本發(fā)明屬于病毒檢測領(lǐng)域，特別涉及一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物、試劑盒和方法。

背景技術(shù)：

1、隨著養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，對(duì)蝦疫病呈現(xiàn)感染病原體的多樣化，已成為困擾對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)綠色發(fā)展的一個(gè)重要問題。近十年對(duì)蝦養(yǎng)殖過程中常見的主要病原體包括：傳染性皮下和造血器官壞死病毒(ihhnv)、對(duì)蝦白斑病毒(white?spot?syndrome?virus,wssv)毒株、十足目虹彩病毒1(decapod?iridescent?virus1,div1)毒株、蝦肝腸胞蟲(enterocytozoonhepatopenaei，ehp)和致急性肝胰腺壞死病弧菌(acute?hepatopancreatic?necrosisdisease?causing?vibrio,vp?ahpnd)等。

2、ihhnv自1981年在美國夏威夷地區(qū)的細(xì)角濱對(duì)蝦(penaeus?stylirostris)中首次發(fā)現(xiàn)以來[1]，在世界范圍內(nèi)迅速傳播，現(xiàn)廣泛分布于全球各種野生下和養(yǎng)殖蝦中[2,3]，常見于東南亞對(duì)蝦(斑節(jié)對(duì)蝦)和美洲野生對(duì)蝦(南美白對(duì)蝦、藍(lán)對(duì)蝦和其他太平洋沿岸野生對(duì)蝦)[4]。對(duì)蝦感染ihhnv后首先出現(xiàn)的跡象是嗜睡，然后是靜止不動(dòng)，倒立沉入底部，肌肉不透明，無活動(dòng)性或者死亡[5]。此外，有些感染ihhnv的對(duì)蝦不出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，但可作為傳染源存在于群體中[6]。感染群體還會(huì)出現(xiàn)引起矮小殘缺綜合征(runt-deformitysyndrome，rds)，主要影響為生長緩慢，表皮畸變，但無死亡。基于以上病理特征，養(yǎng)殖對(duì)蝦感染ihhnv后常出現(xiàn)個(gè)體畸形率高、生長率變慢及養(yǎng)殖性能差等問題，給對(duì)蝦的養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年在主要對(duì)蝦養(yǎng)殖區(qū)重大及新發(fā)疫病病原陽性檢出率中，ihhnv的流行率仍然較高，均在10％左右[7]，因此ihhnv值得我們持續(xù)深入的關(guān)注。

3、作為世界上危害最嚴(yán)重的對(duì)蝦病毒之一，ihhnv給對(duì)蝦養(yǎng)殖造成了巨大負(fù)面影響[8]。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(woah)已將傳染性皮下和造血組織壞死病列為必須申報(bào)的甲殼類重要疫病之一。感染ihhnv的不同種類個(gè)體癥狀不相同，但大部分以慢性感染為主，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起死亡，致死率可達(dá)90％[9]。目前ihhnv感染尚無有效治療方法，一旦發(fā)生大規(guī)模的感染情況，難以在第一時(shí)間內(nèi)便采取有效措施進(jìn)行控制，極易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和連鎖影響，因此定期檢測和早期診斷是至關(guān)重要的。

4、現(xiàn)行的檢測方法主要采取生物學(xué)方法，傳統(tǒng)的顯微鏡鏡檢、細(xì)菌培養(yǎng)等方法已經(jīng)逐漸被取代。目前ihhnv的檢測主要采用gb/t?25878-2010中的普通pcr方法，進(jìn)出口對(duì)蝦中ihhnv的診斷檢疫多使用sn/t?1673-2013中的熒光pcr方法。lamp技術(shù)作為新型的常溫檢測技術(shù)也逐漸被應(yīng)用。葛輝等開發(fā)了可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(lamp)技術(shù)方法，最低檢出限為10.3copies/μl[10]。但可視化lamp引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，假陽性較多，可視化判定極易造成人為判讀的主觀誤差，在實(shí)際檢測中均存在一定的缺陷。

