本發(fā)明屬于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體及其創(chuàng)制方法。

背景技術(shù)：

定點突變是指在目的dna片段的指定位點引入特定的堿基對，從而改變其編碼的氨基酸序列的技術(shù)。它是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的復(fù)雜關(guān)系的強有力的工具，也是實驗室常用的基因改造的手段。對某個已知的基因的特定堿基進行定點改造、缺失、或者插入，可以改變對應(yīng)氨基酸序列和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特征，有助于了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系。

類異戊二烯物質(zhì)存在于所有生物體中，在植物中含量尤其豐富，是維持植物生長發(fā)育、光合作用等所必需的重要有機物質(zhì)，如可作為生長物質(zhì)和植物激素（細胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內(nèi)酯）、光合色素（如葉綠素、類胡蘿卜素）、膜結(jié)構(gòu)的一部分如谷甾醇、電子傳遞受體如質(zhì)體醌、作為葡萄糖基化反應(yīng)中葡萄糖的受體如多萜醇，并能調(diào)控細胞的生長如異戊烯基蛋白。此外，很多植物類異戊二烯還具有重要的商業(yè)價值如橡膠、食物香料、飲料、維生素a、d、e，天然殺蟲劑如除蟲菊素等。類異戊二烯物質(zhì)的生物合成主要由甲羥戊酸途徑中的一系列酶酶促合成的，甲羥戊酸激酶（mvk,mk;atp:mevalonate-5-phosphotransferase;ec2.7.1.36）是該代謝途徑中三個連續(xù)atp依賴酶中的第一個，它將atpγ位上的一個磷酸基團轉(zhuǎn)移到甲羥戊酸第5位的羥基上形成甲羥戊酸-5-磷酸，并伴隨著adp的釋放，是控制整個代謝途徑的限速酶之一。目前已分別從擬南芥（arabidopsisthaliana）、水稻（oryzasativa）、玉米（zeamays）、高粱（sorghumbicolor）、橡膠（heveabrasiliensis）、蓖麻（ricinuscommunis）等植物中分離克隆了甲羥戊酸激酶基因，在本發(fā)明申請之前，還沒有公開或發(fā)表過關(guān)于創(chuàng)制小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體、對基因突變體進行原核基因表達、酶蛋白分離純化及其酶活性體外檢測和酶動力學(xué)參數(shù)研究等資料信息。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體及其創(chuàng)制方法。

本發(fā)明的目的是提供小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體及其創(chuàng)制方法，可以高效獲得小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體，便于改善小麥等作物的農(nóng)藝性狀，提高產(chǎn)量，并可以進行分子生物學(xué)的基礎(chǔ)研究。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體創(chuàng)制方法，按照下述方法定點突變而成：將小麥甲羥戊酸激酶tamvk保守區(qū)中與其它植物不同的氨基酸序列對應(yīng)的dna序列定點突變。

優(yōu)選的，小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體創(chuàng)制方法，小麥甲羥戊酸激酶tamvk保守區(qū)中第14a、24a、35q、135v、139g、142m、144a、153s、165l和332n位置氨基酸，分別突變?yōu)?4s、24t、35n、35r、135e、139d、142l、142f、142y、144s、153c、165m和332s。

優(yōu)選的，小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體創(chuàng)制方法，小麥甲羥戊酸激酶tamvk突變體的上下游引物分別為：

