本實(shí)用新型涉及一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置。

背景技術(shù)：

哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)可能將正常的體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤發(fā)生的狀態(tài)，例如p53和Rb路徑的失活會(huì)導(dǎo)致顯負(fù)性p53蛋白(p53DD)的表達(dá)，一個(gè)激活細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)/細(xì)胞周期蛋白復(fù)合體(cyclinD1/CDK4^R24C)與原癌基因的激活,Ras,和hTERT通路通過致癌的表達(dá)形式的原癌基因(c-Myc^T58A),H-Ras(H-Ras^G12V)和hTERT,可以驅(qū)動(dòng)不同的人類細(xì)胞轉(zhuǎn)換致瘤的狀態(tài)。研究報(bào)道稱使用上述的致癌基因組合可以使正常細(xì)胞發(fā)生致癌狀態(tài)，這表明正常的肝細(xì)胞可能用于基因工程以幫助研究發(fā)現(xiàn)在人體癌癥的正常轉(zhuǎn)化過程，當(dāng)它回到宿主肝細(xì)胞中時(shí)可以形成腫瘤。

慢性病毒載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)不可復(fù)制細(xì)胞同時(shí)需要編碼腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)需要在生物安全等級(jí)為3級(jí)的密閉實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。然而目前的生物醫(yī)學(xué)試驗(yàn)所使用的培養(yǎng)裝置仍然不能很好的保護(hù)試驗(yàn)人員。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決目前技術(shù)中存在的問題，本實(shí)用新型提出了一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置，該裝置為密閉系統(tǒng)，不會(huì)產(chǎn)生慢病毒氣溶膠，液不會(huì)直接與慢病毒培養(yǎng)液接觸，可有效保護(hù)試驗(yàn)人員，同時(shí)裝置兩個(gè)培養(yǎng)面均可培養(yǎng)細(xì)胞。

為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本實(shí)用新型是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，培養(yǎng)裝置由盒體、閥門、連接管、Q-syte分隔膜密閉式無針接頭、Luer-Lock注射器、過濾器和密閉栓組成；

所述的盒體由上盒片和下盒片緊密貼合組成，上盒片和下盒片固定于剛性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒體外側(cè)凹入形成矩形 容積腔，在盒體的左右兩側(cè)各有一個(gè)變截面圓柱狀通道，通道內(nèi)固定有變截面圓柱狀的母槽連接管；

所述的Luer-Lock注射器的接頭為螺旋接頭。

優(yōu)選的，所述的上盒片和下盒片面積為25cm²，上盒片和下盒片為透氣和透明的材料制成。

本實(shí)用新型的有益效果是：提出了一種密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置和培養(yǎng)方法，該實(shí)用新型所用的裝置可隔絕試驗(yàn)內(nèi)部與外部的環(huán)境，不會(huì)產(chǎn)生慢病毒氣溶膠，在密閉的培養(yǎng)環(huán)境中操作可避免與慢病毒培養(yǎng)液直接接觸，可有效防止試驗(yàn)人員感染；同時(shí)提出的培養(yǎng)方法得到的慢病毒載體與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法得到的載體有相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和轉(zhuǎn)染效果。

附圖說明

為了更清楚地說明本實(shí)用新型實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實(shí)用新型的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1是密閉式慢病毒載體培養(yǎng)裝置結(jié)構(gòu)圖；

圖2是所述的培養(yǎng)裝置的部件連接示意圖；

圖3是所述的兩個(gè)培養(yǎng)裝置的連接示意圖；

圖4是3天后使用OCS系統(tǒng)和CCS系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)后致癌基因編碼LVs轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對(duì)比圖，圖中縱坐標(biāo)為生物熒光酶活性，橫坐標(biāo)為不同的編碼的致癌基因；

