟：

4、1)、設(shè)定待檢測(cè)的抗生素：

5、包括頭孢菌素類(lèi)、喹諾酮類(lèi)、碳青霉烯類(lèi)、糖肽類(lèi)抗生素；

6、2)、耐藥菌的篩選，包括以下步驟：

7、2.1)、制備梯度濃度的土壤懸浮液；

8、所述土壤包括長(zhǎng)期施用沼液的待測(cè)土壤樣品及與待測(cè)土壤樣品相似地理位置和土壤性質(zhì)的對(duì)照土壤樣品；

9、2.2)、向r2a營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入設(shè)定濃度的抗生素以及放線菌酮，制成選擇性培養(yǎng)基；

10、說(shuō)明：向r2a營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中加入設(shè)定濃度的抗生素，該設(shè)定濃度為美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)clsi設(shè)定的菌種所能承受的最大量，以保證培養(yǎng)出的菌種都有極強(qiáng)的耐藥性；

11、2.3)、將土壤懸浮液均勻涂布于該抗生素相應(yīng)的梯度濃度的選擇性培養(yǎng)基，倒置培養(yǎng)(可為7℃恒溫培養(yǎng))，從而確定該抗生素最佳的稀釋梯度；當(dāng)平板內(nèi)菌落數(shù)不多于200個(gè)時(shí)的最大梯度，判定為最佳稀釋梯度；

12、2.4)、將不同稀釋梯度的長(zhǎng)期施用沼液的待測(cè)土壤樣品在該抗生素對(duì)應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后，選取最佳稀釋梯度的土壤懸浮液，在對(duì)應(yīng)抗生素的選擇性培養(yǎng)基上批量涂布平板并倒置培養(yǎng)并挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的獨(dú)立菌落；

13、同理，將不同稀釋梯度的長(zhǎng)期施用沼液的待測(cè)土壤樣品在該抗生素對(duì)應(yīng)的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天后，選取最佳稀釋梯度的土壤懸浮液，在對(duì)應(yīng)抗生素的選擇性培養(yǎng)基上批量涂布平板并倒置培養(yǎng)；

14、針對(duì)相同的抗生素對(duì)應(yīng)的最佳梯度選擇培養(yǎng)基，通過(guò)計(jì)數(shù)對(duì)比沼液施用土樣與對(duì)照土樣的平板上長(zhǎng)出的菌落數(shù)，實(shí)現(xiàn)耐藥細(xì)菌的篩選(即，得出可培養(yǎng)的相關(guān)抗生素抗性細(xì)菌的富集情況)。

15、作為本發(fā)明的沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法的改進(jìn)，還包括如下的步驟3)：

16、針對(duì)獲得的耐藥細(xì)菌，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，從而鑒別具有多重耐藥性的菌株。

17、作為本發(fā)明的沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

18、所述頭孢菌素類(lèi)抗生素包括頭孢呋辛、頭孢哌酮；

19、所述喹諾酮類(lèi)抗生素包括莫西沙星、左氧氟沙星；

20、所述碳青霉烯類(lèi)抗生素包括亞胺培南、美羅培南；

21、所述糖肽類(lèi)抗生素包括萬(wàn)古霉素(鹽酸萬(wàn)古霉素)、多粘菌素b。

22、作為本發(fā)明的沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

23、所述步驟2.1)為：

24、取土壤樣品與胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(tsb)按照1g土樣與9mltsb培養(yǎng)基比例混合，用于激活土樣中的菌群，震蕩后用移液槍吸取上清液用滅菌去離子水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)瞥刹煌荻鹊耐寥缿腋∫?梯度稀釋便于計(jì)數(shù))；

25、不同梯度的土壤懸浮液，具體為：

26、9ml?tsb溶液與1g土壤樣品混合制成×10倍tsb供體，1ml×10倍tsb供體與9ml去離子水混合制得×100倍tsb供體；1ml×100倍tsb供體與9ml去離子水混合制得×1k倍tsb供體；以此類(lèi)推，制得×100、×1k、×1w、×10w、×100w的tsb供體；作為不同梯度的土壤懸浮液；

