本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)，尤其是涉及一種前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)基、培養(yǎng)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、前列腺癌是常見的男性惡性腫瘤，其中大多數(shù)類型是具有管腔細(xì)胞特征的腺癌。前列腺癌研究模型主要包括動物模型、前列腺癌細(xì)胞系、人源腫瘤異種移植模型(pdx)。這些模型各有其優(yōu)缺點，動物模型雖然容易進(jìn)行基因修飾，但是由于動物和人的生理、病理和基因組有一定差異，利用動物模型得到的實驗結(jié)果往往不能應(yīng)用于臨床；前列腺癌細(xì)胞系比較容易培養(yǎng)，但是與原始腫瘤差異較大，難以反映原始腫瘤的生物學(xué)特征和患者個體差異性；pdx模型是腫瘤研究和藥物篩選的金標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的常規(guī)操作方法是將從臨床獲取的少量人腫瘤組織塊直接接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，生成的腫瘤組織用于藥物篩選，但是由于前列腺癌穿刺樣本較小，很難在免疫缺陷小鼠體內(nèi)生成腫瘤組織，導(dǎo)致前列腺癌的pdx模型成功率較低。另外，很難從前列腺癌的穿刺組織中分離大量前列腺癌干細(xì)胞用于實驗室研究，雖有報道前列腺癌細(xì)胞培養(yǎng)方法，但是都不能維持其腺癌特征。比如有研究者報道了體外培養(yǎng)管腔類型前列腺干細(xì)胞的方法，但是，這些前列腺干細(xì)胞不具備癌癥干細(xì)胞特征，沒有致瘤性，需要對其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作，使其過表達(dá)致癌基因后才具有一定的致瘤性。這些基因操作改變了原始腫瘤細(xì)胞的基因組，使其不適用于個體化精準(zhǔn)醫(yī)療。

2、前列腺癌干細(xì)胞是導(dǎo)致前列腺癌產(chǎn)生去勢抵抗性和耐藥性的一個重要根源，研究前列腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特性有利于制定靶向治療策略，提高治療效果。然而，目前很難在體外培養(yǎng)具有腺癌特征的前列腺癌干細(xì)胞，這一瓶頸限制了前列腺癌藥物研發(fā)。

3、有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的之一在于提供一種前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)基，以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)基很難從前列腺癌的穿刺組織中分離大量前列腺癌干細(xì)胞的技術(shù)問題。

2、本發(fā)明的目的之二在于提供一種前列腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中培養(yǎng)的前列腺癌干細(xì)胞無法維持腺癌特征的技術(shù)問題。

3、本發(fā)明的目的之三在于提供上述的前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)基或上述的培養(yǎng)方法在構(gòu)建腫瘤原代細(xì)胞異種移植模型中的應(yīng)用。

4、本發(fā)明的目的之四在于提供一種構(gòu)建腫瘤原代細(xì)胞異種移植模型的方法。

5、為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

6、第一方面，本發(fā)明提供了一種前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)基，由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，所述添加物包括在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中為以下濃度的組分：1～3％(v/v)的胎牛血清、1xn2、1xb-27、10～50ng/ml的egf、10～50ng/ml?bfgf、1～10nm雄激素dht、20-100μm抗壞血酸、0.02～3μm?gsk3抑制劑、0.1～20μm?tgf-β抑制劑和0.1～20μm?rock抑制劑；

7、所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括dmem/f12、dmem或rpmi-1640。

8、進(jìn)一步的，所述gsk3抑制劑包括chir99021、azd1080或ly2090314，優(yōu)選為chir99021；

9、優(yōu)選地，所述tgf-β抑制劑包括a83-01、repsox或gw788388，優(yōu)選為a83-01；

10、優(yōu)選地，rock抑制劑包括y27632、rki-1447或gsk269962a，優(yōu)選為y27632。

11、進(jìn)一步的，所述添加物還包括在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中濃度為100u/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素。

12、第二方面，本發(fā)明提供了一種前列腺癌干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，包括使用上述的培養(yǎng)基從前列腺癌組織塊分離得到的原代前列腺癌干細(xì)胞中培養(yǎng)得到前列腺癌干細(xì)胞。

13、進(jìn)一步的，所述前列腺癌組織塊分離得到的原代前列腺癌干細(xì)胞的制備方法包括將前列腺癌組織塊在消化液i中消化，分離得到原代前列腺癌干細(xì)胞；