圖5是使用OCS系統(tǒng)和CCS系統(tǒng)轉(zhuǎn)導(dǎo)PPH效果對(duì)比圖，圖中縱坐標(biāo)為生物熒光酶活性；

圖6是缺失表達(dá)能力的質(zhì)粒和正常的質(zhì)粒感染PPH效果對(duì)比圖；

圖7是注入慢病毒載體的小鼠在第0天、第2天和第6天的熒光素酶活性檢測圖。

附圖中，各標(biāo)號(hào)所代表的部件列表如下：

1-盒體，11-盒片，12-容積腔，13-母槽連接管，2-閥門，3-連接管，4-Q-syte接頭，5-Luer-Lock注射器，6-過濾器，61-0.22um過濾器，62-0.45um過濾器，7-密閉栓。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本實(shí)用新型實(shí)施例中的附圖，對(duì)本實(shí)用新型實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本實(shí)用新型一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒緦?shí)用新型中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本實(shí)用新型保護(hù)的范圍。

請(qǐng)參閱圖1-3所示，培養(yǎng)裝置由盒體(1)、閥門(2)、連接管(3)、Q-syte分隔膜密閉式無針接頭(4)、Luer-Lock注射器(5)、過濾器(6)和密閉栓(7)組成；盒體(1)由上盒片和下盒片緊密貼合組成，上盒片和下盒片固定于剛性框架下，上盒片和下盒片中心部位向盒體(1)外側(cè)凹入形成矩形容積腔(12)，在盒體(1)的左右兩側(cè)各有一個(gè)變截面圓柱狀通道，通道內(nèi)固定有變截面圓柱狀的母槽連接管(13)；Luer-Lock注射器(5)的接頭為螺旋接頭。

試驗(yàn)步驟

1、材料

1.1試劑

1.2 裝置

1.2.1 生物安全柜

1.2.2 37℃和5％CO2的孵化器

1.2.3 水浴

1.2.4 倒置顯微鏡

1.2.5 -80℃冷凍器

1.3 細(xì)胞

1.3.1 293T細(xì)胞

1.3.2 原代肝細(xì)胞

1.3.3 Huh7.5.1細(xì)胞

2、方法建立及注意事項(xiàng)

2.1建模方式

CCS系統(tǒng)由25cm²的盒片和連接裝置組成，培養(yǎng)裝置是一個(gè)緊密的細(xì)胞培養(yǎng)盒體，盒體由兩個(gè)培養(yǎng)面組成，培養(yǎng)面固定在一個(gè)剛性框架上通過標(biāo)準(zhǔn)Luer-Lock連接口連接形成一個(gè)無菌的細(xì)胞培養(yǎng)腔體，培養(yǎng)表面是平的、透明的并具有透氣性能。CCS系統(tǒng)用來培養(yǎng)293T細(xì)胞(LVs制品)和PPH(用于轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn))，該系統(tǒng)與使用OCS系統(tǒng)在10cm²的Petri盤體上培養(yǎng)細(xì)胞類似。在OCS系統(tǒng)中慢性病毒(LVs)和PPH培養(yǎng)上層清液中存在的VSV-G-pseudotyped粒子可以使用Huh7.5.1細(xì)胞檢測出來。只有在CCS系統(tǒng)中培養(yǎng)實(shí)施步驟才可以細(xì)化。

2.2在CCS中管理液體轉(zhuǎn)移

由于培養(yǎng)系統(tǒng)是封閉的，通過使用注射器推拉相同體積的液體或氣體把所有的液體(細(xì)胞懸浮、培養(yǎng)介質(zhì)、LVs等)從一個(gè)腔體(注射器，培養(yǎng)裝置)傳輸?shù)搅硗庖粋€(gè)腔體中。此外，在操作之前還需要檢查所有的閥門是打開的，避免培養(yǎng)裝置內(nèi)部的氣壓過高，檢查連接末端的插頭為0.22um的過濾器或者Q-syte注射部位。

為了注入液體，使用20mL的注射器吸入2mL氣體然后吸入10mL液體制成一個(gè)空氣存儲(chǔ)注射器，這可以避免液體(尤其是細(xì)胞懸浮液)留在試管中。通過傾斜培養(yǎng)裝置另一面注射和推吸試管中的泡沫可以將泡沫擠出培養(yǎng)裝置。注射超過10mL的液體將會(huì)導(dǎo)致多余的液體殘留在試管中。