5、基于crispr技術(shù)在檢測成本、效率、便攜性和特異性等方面的優(yōu)勢，逐步在動(dòng)物疫病檢測方面得到應(yīng)用，但目前此方法在水生疫病檢測中的應(yīng)用較少見。近年來，研究報(bào)道蝦病共感染情況普遍存在。胡文娟等人于2014年對(duì)上海地區(qū)部分淡水養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦wssv和ihhnv的感染及共感染情況進(jìn)行了跟蹤、檢測和人工感染分析，檢測結(jié)果顯示，wssv和ihhnv平均單感染率分別為42.6％和38.5％，雙病毒共感染率為20.5％[11]。因此ihhnv的鑒別檢測在一線養(yǎng)殖場的應(yīng)用途徑廣泛。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物。

2、本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的熒光檢測試劑盒。

3、本發(fā)明的第三個(gè)目的一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的試紙條。

4、本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供所述基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物、熒光檢測試劑盒以及試紙條的應(yīng)用。

5、本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

6、一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物，包括一對(duì)rpa引物和crna，其核苷酸序列如下所示：

7、rpa2-f：5＇-gtcatcccgacgacgaagaatggacagaa-3＇(seq?id?no.1)；

8、rpa2-r：5＇-ttctggtgttgaagttcttggaggagtttga-3＇(seq?id?no.2)；

9、crrna1：5＇-uaauuucuacuaaguguagauguucgugcguucucgaagca?-3＇(seq?id?no.3)。

10、一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的熒光檢測試劑盒，包括上述基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物。

11、所述的試劑盒還包括rpa?buffer、nebuffer?r2.1、cas?12a蛋白、rna酶抑制劑、ssdna、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照中的至少一種。

12、所述的ssdna的序列如下：5’-fam-ttatt-bhq1-3’。

13、所述的陽性對(duì)照為ihhnv標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒。

14、所述的陰性對(duì)照為depc水。

15、一種基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的試紙條，包括上述基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物。

16、所述的試紙條還包括crispr?cas12/13hybridetect試紙條、nebuffer?r2.1、cas12a蛋白、rna酶抑制劑、ssdna、rpa?buffer、陽性對(duì)照和陰性對(duì)照中的至少一種。

17、所述的ssdna的序列如下：5’-fam-ttttttt-biotin-3’。

18、所述的基于rpa和crispr-cas12a檢測ihhnv病毒的引物、熒光檢測試劑盒和試紙條中的至少一種在非疾病診斷治療目的的檢測ihhnv病毒中的應(yīng)用。

19、一種基于rpa和crispr-cas12a非疾病診斷治療目的的檢測ihhnv病毒的方法，包括如下步驟：

20、(1)提取待測樣本的核酸，作為dna模板；

21、(2)rpa擴(kuò)增

22、配制rpa擴(kuò)增體系(50μl)：buffer?a?29.4μl，10μmol/l上下游引物rpa2-f和rpa2-r各2μl，depc水11.1μl，buffer?b?2.5μl，dna模板3μl，于39±1℃條件下進(jìn)行rpa擴(kuò)增，得到rpa擴(kuò)增產(chǎn)物；其中，上下游引物rpa2-f和rpa2-r的核苷酸序列分別如seq?id?no.1和seqid?no.2所示；

23、(3)rpa-cas12a檢測：

24、①crispr-cas12a熒光檢測

25、配制crispr-cas12a熒光檢測體系(20μl)：nebuffer?r2.1?2μl，1μmol/l?cas?12a蛋白0.5μl，250～500nmol/l?crrna1μl，200nmol/l～5μmol/l?ssdna1μl，40u/μl?rna酶抑制劑rri?0.25μl，rpa擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，depc水補(bǔ)足至20μl；然后將配制好的反應(yīng)管瞬時(shí)離心混勻，37±1℃條件下反應(yīng)40～60min，測定熒光值，觀察擴(kuò)增曲線；其中，crrna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，ssdna的核苷酸序列如seq?id?no.4所示；