14、優(yōu)選地，所述從前列腺癌組織塊分離得到的原代前列腺癌干細(xì)胞中培養(yǎng)得到前列腺癌干細(xì)胞包括待原代前列腺癌干細(xì)胞貼壁培養(yǎng)至80～90％時，依次加入緩沖液和消化液ii，收集細(xì)胞懸液離心，收集細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基重懸后進(jìn)行傳代培養(yǎng)；

15、優(yōu)選地，所述傳代培養(yǎng)的代次為≤4代。

16、進(jìn)一步的，所述將前列腺癌組織塊在消化液i中消化，分離得到原代前列腺癌干細(xì)胞的方法為循環(huán)消化方法；

17、優(yōu)選地，所述循環(huán)消化方法包括以下步驟：

18、a、向腫瘤穿刺組織塊中加入1～5ml消化液i，每10～20min取出含有已消化下來的細(xì)胞的消化液i，收集細(xì)胞沉淀，加入培養(yǎng)基重懸后保存?zhèn)溆茫蚴Ｓ嗟慕M織塊中加入新的消化液i；

19、b、重復(fù)步驟a直至所有組織塊消化完為止；

20、優(yōu)選地，所述消化的條件為36～38℃消化，優(yōu)選為37℃消化；

21、優(yōu)選地，所述保存的溫度為2～8℃。

22、進(jìn)一步的，所述消化液i包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基、膠原酶、抗壞血酸和rock抑制劑；

23、優(yōu)選地，所述膠原酶為i型膠原酶或ii型膠原酶，優(yōu)選為i型膠原酶；

24、優(yōu)選地，所述膠原酶在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中濃度為1～3mg/ml，優(yōu)選為2mg/ml；

25、優(yōu)選地，所述抗壞血酸在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中濃度為20～100μm，優(yōu)選為50μm。

26、優(yōu)選地，所述rock抑制劑在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中濃度為0.1～20μm，優(yōu)選為5μm。

27、優(yōu)選地，所述rock抑制劑包括y27632、rki-1447或gsk269962a，優(yōu)選為y27632。

28、進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)的條件包括在37℃環(huán)境溫度下，95％濕度下培養(yǎng)至少1周。

29、第三方面，本發(fā)明提供了上述的培養(yǎng)基或上述的培養(yǎng)方法在構(gòu)建腫瘤原代細(xì)胞異種移植模型中的應(yīng)用。

30、第四方面，本發(fā)提供了一種構(gòu)建腫瘤原代細(xì)胞異種移植模型的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求4～8任一項培養(yǎng)方法培養(yǎng)得到的前列腺癌干細(xì)胞與基質(zhì)膠混合后移植至免疫缺陷小鼠體內(nèi)，獲得腫瘤原代細(xì)胞異種移植模型；

31、優(yōu)選地，所述前列腺癌干細(xì)胞的細(xì)胞密度為50～100萬細(xì)胞/100μl基質(zhì)膠；

32、優(yōu)選地，所述移植的量為50～200μl，優(yōu)選為100μl。

33、本發(fā)明提供的一種前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)基，通過添加1xn2和1xb-27相互配合促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞內(nèi)的合成代謝、鐵離子轉(zhuǎn)運、抗氧化、細(xì)胞增殖，同時配合生長因子(egf和bfgf)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖；激素可影響前列腺癌干細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中的細(xì)胞之間及細(xì)胞與培養(yǎng)基之間的相互作用，促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞生長和增殖；抗壞血酸對前列腺癌干細(xì)胞的活性和生長具有一定作用；gsk3抑制劑、tgf-β抑制劑和rock抑制劑可協(xié)同促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞增殖和干性維持，對前列腺癌干細(xì)胞的分離產(chǎn)生正向調(diào)控促進(jìn)作用。通過在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加一定量范圍內(nèi)的1xn2、1xb-27、egf、bfgf、激素、抗壞血酸、gsk3抑制劑、tgf-β抑制劑和rock抑制劑，能夠促進(jìn)前列腺癌干細(xì)胞生長增殖，能夠從前列腺癌的小塊穿刺組織中分離并在體外擴增培養(yǎng)前列腺癌干細(xì)胞，且由于添加物具有調(diào)節(jié)細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的作用，能夠較好地使增殖細(xì)胞保留前列腺癌干細(xì)胞的生物學(xué)特征。解決了前列腺癌的穿刺組織中分離大量前列腺癌干細(xì)胞難度高的技術(shù)問題。另一方面使用該培養(yǎng)基培養(yǎng)前列腺癌干細(xì)胞的方法，使前列腺癌干細(xì)胞維持了腺癌特征?？蓱?yīng)用于構(gòu)建原代細(xì)胞異種移植模型(prdx)，提高異種移植成功率。