3.試劑制備

3.1轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒的制備

首先使用PCR對(duì)hTERT+p53^DD、cyclinD1+CDK4^R24C和c-myc^T58A+HRas^G12V進(jìn)行增強(qiáng)處理，在CMVV5-LUC受體質(zhì)粒上的XmaI和 KpnI部位之間克隆三個(gè)插入序列，并對(duì)插入序列進(jìn)行熒光素酶標(biāo)記基因操作，得到熒光素標(biāo)記的pLenti-hTERT+53^DD、pLenti-cyclinD1+CDK4^R24C和pLenti-c-myc^T58A+HRas^G12V質(zhì)粒，使用熒光素酶pLenti-CMVV5作為控制熒光素酶報(bào)告基因的控制質(zhì)粒；

3.2 293T細(xì)胞和Huh7.5.1細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基(CM)制備

向細(xì)胞培養(yǎng)基中添加體積比為10％的滅活胎牛血清，體積比為1％的非必需氨基酸，10ug/mL的慶大霉素；使用0.22um的過濾器(61)過濾后在4℃的環(huán)境中保存最多兩個(gè)月；

3.3原代肝細(xì)胞(PPH)培養(yǎng)基(WM)制備

向500mL的William’s E培養(yǎng)基添加10mL的質(zhì)量體積比為7.5％的牛血清蛋白，5mL的ITS-G，10^-7M的地塞米松溶液，體積比為1％的非必需氨基酸，體積比為1％的青霉素和鏈霉素的混合溶液，體積比為1％的穩(wěn)定性谷氨酸；使用0.22um的過濾器過濾后保存在-80℃的環(huán)境中。

3.4原代肝細(xì)胞(PPH)離析

將肝切成小塊組織立即置于含冰塊的生理鹽水中，在切割表面上插入可視裝置，然后在pH為7.4和37℃的環(huán)境中使用500mL的緩沖液對(duì)肝組織進(jìn)行灌洗，緩沖液中包含8.3g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES，0.19g/L的EGTA；使用包含100g的IV型膠原酶、3.9g/L的NaCl、0.5g/L的KCl、2.4g/L的HEPES和0.7g/L的CaCl₂·H₂O的400mL緩沖液在37℃的環(huán)境中進(jìn)行第二次灌洗；使用IV型的膠原酶循環(huán)灌注，然后移除大塊的肝組織，輕輕搖動(dòng)存儲(chǔ)在冰水中的包含有2.4g/L的HEPESD的HBSS緩沖液即可得到靶細(xì)胞；將含有靶細(xì)胞的懸浮液通過尼龍網(wǎng)過濾后在4℃的環(huán)境中沖洗三次；使用Trypan試劑排斥實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得到的肝細(xì)胞的可用性；立即使用合格的細(xì)胞或者凍結(jié)在-80℃的添加有10％的胎牛血清溶液中以代用；

4.在封閉的培養(yǎng)系統(tǒng)中制作慢性病毒上清的步驟

第0天

4.1培養(yǎng)裝置的準(zhǔn)備工作

4.1.1培養(yǎng)裝置上閥門(2)的位置連接兩端為公槽的連接管(3)到培養(yǎng)裝置的閥門(2)上，連接0.22um的過濾器(61)的母槽端到連接管(3)上，打開所有的閥門(2)；

4.1.2移除25cm²的培養(yǎng)裝置的蓋帽，給其母槽端連接一個(gè)閥門(2)，給閥門(2)連接一個(gè)兩端為公槽的連接管(3)，給連接管連接一個(gè)Q-syte注射器(5)。

4.2 293T細(xì)胞的準(zhǔn)備

4.2.1在一個(gè)50mL的試管中，重新懸浮在12mL的培養(yǎng)基中的3.0到7.5×10⁶的293T細(xì)胞；

4.2.2給Luer-Lock注射器(5)適配一個(gè)針頭，吸入2mL空氣然后吸入10mL的細(xì)胞懸浮液；

4.3培養(yǎng)裝置中第一次注射293T細(xì)胞；

4.3.1使用Betadin在高壓無菌中凈化Q-syte注射部位(4)；

4.3.2給Q-syte注射部位(4)連接上Luer-Lock注射器(5)；

4.3.3打開右邊的所有閥門(2)；

4.3.4稍微傾斜培養(yǎng)裝置的左邊，然后注射10mL細(xì)胞懸浮液；

4.3.5當(dāng)細(xì)胞懸浮液接近左邊的閥門(2)時(shí)，關(guān)閉閥門然后使用貯存有空氣的Luer-Lock注射器(5)精確對(duì)應(yīng)培養(yǎng)裝置中細(xì)胞液的體積，這樣細(xì)胞懸浮液可以全部進(jìn)入培養(yǎng)裝置(1)中；

