本發(fā)明涉及生物，具體涉及檢測豬蓋塔病毒的mira-lfd引物組，檢測方法及其應用。

背景技術：

1、蓋塔病毒(getahvirus，getv)是一種rna病毒屬披蓋病毒科(togaviridae)甲病毒屬(alphavirus)成員。主要以蚊蟲為傳播媒介，在人類、馬、牛、豬等許多哺乳動物體內也發(fā)現了該病毒。getv可在各種脊椎動物和節(jié)肢動物體內增殖。被getv感染的病豬表現為精神不振、食欲減退或消失、全身震顫、體溫升高、腹瀉、體表發(fā)紅、共濟失調等，嚴重者還可出現神經癥狀，甚至衰竭死亡。目前尚無有效針對getv的疫苗。

2、getv與諸多能夠引起豬腹瀉和繁殖障礙的相關疾病有著相似的臨床特征，難以區(qū)分，并且多為混合感染，使得getv的檢測和診斷的難度大大增加。目前getv的檢測主要是血清學方法和分子生物學方法。傳統(tǒng)血清學檢測方法陽性檢出率低、操作復雜，pcr和熒光定量pcr等分子檢測方法耗時較長，對技術人員要求較高且容易受到儀器的限制。

3、因此，開發(fā)一種簡單快速、高特異性和靈敏度的快速病原檢測方法對于實現基層病原getv檢測至關重要。

技術實現思路

1、為了解決現有技術中存在的上述技術問題之一，本發(fā)明提供了一種基于mira-lfd的檢測蓋塔病毒的引物組，試劑盒和檢測方法。

2、本公開中將多酶恒溫擴增技術(mira)與側向流動免疫技術(lfd)相結合，具有判斷結果肉眼可判讀，檢測方便，便于攜帶等優(yōu)點。而且，利用多酶恒溫擴增檢測技術在常溫下對病原體核酸進行擴增檢測，與側流層析試紙條結合，不需要復雜的操作以及儀器，可以做到現場快速檢測。彌補了常規(guī)pcr技術操作復雜、耗時長、對儀器要求較高等缺點，從而建立了一種準確直觀、便于基層及現場的快速檢測方法。

3、根據本公開的一個方面，提供了一種基于mira-lfd的檢測蓋塔病毒的引物組，其包括：

4、正向引物：5’-ccctgacgaccaagcaaaatggtaaagcac-3’(seq?id?no:9)；和

5、反向引物：5’-attgtgaacctgccaccgctgtactgcact-3’(seq?id?no:4)。

6、在一些實施方式中，所述正向引物和/或反向引物的5’端可以帶有生物素標記。

7、根據本公開的另一方面，提供了基于mira-lfd的檢測蓋塔病毒的試劑盒，其包括本公開的上述引物組。

8、在一些實施方式中，所述試劑盒還包括探針，所述探針優(yōu)選具有5’-atgtgcactggtatctgggcgcactccaggtcatacttgctcgatttct-3’(seq?id?no:13)所示的核苷酸序列。

9、在一些實施方式中，所述探針可以標記有四氫呋喃、熒光基團和/或猝滅基團。

10、在一些實施方式中，所述熒光基團可以選自熒光素(fam)、菁染料、cal?fluortm染料、rox染料標記等。

11、在本公開中，所述熒光基團和/或猝滅基團并沒有特別的限制，可以使用本領域技術人員常規(guī)使用的任意的熒光基團和/或猝滅基團。

12、在一些實施方式中，所述熒光基團可以選自6-fam、fam-dt、ned、cy2、dy-495、atto495、cy3、vic、cal?fluor?560、cal?fluor?gold?540、sima、texas?red、tamra、cy5、6-joe和6-rox中的任一種或多種。

13、在一些實施方式中，所述猝滅基團可以選自bhq1、bhq2、bhq3、tamra(四甲基羅丹明)、dabcyl、eclipse和mgb中的任一種或多種。

14、在一些實施方式中，所述探針的3’端還可以帶有阻斷基團。在本公開中，所述阻斷基團沒有特別的限制，可以使用本領域技術人員常規(guī)使用的任意的阻斷基團。

15、在一些實施方式中，所述阻斷基團可以選自胺基、磷酸基團、生物素和間臂(例如c3-spacer)中的任意一種或多種。

16、在一些實施方式中，所述試劑盒還可以包括mira擴增試劑。在一些實施方式中，所述mira擴增試劑可以包括重組酶、單鏈dna結合蛋白、dna聚合酶、重組酶輔助蛋白和解旋酶。

