本發(fā)明涉及一種凝血酶檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)，用于凝血酶的靈敏特異檢測(cè)。

背景技術(shù)：

1、dna已經(jīng)成為多個(gè)領(lǐng)域的核心材料，包括診斷、治療、分子計(jì)算和納米設(shè)備。dna在納米技術(shù)中的應(yīng)用主要?dú)w功于其可預(yù)測(cè)的沃森-克里克堿基配對(duì)以及我們對(duì)其雜交熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)的全面理解。toehold介導(dǎo)的鏈置換(tmsd)和toehold交換是入侵鏈通過形成堿基對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性置換dna雙鏈中一條鏈的過程，這促進(jìn)了動(dòng)態(tài)dna系統(tǒng)的開發(fā)。盡管連續(xù)操作的動(dòng)態(tài)系統(tǒng)，包括反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和合成分子機(jī)器，已經(jīng)被開發(fā)出來，但最先進(jìn)的技術(shù)仍未達(dá)到與天然對(duì)應(yīng)物的功能性和靈活性相匹配的水平。

2、催化反應(yīng)在化學(xué)和生物系統(tǒng)中起著重要作用，是廣泛rna和蛋白質(zhì)酶活性的基礎(chǔ)。在工程分子系統(tǒng)中，dna也被證明可以進(jìn)行非共價(jià)催化反應(yīng)，這為在化學(xué)、材料和醫(yī)學(xué)中嵌入更復(fù)雜的控制提供了潛力。例如，dna催化劑可用于分子診斷中的信號(hào)放大，并且可以與其他結(jié)構(gòu)組合以執(zhí)行各種功能，包括信號(hào)恢復(fù)和加權(quán)乘法。turberfield等人首次構(gòu)建了一種非酶催化系統(tǒng)，通過toehold啟動(dòng)的鏈置換來打開環(huán)，從而提高反應(yīng)速率。seelig等人改進(jìn)了這一系統(tǒng)，使其更穩(wěn)定且更高效。這些系統(tǒng)中的催化劑可以被視為原型分子馬達(dá)，因?yàn)樗鼈兘?jīng)歷從單鏈dna到雙鏈dna的構(gòu)象變化，理論上這種運(yùn)動(dòng)可以驅(qū)動(dòng)納米機(jī)器。

3、為了應(yīng)對(duì)這一挑戰(zhàn)，本發(fā)明利用dna鏈置換的高特異性，開發(fā)了一種配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)(pjs)策略，以增強(qiáng)dna鏈置換反應(yīng)的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力。將兩條互補(bǔ)的單鏈臂插入非共價(jià)dna催化反應(yīng)的底物中，以增加系統(tǒng)熵，同時(shí)盡量減少對(duì)反應(yīng)速率的影響并保持低泄漏。pjs的引入使反應(yīng)底物的催化反應(yīng)產(chǎn)率提高，因?yàn)榉磻?yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)殪卦黾拥倪^程，具有更高的熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)力，更易于發(fā)生和全面進(jìn)行。更重要的是，該系統(tǒng)還被用于構(gòu)建生物傳感平臺(tái)，在復(fù)雜生物環(huán)境中直接檢測(cè)凝血酶，展示了其魯棒性和靈敏性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是開發(fā)出一種簡(jiǎn)單、靈敏且特異的凝血酶檢測(cè)策略。

2、具體技術(shù)方案如下：

3、一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)的新方法，其檢測(cè)方法包括以下步驟：

4、(1)反應(yīng)底物退火反應(yīng)底物在95℃5min，以每秒0.1℃的速率下降至25℃，并保持5min，放在4℃?zhèn)溆谩?/p>

5、(2)熒光檢測(cè)流程為了檢測(cè)不同濃度的凝血酶，a部分溶液由底物1和底物2組成。b部分溶液由凝血酶適配體1、凝血酶適配體2、和te?mg2+組成。首先，將b部分溶液在室溫下孵育5分鐘。隨后，將a部分和b部分在37℃下混合，并通過rotor-gene?q實(shí)時(shí)熒光定量pcr分析儀(qiagen，德國(guó))監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。

6、所述步驟(2)中底物1的濃度最好是250nm。

7、所述步驟(2)中底物2的濃度最好是250nm。

8、所述步驟(2)中適配體1的濃度最好是200nm。

9、所述步驟(2)中適配體2的濃度最好是200nm。

10、所述步驟(2)中te?mg2+的濃度最好是12.5mm/l。

11、本發(fā)明利用配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)(pjs)策略建立了一種特異和靈敏的凝血酶檢測(cè)方法。由于凝血酶有兩種與不同表位結(jié)合的特異性適配體，并且每種適配體都由中間含有短互補(bǔ)序列的分裂催化劑c延伸而成，使它們能夠相互結(jié)合。其檢測(cè)原理為當(dāng)靶標(biāo)凝血酶與兩種適配體共存時(shí)，適配體會(huì)與凝血酶發(fā)生結(jié)合并使其發(fā)生鄰近效應(yīng)，從而能形成活性重構(gòu)催化劑c，最終會(huì)觸發(fā)所構(gòu)建的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)(pjs-edcr)。對(duì)于pjs-edcr，其具體原理如下(附圖1)：對(duì)于在催化劑c作用下，c首先取代三鏈復(fù)合物(ps1_2)。隨后，f1_2通過反向toehold再次置換c，然后進(jìn)行四向分支遷移，最終產(chǎn)生兩種類型的產(chǎn)物：s1f1和s2f2并出現(xiàn)顯著的熒光變化。