4.3.6檢查充滿于培養(yǎng)裝置(1)中的細(xì)胞懸浮液是否在進(jìn)入或在左邊和右邊的連接管(3)中有殘留；

4.3.7關(guān)閉閥門(2)；

4.3.8斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.3.9使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.3.10將培養(yǎng)裝置(1)平放在孵化器中，在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化6-8小時(shí)；

4.3.11識(shí)別平躺面；

4.4在培養(yǎng)裝置中第二次注射293T細(xì)胞；

4.4.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.4.2連接一個(gè)空的Luer-Lock注射器(5)；

4.4.3打開左右閥門(2)；

4.4.4吸入上層清液以移除可能沒有吸附的過多的細(xì)胞；

4.4.5斷開Luer-Lock注射器(5)；

4.4.6重復(fù)4.2和4.3；

4.4.7在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化24小時(shí)，返回到培養(yǎng)裝置中，將上下面互調(diào)。

第一天

4.5沖洗293T細(xì)胞；

4.5.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.5.2連接一個(gè)空的Luer-Lock注射器(5)；

4.5.3打開左右閥門(2)；

4.5.4吸入上層清液以移除細(xì)胞；

4.5.5斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.5.6使用新的Luer-Lock注射器(5)，注射并移除10mL培養(yǎng)基以沖洗培養(yǎng)裝置(1)，然后丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.5.7使用新的注射器(5)注入10mL培養(yǎng)基；

4.5.8關(guān)閉閥門(2)；

4.5.9斷開和丟棄注射器(5)；

4.5.10使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.5.11在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化1小時(shí)。

4.6轉(zhuǎn)染混合物

4.6.1在1.5mL的Eppendorf試管中添加500uL的無菌水、8.1ug的HIV-gap-pol質(zhì)粒，8.1ug的pbabe-hTERT+p53^DD,pbabe-cyclinD1+CDK4^R24C或者pbabe-cmycT58A+HRas^G12V質(zhì)粒、2.7ug pMD2VSV-G-Env質(zhì)粒、62uL的CaCl2 2M；

4.6.2在一個(gè)5mL的圓底聚丙烯試管中添加500uL的HBS 2x，在輕微旋轉(zhuǎn)后使試管中的物質(zhì)沉入管體，然后在室溫條件下孵化20分鐘，旋轉(zhuǎn)后添加9mL培養(yǎng)基。

4.7轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

4.7.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.7.2連接一個(gè)空的Luer-Lock注射器(5)；

4.7.3打開左右閥門(2)；

4.7.4吸入上層清液；

4.7.5斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.7.6將含有2mL氣體和10mL的轉(zhuǎn)染混合物(培養(yǎng)基中包含轉(zhuǎn)染試劑盒質(zhì)粒)的Luer-Lock注射器(5)連接到Q-syte注射部位(4)；

4.7.7注射培養(yǎng)基；

4.7.8關(guān)閉閥門(2)；

4.7.9斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.7.10使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.7.11在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化一夜；

第二天

4.8第一批慢性病毒載體制品

4.8.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.8.2連接一個(gè)新的注射器(5)；

4.8.3打開左右閥門(2)；

4.8.4吸入上清液；

4.8.5斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.8.6使用心得Luer-Lock注射器(5)，注射并移除10mL培養(yǎng)基以沖洗培養(yǎng)裝置(1)，然后丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.8.7使用新的注射器注入10mL培養(yǎng)基；

4.8.8關(guān)閉閥門(2)；

4.8.9斷開并丟棄Luer-Lock注射器(5)；

4.8.10使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.8.11在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化一夜。