a14s:f序列為seqidno.6，a14s:r序列為seqidno.7，密碼子由gcc突變?yōu)閠cc；

a24t:f序列為seqidno.8，a24t:r序列為seqidno.9，密碼子由gcc突變?yōu)閍cc；

q35n:f序列為seqidno.10，q35n:r序列為seqidno.11，密碼子由cag突變?yōu)閍ac；

fq35r:f序列為seqidno.12，fq35r:r序列為seqidno.13，密碼子由cag突變?yōu)閏gg；

v135e:f序列為seqidno.14，v135e:r序列為seqidno.15，密碼子由gtg突變?yōu)間ag；

g139d:f序列為seqidno.16，g139d:r序列為seqidno.17，密碼子由ggc突變?yōu)間ac；

m142l:f序列為seqidno.18，m142l:r序列為seqidno.19，密碼子由atg突變?yōu)閏tg；

m142f:f序列為seqidno.20，m142f:r序列為seqidno.21，密碼子由atg突變?yōu)閠tt；

f142y:f序列為seqidno.22，f142y:r序列為seqidno.23，密碼子由ttt突變?yōu)閠at；

a144s:f序列為seqidno.24，a144s:r序列為seqidno.25，密碼子由gcc突變?yōu)閠cc；

s153c:f序列為seqidno.26，s153c:r序列為seqidno.27，密碼子由tcc突變?yōu)閠gc；

l156m:f序列為seqidno.28，l156m:r序列為seqidno.29，密碼子由ttg突變?yōu)閍tg；

n332s:f序列為seqidno.30，n332s:r序列為seqidno.31，密碼子由aac突變?yōu)閠cc。

本發(fā)明提供了小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體創(chuàng)制方法創(chuàng)制的小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體，小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體tamvk/a14s、tamvk/a24t、tamvk/q35n、tamvk/q35r、tamvk/v135e、tamvk/g139d、tamvk/m142l、tamvk/m142f、tamvk/f142y、tamvk/a144s、tamvk/s153c、tamvk/l165m和tamvk/n332s，分別為所述小麥甲羥戊酸激酶tamvk保守區(qū)中第14a、24a、35q、135v、139g、142m、144a、153s、165l和332n位置氨基酸，分別突變?yōu)?4s、24t、35n、35r、135e、139d、142l、142f、142y、144s、153c、165m和332s。

優(yōu)選的，小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體，所述的小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體tamvk/a14s、tamvk/a24t、tamvk/q35n、tamvk/q35r、tamvk/v135e、tamvk/g139d、tamvk/m142l、tamvk/m142f、tamvk/f142y、tamvk/a144s、tamvk/s153c、tamvk/l165m和tamvk/n332s，上下游引物分別為：

a14s:f序列為seqidno.6，a14s:r序列為seqidno.7，密碼子由gcc突變?yōu)閠cc；

a24t:f序列為seqidno.8，a24t:r序列為seqidno.9，密碼子由gcc突變?yōu)閍cc；

q35n:f序列為seqidno.10，q35n:r序列為seqidno.11，密碼子由cag突變?yōu)閍ac；

fq35r:f序列為seqidno.12，fq35r:r序列為seqidno.13，密碼子由cag突變?yōu)閏gg；

v135e:f序列為seqidno.14，v135e:r序列為seqidno.15，密碼子由gtg突變?yōu)間ag；

g139d:f序列為seqidno.16，g139d:r序列為seqidno.17，密碼子由ggc突變?yōu)間ac；

m142l:f序列為seqidno.18，m142l:r序列為seqidno.19，密碼子由atg突變?yōu)閏tg；

m142f:f序列為seqidno.20，m142f:r序列為seqidno.21，密碼子由atg突變?yōu)閠tt；

f142y:f序列為seqidno.22，f142y:r序列為seqidno.23，密碼子由ttt突變?yōu)閠at；

a144s:f序列為seqidno.24，a144s:r序列為seqidno.25，密碼子由gcc突變?yōu)閠cc；

s153c:f序列為seqidno.26，s153c:r序列為seqidno.27，密碼子由tcc突變?yōu)閠gc；

l156m:f序列為seqidno.28，l156m:r序列為seqidno.29，密碼子由ttg突變?yōu)閍tg；

n332s:f序列為seqidno.30，n332s:r序列為seqidno.31，密碼子由aac突變?yōu)閠cc。

小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體的應(yīng)用，其特征在于：小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體在改變甲羥戊酸激酶基因在小麥等作物及其它植物中表達，改變次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量、改善籽粒大小、粒重農(nóng)藝性狀的應(yīng)用；以及對小麥甲羥戊酸激酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)研究，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標記的應(yīng)用。