17、在一些實施方式中，所述試劑盒還可以包括膠體金試紙條。

18、在一些實施方式中，所述膠體金試紙條可以包括支撐物以及依次搭接在所述支撐物上的樣本墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水紙。

19、在一些實施方式中，所述金標墊上涂覆有膠體金和抗所述熒光基團的第一抗體。在一些實施方式中，所述膠體金試紙條設置有質控線和檢測線，其中所述質控線包被有鏈霉親和素，所述檢測線包被有特異性結合所述第一抗體的第二抗體。

20、根據本公開的又一方面，提供了一種檢測蓋塔病毒的方法，所述方法采用本公開的上述引物組或本公開的上述試劑盒。

21、在一些實施方式中，所述方法包括恒溫擴增的步驟。

22、在一些實施方式中，所述恒溫擴增可以在25℃～45℃的條件下進行。在一些實施方式中，所述恒溫擴增可以在25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃下進行。

23、在一些實施方式中，所述恒溫擴增可以進行5～30min，優(yōu)選進行5～20min。在一些實施方式中，所述恒溫擴增可以進行5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min或20min。

24、根據本公開的又一方面，本公開的上述引物組、本公開的上述試劑盒或本公開的上述方法在檢測樣本中的蓋塔病毒中的用途。

25、在一些實施方式中，所述蓋塔病毒可以包括豬源蓋塔病毒、牛源蓋塔病毒或馬源蓋塔病毒。在具體的實施方式中，所述蓋塔病毒可以為豬源蓋塔病毒。

26、在一些實施方式中，所述樣本沒有特別的限制，可以為任意常規(guī)采用的樣本的形式。在一些實施方式中，所述樣本可以選自血液、血漿、組織樣本、唾液、尿液等。

27、本公開的引物組、試劑盒或方法能夠高特異性的檢測蓋塔病毒，而且具有高的檢測靈敏度，具有低至約102拷貝/μl的檢測限，且檢測時間短。

28、本公開的檢測方法不需要專業(yè)的實驗室設備和人員，耗時短，操作簡單，結果可實現肉眼可視化，可以用于蓋塔病毒的現場檢測，便于基層養(yǎng)殖場使用。更為蓋塔病毒的快速診斷、實時監(jiān)測防控提供技術支持。

技術特征：

1.一種基于mira-lfd的檢測蓋塔病毒的引物組，其特征在于，所述引物組包括：

2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述正向引物和/或反向引物的5’端帶有生物素標記。

3.一種基于mira-lfd的檢測蓋塔病毒的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1或2所述的引物組。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括探針，所述探針優(yōu)選具有5’-atgtgcactggtatctgggcgcactccaggtcatacttgctcgatttct-3’(seq?id?no:13)所示的核苷酸序列，

5.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括mira擴增試劑，

6.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括膠體金試紙條，

7.一種檢測蓋塔病毒的方法，其特征在于，所述方法采用權利要求1或2所述的引物組或權利要求3至6中任一項所述的試劑盒進行檢測。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括恒溫擴增的步驟，

9.權利要求1或2所述的引物組或權利要求3至6中任一項所述的試劑盒在檢測蓋塔病毒中的用途。

10.根據權利要求9所述的用途，其特征在于，所述蓋塔病毒包括豬源蓋塔病毒、牛源蓋塔病毒或馬源蓋塔病毒，優(yōu)選為豬源蓋塔病毒。

技術總結
本公開提供了檢測蓋塔病毒的MIRA?LFD引物組及其應用。本公開還公開了基于MIRA?LFD的檢測蓋塔病毒的試劑盒，檢測蓋塔病毒的方法，以及用途。

技術研發(fā)人員：董彥君,邢璐璐,張璞,孫思祺,楊漢春
受保護的技術使用者：中國農業(yè)大學
技術研發(fā)日：
技術公布日：2024/12/19