第三天

4.9收獲第一批慢性病毒載體

4.9.1使用Betadin凈化Q-syte注射部位(4)；

4.9.2連接充滿空氣的注射器(5)；

4.9.3在左邊移除0.22um過濾器(61)；

4.9.4連接0.45um的過濾器(62)的母槽端到連接管(3)的公槽端；4.9.5連接過濾器的公槽端到公母槽連接管(3)的母槽端；

4.9.6連接第二個(gè)連接管的的公槽端到25cm²的培養(yǎng)裝置(1)(稱為培養(yǎng)二號(hào))的母槽端；

4.9.7在二號(hào)培養(yǎng)裝置(1)，連接一個(gè)公槽連接管到閥門上；

4.9.8連接0.22um的過濾器(61)到連接管上；

4.9.9打開所有閥門(2)；

4.9.10將一號(hào)培養(yǎng)裝置上面反轉(zhuǎn)到下面；

4.9.11使用注射器將空氣推入一號(hào)培養(yǎng)裝置中，以移除慢性病毒上清液從一號(hào)培養(yǎng)裝置到二號(hào)中；

4.10慢性病毒的低溫貯藏；

4.10.1關(guān)閉所有閥門(2)；

4.10.2將二號(hào)培養(yǎng)裝置上的所有連接管丟棄(3)；

4.10.3關(guān)閉二號(hào)培養(yǎng)裝置上的插管；

4.10.4在-80℃下將二號(hào)培養(yǎng)裝置直接凍結(jié)；

4.11慢性病毒第二批產(chǎn)品；

4.11.1更換0.45um過濾器(62)并連接到一號(hào)培養(yǎng)裝置；

4.11.2使用Betadin凈化一號(hào)培養(yǎng)裝置的Q-syte注射部位(4)；

4.11.3將含有2mL氣體和10mL的培養(yǎng)基的注射器連接到Q-syte注射部位；

4.11.4打開左右閥門(2)；

4.11.5注入培養(yǎng)基；

4.11.6關(guān)閉閥門，插入0.45um的過濾器(62)；

4.11.7丟棄注射器(5)；

4.11.8在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化24小時(shí)。

第四天

4.12收獲第二批慢性病毒載體

4.12.1重復(fù)4.9和4.10步驟激活三號(hào)培養(yǎng)裝置中的慢性病毒；

4.12.2丟棄一號(hào)培養(yǎng)裝置；

5.一個(gè)密閉培養(yǎng)系統(tǒng)中原代肝細(xì)胞的慢性病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)步驟

第0天

5.1在培養(yǎng)裝置中注入PPH

5.1.1在25cm2的培養(yǎng)裝置里注入10×10⁶PPH重新懸??；

5.1.2將培養(yǎng)裝置平放在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化4小時(shí)；

5.1.3將培養(yǎng)裝置反轉(zhuǎn)過來使過剩的細(xì)胞吸附在第二面上；

5.1.4將培養(yǎng)裝置平放在37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化4小時(shí)

5.2 PPH轉(zhuǎn)導(dǎo)慢性病毒；

5.2.1將包含收獲慢性病毒載體(二號(hào)和三號(hào)培養(yǎng)裝置，見4.9到4.12)的培養(yǎng)裝置放置在37℃的水中解凍；

5.2.2使用注射器將上清液從四號(hào)培養(yǎng)裝置中移除，步驟如4.5.1-4.5.4

5.2.3斷開并丟棄注射器(5)；

5.2.4丟棄四號(hào)培養(yǎng)裝置0.22um過濾器(61)；

5.2.5將四號(hào)培養(yǎng)裝置的公槽連接管連接到二號(hào)或三號(hào)培養(yǎng)裝置上；

5.2.6連接一個(gè)閥門到二號(hào)或者三號(hào)培養(yǎng)裝置上的母槽端；

5.2.7連接一個(gè)公母槽連接管到閥門上；

5.2.8連接一個(gè)Q-syte注射部位(4)到連接管(3)上；

5.2.9使用Betadin凈化二號(hào)或者三號(hào)和四號(hào)裝置的兩個(gè)Q-syte注射部位(4)；

5.2.10連接充滿空氣的注射器到二號(hào)或三號(hào)培養(yǎng)裝置的Q-syte注射 部位(4)；

5.2.11連接一個(gè)空的注射器到四號(hào)培養(yǎng)裝置的Q-syte的注射部位(4)；

5.2.12打開所有閥門(2)；

5.2.13將空氣從注射器(連接到二號(hào)或三號(hào)培養(yǎng)裝置)推出，同時(shí)使用空的注射器吸入空氣。以轉(zhuǎn)移慢性病毒從二號(hào)或三號(hào)培養(yǎng)裝置到四號(hào)培養(yǎng)裝置中；