12、page分析首先用于驗(yàn)證pjs-edcr反應(yīng)過程(附圖2)。首先，在泳道6含有兩種反應(yīng)底物的混合物，但并沒有觀察到新的條帶，表明pjs-edcr的兩種反應(yīng)底物保持穩(wěn)定，在沒有催化劑c的情況下不會(huì)相互反應(yīng)。當(dāng)將c鏈添加到純s1_2底物中時(shí)，沒有出現(xiàn)新的條帶，因?yàn)闆]有燃料鏈添加到反應(yīng)中，循環(huán)反應(yīng)沒有發(fā)生(泳道5)。在純s1_2底物中加入c鏈時(shí)，沒有出現(xiàn)新的條帶，因?yàn)榉磻?yīng)中沒有加入燃料鏈，循環(huán)反應(yīng)沒有發(fā)生。上述結(jié)果有力地證實(shí)了pjs-edcr的成功設(shè)計(jì)和可行性。

13、為了進(jìn)一步分析pjs-edcr反應(yīng)過程，我們進(jìn)行了熒光動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證(附圖3)。在沒有催化劑c的情況下，空白對(duì)照系統(tǒng)的熒光強(qiáng)度幾乎沒有增加，這證實(shí)了pjs-edcr保持低泄漏的能力。然而，在催化劑c存在的情況下，熒光強(qiáng)度迅速增加，表明pjs-edcr的發(fā)生。上述結(jié)果表明我們成功構(gòu)建了一種新型無酶dna電路信號(hào)放大系統(tǒng)，可以應(yīng)用于凝血酶的高靈敏度和高特異性檢測(cè)。

14、在建立了凝血酶響應(yīng)型pjs-edcr之后(附圖4)，我們進(jìn)一步評(píng)估了傳感器對(duì)凝血酶的敏感性。在37℃下，向反應(yīng)體系中加入1nm至250nm不同濃度的凝血酶1小時(shí)(附圖5)。通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)凝血酶響應(yīng)型pjs-edcr，我們觀察到熒光信號(hào)與凝血酶濃度在1nm至50nm范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系((附圖6)。校準(zhǔn)方程為y＝0.19958+0.00946x，相關(guān)系數(shù)r2為0.9914。計(jì)算得出檢測(cè)限(lod)為0.2nm。與其他凝血酶響應(yīng)型的無酶dna電路信號(hào)放大系統(tǒng)相比，hear可以顯著提高靈敏度和便利性。

15、為了評(píng)估構(gòu)建的凝血酶響應(yīng)型pjs-edcr實(shí)驗(yàn)的特異性，我們引入一些相關(guān)蛋白(lgg、纖維蛋白原、牛血清白蛋白(bsa)、重組白蛋白(alb)和肌紅蛋白(myo))。在相同濃度下，凝血酶分子誘導(dǎo)的信號(hào)明顯高于其他干擾物質(zhì)或類似化合物誘導(dǎo)的信號(hào)(附圖7)。這證實(shí)了這種檢測(cè)方法具有令人滿意的選擇性。上述數(shù)據(jù)證明了這種設(shè)計(jì)具有出色的蛋白質(zhì)傳感性能。

16、本專利提出了一種新的強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)策略，應(yīng)用于凝血酶的高靈敏度和高特異性檢測(cè)。凝血酶響應(yīng)型pjs-edcr只需要兩個(gè)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的反應(yīng)底物以及兩種適配體即可快速輕松地一鍋法檢測(cè)凝血酶。該方法具有高靈敏度和高特異性，測(cè)定限為0.2nm。結(jié)果表明，凝血酶響應(yīng)型pjs-edcr方法在疾病診斷和生物醫(yī)學(xué)研究方面具有巨大的潛力。

技術(shù)特征：

1.一種基于發(fā)夾探針介導(dǎo)的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)用于痕量核酸的靈敏特異檢測(cè)，其特征在于包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的用兩種反應(yīng)底物和兩種適配體循環(huán)方法。

3.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)的新方法，其制備方法步驟(2)中底物1的濃度是1μμ-100nm。

4.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)的新方法，其制備方法步驟(2)中底物2的濃度是1μμ-100nm。

5.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)的新方法，其制備方法步驟(2)中適配體1的濃度是1μμ-100nm。

6.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)的新方法，其制備方法步驟(2)中適配體2的濃度是1μμ-100nm。

7.如權(quán)利要求1所述的一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)dna非共價(jià)催化反應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)的新方法，其制備方法步驟(2)中te?mg2+的濃度是50mm/l-1mm/l。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及一種凝血酶檢測(cè)技術(shù)，特別涉及一種基于配對(duì)接頭結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)DNA非共價(jià)催化反應(yīng)，用于凝血酶的靈敏特異檢測(cè)。本發(fā)明通過設(shè)計(jì)靶標(biāo)特異性的適配體，通過鄰位連接策略對(duì)凝血酶靶標(biāo)進(jìn)行識(shí)別，最終觸發(fā)增強(qiáng)型熵驅(qū)動(dòng)DNA非共價(jià)催化反應(yīng)。

技術(shù)研發(fā)人員：謝國(guó)明,王蔚韜,余紅艷
受保護(hù)的技術(shù)使用者：重慶醫(yī)科大學(xué)國(guó)際體外診斷研究院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/19