26、和/或

27、②crispr-cas12a試紙條檢測

28、配制crispr-cas12a試紙條檢測體系(100μl)：nebuffer?r2.1?2μl，1μmol/l?cas12a蛋白0.5μl，250～500nmol/l?crrna1μl，200nmol/l～10μmol/l?ssdna?2μl，40u/μl?rna酶抑制劑rri?0.25μl，rpa擴(kuò)增產(chǎn)物3μl，depc水補(bǔ)足至20μl；37±1℃條件下反應(yīng)40min～60min，待反應(yīng)完成后，加入depc水80μl，吹打均勻后把試紙條的樣品檢測端浸于反應(yīng)液中，觀察控制條帶和檢測條帶的結(jié)果；其中，crrna的核苷酸序列如seq?id?no.2所示，ssdna的核苷酸序列如seq?id?no.5所示；

29、(4)結(jié)果判斷

30、若步驟①中的檢測結(jié)果出現(xiàn)熒光信號(hào)且逐漸增強(qiáng)，熒光曲線呈s型，說明待測樣本為ihhnv陽性樣本(存在ihhnv病毒)；反之，若步驟①中的檢測結(jié)果無明顯的熒光信號(hào)，說明待測樣本為ihhnv陰性樣本；

31、若步驟②中的檢測結(jié)果中控制條帶和檢測條帶均出現(xiàn)紅色條帶，說明待測樣本為ihhnv陽性樣本(存在ihhnv病毒)；若步驟②中的檢測結(jié)果中控制條帶出現(xiàn)紅色條帶，但檢測條帶未出現(xiàn)紅色條帶，說明待測樣本為ihhnv陰性樣本；若步驟②中的檢測結(jié)果中控制條帶和檢測條帶均未出現(xiàn)紅色條帶，說明檢測結(jié)果無效，需要重新檢測。

32、步驟(2)中所述的rpa擴(kuò)增的時(shí)間為10～30min；優(yōu)選為10min。

33、步驟(2)中所述的rpa擴(kuò)增體系的配制方法如下：將buffer?a、上下游引物rpa2-f、rpa2-r和depc水預(yù)先配制混勻后轉(zhuǎn)移至基礎(chǔ)反應(yīng)單元中，使rpa核酸擴(kuò)增試劑盒中基礎(chǔ)反應(yīng)單元的凍干粉充分重溶均勻，然后向反應(yīng)單元管蓋內(nèi)側(cè)加入buffer?b，最后在管內(nèi)加入dna模板，獲得rpa擴(kuò)增體系。

34、步驟(2)中所述的rpa擴(kuò)增還包括將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證的步驟。

35、步驟①和②中所述的crrna的終濃度優(yōu)選為250nmol/l。

36、步驟①和②中所述的ssdna1的終濃度優(yōu)選為200nmol/l。

37、步驟①和②中所述的反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為40min。

38、本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

39、1、本發(fā)明將重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase?polymerase?amplification，rpa)與crispr(clustered?regularly?interspaced?short?palindromic?repeat)技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出一套ihhnv的恒溫快速檢測方法：首先pra過程通過特異性引物結(jié)合識(shí)別靶標(biāo)dna，在單鏈dna結(jié)合蛋白和在dna聚合酶作用下發(fā)生鏈置換反應(yīng)，恒溫條件下大量擴(kuò)增[12]；然后crispr-cas12a蛋白在特異性crrna介導(dǎo)下與rpa擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，該復(fù)合物能將體系內(nèi)熒光標(biāo)記的單鏈dna高效切割從而釋放熒光報(bào)告基團(tuán)，通過收集熒光信號(hào)即可檢驗(yàn)?zāi)康膁na[13]。

40、2、本發(fā)明基于rpa和crispr-cas12a技術(shù)開發(fā)出ihhnv熒光法和試紙條法兩套恒溫檢測方法，可以對(duì)臨床樣本中的少量dna進(jìn)行快速、簡便的即時(shí)檢測，以針對(duì)不同的檢測場景和需求，為ihhnv的早期檢測和診斷提供新的手段。