本法的有益之處如下：

本發(fā)明通過改變小麥甲羥戊酸激酶基因tamvk中特定氨基酸密碼子來提高或降低其編碼酶的催化活性，為進一步進行基因改造和修飾、構(gòu)建甲羥戊酸激酶基因的真核生物基因表達載體并轉(zhuǎn)化相應(yīng)作物，尤其是靠次生代謝獲取重要商業(yè)價值的植物，探討甲羥戊酸激酶基因在受體植物中的過量表達與次生代謝產(chǎn)物、作物籽粒大小及粒重等重要農(nóng)藝性狀的關(guān)系，進而提高農(nóng)作物產(chǎn)量，以及對甲羥戊酸激酶基因內(nèi)含子、外顯子及啟動子結(jié)構(gòu)進行剖析，研究啟動子功能、開發(fā)有關(guān)分子標記等提供重要技術(shù)儲備。

本發(fā)明從克隆的小麥品種“濟麥22”的野生型甲羥戊酸激酶基因，創(chuàng)制了小麥甲羥戊酸激酶基因tamvk的13個基因突變體，分別為tamvk/a14s、tamvk/a24t、tamvk/q35n、tamvk/q35r、tamvk/v135e、tamvk/g139d、tamvk/m142l、tamvk/m142f、tamvk/f142y、tamvk/a144s、tamvk/s153c、tamvk/l165m和tamvk/n332s，并獲得了相關(guān)酶對底物mva（甲羥戊酸）和atp的酶動力學(xué)參數(shù)，證明通過對小麥甲羥戊酸激酶基因特定氨基酸密碼子的改變，能夠顯著提高或降低酶的催化活性。

附圖說明

圖1是小麥甲羥戊酸激酶的分離純化(43kd)電泳圖，其中1為蛋白沉淀，2為蛋白上清，3-7為洗脫的蛋白，marker為蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準。

圖2是小麥甲羥戊酸激酶基因tamvk突變體蛋白的分離純化電泳圖，其中1為a14s，2為a24t，3為g139d，4為s153c，5為m142l，6為m142f，6-1為f142y，7為a144s，8為q35n，9為q35r，10為v135e，11為l156m，12為n332s，mvk為野生型蛋白。

具體實施方式

下面通過具體的實施例對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進一步的詳細說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的技術(shù)范圍。

實施例1小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體及其創(chuàng)制方法

一、實驗方法

步驟1小麥甲羥戊酸激酶基因tamvk擴增

步驟1.1設(shè)計引物序列：

mvkf（seqidno.1）:

5′gaggatcgcatcatcaccaccatcacgagatccgcgcccgcgcgcccggc3′

mvkr（seqidno.2）:

5′ctgcagaagcttttatccttggtgaatctgaagaccttg3′

步驟1.2小麥tamvk基因全長系列擴增

pcr反應(yīng)體系為20μl，組分如下：

mvkf1μl

mvkr1μl

5×fastpfubuffer4μl

2.5mmdntp2μl

濟麥22cdna1μl

fastpfudnapolymerase0.4μl

ddh2o10.6μl

pcr程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，58℃退火30sec，72℃

延伸1.5min，共34個循環(huán)，72℃延伸10min，16℃保溫。

步驟1.3擴增產(chǎn)物的回收

（1）吸附柱cb2中（吸附柱放入收集管中）加入450μl平衡液bl，13,000rpm(~13,400×g)離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。（使用當天處理過的柱子）。

（2）將單一的目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下（盡量切除多余部分）放入干凈的離心管中，稱取重量。

（3）向膠塊中加入等倍體積溶液pc（如果凝膠重為0.1g，其體積可視為100μl，則加入100μlpc溶液），50℃水浴放置10min左右，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。

（4）將上一步所得溶液加入一個吸附柱cb2中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm(~13,400×g)離心1min，倒掉收集管中廢液，將吸附柱cb2放入收集管中。

（5）向吸附柱cb2中加入600μl漂洗液pw（使用前先檢查是否已加入無水乙醇），13,000rpm(~13,400×g)離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cb2放入收集管中。

（6）重復(fù)操作步驟5。

（7）將吸附柱cb2放入收集管中，13,000rpm(~13,400×g)離心2min，盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。

（8）將吸附柱cb2放入一個干凈離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液eb，室溫放置2min。13,000rpm(~13,400×g)離心2min，收集dna溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟1.4pcr產(chǎn)物的連接與轉(zhuǎn)化