5.2.14關(guān)閉所有閥門(2)；

5.2.15斷開并丟棄注射器(5)和二號(hào)培養(yǎng)裝置；

5.2.16四號(hào)培養(yǎng)裝置插上插管；

5.2.17平放四號(hào)培養(yǎng)裝置在孵化器中，孵化器置于37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中孵化24小時(shí)。

第一天

5.3沖洗PPH

5.3.1將四號(hào)培養(yǎng)裝置中的慢性病毒上清液丟棄到五號(hào)培養(yǎng)裝置中，見步驟4.9(四號(hào)培養(yǎng)裝置代替一號(hào)，五號(hào)培養(yǎng)裝置代替二號(hào))

5.3.2關(guān)閉閥門(2)；

5.3.3丟棄五號(hào)培養(yǎng)裝置和0.45um的過濾器(62)并將其更換為0.22um的過濾器(61)；

5.3.4連接保護(hù)10mL的WM培養(yǎng)基注射到四號(hào)培養(yǎng)裝置上；

5.3.5打開閥門(2)；

5.3.6注入10mL的WM培養(yǎng)基；

5.3.7關(guān)閉閥門(2)；

5.3.8斷開并丟棄注射器(5)；

5.3.9丟棄0.22um過濾器(61)并更換為0.45um過濾器(62)；

5.3.10丟棄六號(hào)培養(yǎng)裝置中的WM，如步驟4.9；

5.3.11丟棄培養(yǎng)和0.45um的過濾器(62)并更換為0.22um的過濾器(61)；

5.3.12連接包含10mL的WM的注射器；

5.3.14注入10mL的WM；

5.3.15關(guān)閉閥門(2)；

5.3.16斷開并丟棄注射器(5)；

5.3.17平放四號(hào)培養(yǎng)裝置在孵化器中，孵化器設(shè)置37℃和CO2濃度5％的環(huán)境中48小時(shí)；

第三天

5.4PPH激活

5.4.1將四號(hào)培養(yǎng)裝置中的培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)七號(hào)培養(yǎng)裝置中，如步驟4.9(四號(hào)培養(yǎng)裝置代替培養(yǎng)一號(hào)、七號(hào)培養(yǎng)裝置代替二號(hào))；

5.4.2連接包含10mL的trpsin-EDTA的注射器；

5.4.3注入trypsin然后在倒置顯微鏡下監(jiān)視細(xì)胞分離。保持注射器連接在培養(yǎng)裝置上；

5.4.4吸入注射器中的細(xì)胞；

5.4.5斷開注射器(5)；

5.4.6轉(zhuǎn)移50mL試管中的細(xì)胞并沖洗細(xì)胞以便以后使用；

5.4.7重復(fù)5.4.2到5.4.6以激活在培養(yǎng)中的細(xì)胞。

5.5在CCS中低溫貯藏PPH

5.5.1將四號(hào)培養(yǎng)裝置中的培養(yǎng)上清液轉(zhuǎn)移到七號(hào)培養(yǎng)裝置中，如步驟4.9(四號(hào)培養(yǎng)裝置代替培養(yǎng)一號(hào)、七號(hào)培養(yǎng)裝置代替二號(hào))；

5.5.2連接包含10mL的低溫貯藏介質(zhì)的注射器；

5.5.3注入低溫貯藏介質(zhì)(低溫介質(zhì)中添加有10％的FCS)；

5.5.4斷開注射器(5)；

5.5.5在-80℃低溫下凍結(jié)四號(hào)培養(yǎng)裝置；

5.5.6使用前將細(xì)胞置于37℃的水中解凍；

5.5.7激活細(xì)胞如步驟5.4。

6動(dòng)物試驗(yàn)