27、當(dāng)土壤樣品為長(zhǎng)期施用沼液的土壤樣品時(shí)，所得為長(zhǎng)期施用沼液的土壤樣品對(duì)應(yīng)的不同梯度的土壤懸浮液；

28、當(dāng)土壤樣品為對(duì)照土壤樣品時(shí)，所得為對(duì)照土壤樣品對(duì)應(yīng)的不同梯度的土壤懸浮液。

29、說(shuō)明：“×100”代表為上述設(shè)定濃度1％，×1k代表為上述設(shè)定濃度1‰；其余以此類(lèi)推。

30、作為本發(fā)明的沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

31、抗生素的設(shè)定濃度為：亞胺培南：16ug·ml-1、美羅培南：16ug·ml-1、左氧氟沙星：8ug·ml-1、莫西沙星：8ug·ml-1、頭孢哌酮：64ug·ml-1、頭孢呋辛酸：32ug·ml-1、萬(wàn)古霉素(鹽酸萬(wàn)古霉素)：32ug·ml-1、多粘菌素b：4ug·ml-1；

32、放線菌酮的設(shè)定濃度為：100ug·ml-1。

33、作為本發(fā)明的沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥細(xì)菌的篩選方法的進(jìn)一步改進(jìn)：

34、藥敏試驗(yàn)鑒別菌株多重耐藥性具體為：

35、挑取沼液施用平板中長(zhǎng)勢(shì)較好的獨(dú)立菌落(在最佳梯度培養(yǎng)兩天，培養(yǎng)后挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落)，與tsb液體培養(yǎng)基混合后，涂布于mh(a)培養(yǎng)基中(mh(a)培養(yǎng)基為藥敏試驗(yàn)常用的培養(yǎng)基)，在其中貼上不同種類(lèi)的藥敏紙片，倒置培養(yǎng)后觀察并測(cè)量其中產(chǎn)生的抑菌圈的直徑，與clsi藥敏標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比得出菌體對(duì)不同抗生素表現(xiàn)的耐藥性(除供試菌體外還需進(jìn)行每日質(zhì)控，即利用標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)當(dāng)日藥敏試驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性)。

36、本發(fā)明是從抗生素選擇入手，整理選擇了目前臨床大量使用的及未來(lái)臨床主要依靠的重要抗生素種類(lèi)，直接分析沼液施用土壤中是否富集了上述重要臨床抗生素對(duì)應(yīng)的耐藥細(xì)菌。與此同時(shí)，針對(duì)獲得的耐藥細(xì)菌，結(jié)合藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)它們表達(dá)出的多重耐藥性，從而嘗試建立一套方便快捷的篩選沼液施用土壤中高風(fēng)險(xiǎn)耐藥菌的方法。

37、本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

38、1.選擇了人類(lèi)臨床大量使用或即將成為未來(lái)依靠的抗生素種類(lèi)，監(jiān)測(cè)了沼液施用土壤中富集的臨床抗生素耐藥菌。

39、本發(fā)明從抗生素的選擇入手，研究目前臨床大量使用或未來(lái)即將成為依靠的抗生素種類(lèi)，其對(duì)應(yīng)的耐藥細(xì)菌無(wú)疑對(duì)人類(lèi)社會(huì)的風(fēng)險(xiǎn)更大，同時(shí)警醒相關(guān)領(lǐng)域研究不要忽視沼液施用土壤中可能產(chǎn)生的臨床耐藥性風(fēng)險(xiǎn)。

40、2.創(chuàng)新地加入了藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)了提取出的菌株表達(dá)出的多重耐藥性。

41、現(xiàn)有技術(shù)往往忽略菌株的高風(fēng)險(xiǎn)多重耐藥威脅，本發(fā)明創(chuàng)新地使用藥敏試驗(yàn)鑒定菌株的多重耐藥性，完善了耐藥菌風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系。