根據(jù)回收片段的濃度，確定產(chǎn)物和peasy-bluntsimplecloningvector之間的比例。連接轉(zhuǎn)化步驟如下：

（1）在200μl的ep管中加入4μl回收dna產(chǎn)物和1μl載體輕輕混勻。

（2）25℃孵育10min，后置于冰上。

（3）加連接產(chǎn)物于50μle.colidh5α感受態(tài)細胞中（在感受態(tài)細胞剛剛解凍時加入連接產(chǎn)物），輕彈混勻，冰浴20-30min。

（4）42℃熱激90秒，立即置于冰上2min。

（5）加1ml無抗生素的lb培養(yǎng)基，160rpm，37℃孵育1h。

（6）6000rpm離心3min，棄掉部分上清，保留100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板，37℃培養(yǎng)過夜。

步驟1.5陽性克隆子的鑒定

配制菌體pcr體系20μl，組分如下：

m13f1μl

m13r1μl

easytaqmix10μl

h2o8μl

選取邊緣清晰、飽滿圓滑的10個克隆菌落，挑于1mllb培養(yǎng)基中，做好編號，對應(yīng)點入pcr體系中。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性10min（裂解細胞，失活核酸酶），94℃變性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃后延伸10min，16℃保溫。

步驟2小麥tamvk基因全長開放閱讀框的原核表達

步驟2.1設(shè)計表達引物

plm1f1（seqidno.3）:

5′cgcgcggtaccaggaggaatttaaaatgagaggatcgcatcatcacc3′

plm1f2（seqidno.4）:

5′gaggatcgcatcatcaccaccatcacgagatccgcgcccgcgcgcccggc3′

plm1r（seqidno.5）:

5′ctgcagaagcttttatccttggtgaatctgaagaccttg3′

步驟2.2tamvk開放閱讀框序列的擴增

以連接于質(zhì)粒peasy-bluntsimplecloningvector上的全長序列為模板進行pcr擴增，需要兩輪pcr。

第一輪pcr

20μlpcr體系，組分如下：

plm1f21μl

plm1r1μl

5×fastpfubuffer4μl

2.5mmdntp2μl

質(zhì)粒1μl

fastpfudnapolymerase0.4μl

ddh2o10.6μl

pcr程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min，共10個循環(huán)，72℃延伸10min，16℃保溫。

第二輪pcr

20μlpcr體系，組分如下：

plm1f10.8μl

plm1r0.8μl

5×fastpfubuffer4μl

2.5mmdntp2μl

第一輪pcr產(chǎn)物1μl

fastpfudnapolymerase0.4μl

ddh2o11μl

pcr程序為95℃預(yù)變性5min，95℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1.5min，共35個循環(huán)，72℃延伸10min，16℃保溫。

步驟2.3切膠回收目的條帶，酶切回收產(chǎn)物和表達質(zhì)粒

酶切體系如下：

表達質(zhì)粒plm1酶切體系15μl

kpn10.75μl

hindiii0.75μl

10×greenbuffer1.5μl

plm110μl

ddh2o2μl

tamvk全長序列pcr擴增產(chǎn)物酶切體系20μl

kpn11μl

hindiii1μl

10×greenbuffer2μl

pcr產(chǎn)物12μl

h2o4μ

步驟2.4連接構(gòu)建表達載體plm1-tamvk

根據(jù)酶切后回收片段的濃度，確定產(chǎn)物和plm1載體之間的比例，連接體系如下：

plm14μl

回收pcr酶切產(chǎn)物4μl

10×buffer1μl

t4dnaligase1μl

于16℃連接過夜。

步驟2.5plm1-tamvk對e.colidh5α感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化

選取陽性克隆提取質(zhì)粒并測序鑒定。

步驟2.6plm1-tamvk重組質(zhì)粒對e.colibl21表達感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化

選取測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化e.colibl21表達感受態(tài)細胞。

步驟2.7表達細胞e.colibl21的擴大培養(yǎng)及誘導(dǎo)tamvk表達

（1）轉(zhuǎn)化進plm1-tamvk重組質(zhì)粒的e.colibl21菌種接種到20ml的lb培養(yǎng)基(amp濃度為100mg/ml)中，37℃、160rpm過夜培養(yǎng)。