動(dòng)物試驗(yàn)要獲得當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會(huì)(Comite′Re′gional d’Ethique en Matie`re d’Expe′rimentation Animale de Strasbourg；approval No.AL/01/18/08/12)的批準(zhǔn)，然后在生物安全等級(jí)為3級(jí)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

6.1注入轉(zhuǎn)導(dǎo)的PPH

在50uL的WM中數(shù)量為1×10⁶的轉(zhuǎn)導(dǎo)PPH懸浮液通過皮下注射到NMRI-Foxn1nu/Foxn1nu小鼠的背部，注射前使用吸入異氟烷((Isoflo；Axience,Pantin,France)對(duì)小鼠全身麻醉

6.2生物熒光顯影

轉(zhuǎn)導(dǎo)PPH的熒光素酶活性在移植后指定的時(shí)間測定，測定時(shí)使用生物熒光顯影技術(shù)，該技術(shù)在給小鼠腹腔內(nèi)注射100uL的d-熒光素(20mg/mL；Caliper Lifesciences)后使用IVIS50的相機(jī)(caliper Lifesciences,Roissy,France)拍照。在20分鐘內(nèi)重復(fù)如前所述的1分鐘內(nèi)獲得物，從熒光素注射的時(shí)間開始到整個(gè)熒光發(fā)射時(shí)間直到觀察到信號(hào)開始降低。腫瘤細(xì)胞生物發(fā)光，可以使用動(dòng)態(tài)顯影軟件3.1分析，可以表達(dá)為光子每秒每平方厘米每球面度(p/s/cm²/sr)在熒光素注射后導(dǎo)致生物發(fā)光到達(dá)最大值后使用時(shí)間點(diǎn)。通過計(jì)算標(biāo)明的天數(shù)到移植后期的生物熒光比值來得到相關(guān)腫瘤細(xì)胞的生長。

7.質(zhì)量控制

7.1轉(zhuǎn)導(dǎo)效率

為了評(píng)估LVs的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，50000個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)PPH在5.4.6步驟中激活，每個(gè)LV轉(zhuǎn)導(dǎo)體被電鍍?cè)?6式孔板上，然后在1250轉(zhuǎn)速上離心5分鐘。上層清液被移除，增加50uL的Glo Lysis(Promega,Madison,WI)。三分鐘后加入25uL的BrightGlo熒光素(Promega)然后將25uL的混合物轉(zhuǎn)移到一個(gè)不透明板測試熒光素酶的表達(dá)活性，檢測時(shí)使用Mithras LB940luminometer(Berthold,Thoiry,France)。相同數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)化PPH作為陰性對(duì)照組進(jìn)行相似評(píng)價(jià)。

7.2 Huh7.5.2細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

為了評(píng)價(jià)LV轉(zhuǎn)導(dǎo)后在PPH培養(yǎng)的上清液中LV產(chǎn)品的功效或者LVs重組體的復(fù)制能力，1×10⁴的Huh7.5.1細(xì)胞被置于平底的96式碟子中， 然后培養(yǎng)一夜。在PPH轉(zhuǎn)導(dǎo)后，將CM以吸入的方式移除然后使用50uL的LV(覆蓋來自步驟5.4.1的培養(yǎng)7號(hào))或者三天內(nèi)收獲的培養(yǎng)上清液一式三份代替(覆蓋來自步驟4.9或者4.2得到的培養(yǎng)2號(hào)或者3號(hào))。在37℃和CO2濃度5％的條件下孵化6個(gè)小時(shí)后，添加100uL/well的CM，然后繼續(xù)培養(yǎng)3天。然后移除上清液，添加50uL的lysis熒光素酶。相同數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)化PPH作為陰性對(duì)照組進(jìn)行相似評(píng)價(jià)。

檢測修復(fù)