（2）取5ml過夜培養(yǎng)的菌液加到500mllb培養(yǎng)液中(amp濃度100mg/ml)。37℃、160rpm搖床培養(yǎng)1.5h至菌體od600=0.8時，加入iptg(終濃度為1.5mm)。

（3）28℃過夜培養(yǎng)。

（4）6000r/min離心10min，收集菌體用100ml去離子水沖洗菌體，6000r/min離心10min，收集菌體。

步驟2.8酶蛋白的分離純化

（1）加入40ml起始緩沖液（startbuffer）重懸菌體。

（2）加入5mg溶菌酶，37℃水浴lh。

（3）于-80℃放置至少lh。

（4）30℃水浴解凍。

（5）超聲破碎細胞1h(破碎5s，間隔10s)。

（6）9000r離心10min，上清液用于蛋白純化。

（7）ni-trap柱與0.45μm的過濾器連接好，注射器吸取5ml滅菌水注入柱中一滴一滴地排除柱內(nèi)的乙醇。

（8）再取3-5ml的0.1m硫酸鎳注入柱中，用5ml去離子水洗掉沒有結(jié)合的鎳離子，然后用5ml的起始緩沖液（startbuffer）平衡。

（9）取20ml離心后的上清液注入柱中。

（10）用5ml起始緩沖液（startbuffer）洗柱。

（11）用8ml沖洗緩沖液（washbuffer）洗柱。

（12）用5ml的洗脫緩沖液（elutionbuffer）溶解目的蛋白，并用1.5ml離心管接樣，每0.5ml一管。

步驟2.9sds-page電泳檢測蛋白質(zhì)

（1）分離膠配制：

去離子水2.5ml

30%arc-bis母液3.35ml

1.5mtris-hcl（ph8.8）2ml

10%sds80μl

10%ap80μl

temed3.5μl

（2）濃縮膠配制：

去離子水1.7ml

30%arc-bis母液420μl

1mtris-hcl（ph6.7）320μl

10%sds25μl

10%ap25μl

temed3μl

（3）蛋白樣品與2×sds上樣緩沖液1:1混合，100℃煮沸5min。超聲離心后的沉淀，加入2ml8m/l尿素溶解，加入等體積上樣緩沖液，100℃煮沸5min。

（4）配制分離膠8ml，加入temed后用1ml移液器混勻（注意不要吹起氣泡），迅速在兩玻璃板的間隙中灌注分離膠，然后在其上加1-2ml去離子水，預(yù)留出灌注濃縮膠所需的空間，大約1.0cm；分離膠聚合完全后，傾出覆蓋層液體，用去離子水洗滌凝膠頂部數(shù)次，以除去未聚合的丙烯酰胺凝膠。

（5）配制濃縮膠2.5ml，加入temed后混合均勻，在分離膠上灌注濃縮膠，插入干凈的梳子；聚合完全后，把凝膠固定于電泳裝置，上、下槽各加入tris-甘氨酸電泳緩沖液，排除玻璃板之間的氣泡，小心拔除梳子。

（6）按預(yù)定的次序加入準備好的樣品。80v恒壓，指示劑至分離膠時，電壓調(diào)至120v，待指示劑移至底部時停止電泳。

（7）取出凝膠，加入新鮮考馬斯亮藍染液，用約5倍體積的染液浸泡凝膠，放在平緩搖動的平臺上，于室溫染色2h。

（8）移出并回收染液以備后用，將凝膠浸泡于脫色液中，平緩搖動4-8h，其間應(yīng)更換脫色液3-4次。

步驟2.10酶蛋白的透析

純化的酶蛋白置于透析袋中，用封口夾夾住透析袋兩頭，在大燒杯中加入適量蛋白透析液（保證透析袋能夠懸浮起來），放入轉(zhuǎn)子，置于磁力攪拌器上4℃透析20h，控制轉(zhuǎn)子旋轉(zhuǎn)速度不要太快，中間更換透析液3次。收集透析后的蛋白，放于-80℃超低溫冰箱備用。