8.封閉培養(yǎng)系統(tǒng)中得到LV產(chǎn)量

首先我們要評(píng)價(jià)CCS系統(tǒng)中熒光素酶編碼控制LVs或者致癌基因編碼的效率是否與常規(guī)的OCS系統(tǒng)更高。培養(yǎng)并使用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CCS系統(tǒng)中的293T細(xì)胞，或者在OCS系統(tǒng)中的PtriP培養(yǎng)皿。培養(yǎng)的上清液作為用以轉(zhuǎn)導(dǎo)Huh7.5.1細(xì)胞，在OCS系統(tǒng)中操作進(jìn)行以確保轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。轉(zhuǎn)導(dǎo)Huh7.5.1細(xì)胞的熒光酶活性可以使用三天后的生物熒光活性進(jìn)行量化?？梢杂^察到從一個(gè)LV到另外一個(gè)的生物熒光活性水平有差別，這也反映了質(zhì)粒結(jié)構(gòu)對(duì)于LVs產(chǎn)品轉(zhuǎn)導(dǎo)有不同的效率，對(duì)比CCS與OCS系統(tǒng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率對(duì)于每個(gè)獨(dú)立的帶菌體是相似的。結(jié)論表明使用CCS系統(tǒng)并不妨礙293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染產(chǎn)生LVs，該結(jié)論可從圖4中分析得出。

9.在密閉系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)原代細(xì)胞

然后我們?cè)u(píng)價(jià)在CCS中轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞的可能性。對(duì)比CCS與OCS,使用控制LV或者每個(gè)致癌基因編碼的LV轉(zhuǎn)染獨(dú)立地轉(zhuǎn)染PPH。24小時(shí)后的初次轉(zhuǎn)導(dǎo)，沖洗PPH然后在熒光素酶活性量化前再培養(yǎng)48小時(shí)?？紤]到在CCS和OCS中轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性類似，這表明兩個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)相同的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，該結(jié)論可由圖5分析得到。

在CCS中轉(zhuǎn)導(dǎo)的PPH得到的組合體LV粒子制品復(fù)制能力的缺乏通過在第三天收獲的PPH轉(zhuǎn)導(dǎo)體中的Huh7.5.1細(xì)胞來評(píng)價(jià)。熒光素酶的活性在三天后量化后得到的結(jié)果與在沒有轉(zhuǎn)導(dǎo)PPH上清液中培養(yǎng)的Huh7.5.1細(xì)胞得到額結(jié)果類似，表明在CCS中通過PPH轉(zhuǎn)導(dǎo)可以得到?jīng)]有復(fù)制能力的組合體LV粒子，該結(jié)論可由圖6分析得到。

10.在密閉培養(yǎng)系統(tǒng)中低溫貯藏轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞

然后我們?cè)u(píng)價(jià)直接在CCS系統(tǒng)中低溫貯藏轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的可能性。在兩個(gè)CCS系統(tǒng)中使用控制LV得到兩個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)PPH個(gè)體。三天后，上清液移除并被低溫貯藏基質(zhì)取代。使用前將CCS裝置直接冷凍并置于-80℃中一個(gè)月。為了證明它們的存活性，解凍的細(xì)胞立即通過皮下注射到免疫缺陷的NMRI nude小鼠體內(nèi)，分別在5小時(shí)、48小時(shí)和6天檢 測生物熒光素活性。如圖7所示，解凍的細(xì)胞熒光素酶活性可以在轉(zhuǎn)移后第6天偵測到，該結(jié)果表明直接在CCS系統(tǒng)中凍結(jié)細(xì)胞的可行性。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料過著特點(diǎn)包含于本實(shí)用新型的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

以上公開的本實(shí)用新型優(yōu)選實(shí)施例只是用于幫助闡述本實(shí)用新型。優(yōu)選實(shí)施例并沒有詳盡敘述所有的細(xì)節(jié)，也不限制該實(shí)用新型僅為所述的具體實(shí)施方式。顯然，根據(jù)本說明書的內(nèi)容，可作很多的修改和變化。本說明書選取并具體描述這些實(shí)施例，是為了更好地解釋本實(shí)用新型的原理和實(shí)際應(yīng)用，從而使所屬技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員能很好地理解和利用本實(shí)用新型。本實(shí)用新型僅受權(quán)利要求書及其全部范圍和等效物的限制。