步驟3小麥甲羥戊酸激酶基因tamvk密碼子的定點突變

步驟3.1密碼子突變引物的設(shè)計

由氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，小麥甲羥戊酸激酶tamvk保守區(qū)中第14a、24a、35q、135v、139g、142m、144a、153s、165l和332n等位置氨基酸與其它植物不同，為探討這些氨基酸殘基對酶催化活性的影響，將其分別突變?yōu)?4s、24t、35n、35r、135e、139d、142l、142f、142y、144s、153c、165m和332s。

突變體的上下游引物分別為：

a14s:f（seqidno.6）:gcaagatcatcctctccggcgagcacgccgtcg;

a14s:r（seqidno.7）:cgacggcgtgctcgccggagaggatgatcttgc；

密碼子由gcc突變?yōu)閠cc。

a24t:f（seqidno.8）:cgtccacggctctaccgccgtcgccgccgcc；

a24t:r（seqidno.9）:ggcggcggcgacggcggtagagccgtggacg；

密碼子由gcc突變?yōu)閍cc。

q35n:f（seqidno.10）:cgacctctacacgaactcctccctccacctg；

q35n:r（seqidno.11）:caggtggagggaggagttcgtgtagaggtcg；

密碼子由cag突變?yōu)閍ac。

fq35r:f（seqidno.12）:cgacctctacacgcggtcctccctccacctg；

fq35r:r（seqidno.13）:caggtggagggaggaccgcgtgtagaggtcg；

密碼子由cag突變?yōu)閏gg。

v135e:f（seqidno.14）:ggcctgggaaggtcgaggtgagctctggcctg；

v135e:r（seqidno.15）:caggccagagctcacctcgaccttcccaggcc；

密碼子由gtg突變?yōu)間ag。

g139d:f（seqidno.16）：ggtgagctctgacctgccgatgggc；

g139d:r（seqidno.17）：gcccatcggcaggtcagagctcacc；

密碼子由ggc突變?yōu)間ac。

m142l:f（seqidno.18）:gctctggcctgccgctgggcgccgggcttggc；

m142l:r（seqidno.19）:gccaagcccggcgcccagcggcaggccagagc；

密碼子由atg突變?yōu)閏tg。

m142f:f（seqidno.20）:gctctggcctgccgtttggcgccgggcttggc；

m142f:r（seqidno.21）:gccaagcccggcgccaaacggcaggccagagc；

密碼子由atg突變?yōu)閠tt。

f142y:f（seqidno.22）:gctctggcctgccgtatggcgccgggcttggc；

f142y:r（seqidno.23）:gccaagcccggcgccatacggcaggccagagc；

密碼子由ttt突變?yōu)閠at。

a144s:f（seqidno.24）:cctgccgatgggctccgggcttggctcgtcg；

a144s:r（seqidno.25）:cgacgagccaagcccggagcccatcggcagg；

密碼子由gcc突變?yōu)閠cc。

s153c:f（seqidno.26）：cggctgcgttctgcgcgtcgttg；

s153c:r（seqidno.27）：caacgacgcgcagaacgcagccg；

密碼子由tcc突變?yōu)閠gc。

l156m:f（seqidno.28）:cgttctccgtgtcgatgtcgggcgcgctgc；

l156m:r（seqidno.29）:gcagcgcgcccgacatcgacacggagaacg；

密碼子由ttg突變?yōu)閍tg。

n332s:f（seqidno.30）:cgacattgaagtattccttggtctcgaagctc；

n332s:r（seqidno.31）:gagcttcgagaccaaggaatacttcaatgtcg；

密碼子由aac突變?yōu)閠cc。

步驟3.2基因突變體的pcr擴增

以構(gòu)建的小麥甲羥戊酸激酶基因tamvk載體質(zhì)粒plm1-tamvk為dna模板，利用各個基因突變體引物，分兩步分別進行pcr擴增，獲得上、下游pcr產(chǎn)物。

pcr反應(yīng)體系：pcr反應(yīng)體系：

plm1-tamvk1μlplm1-tamvk1μl

plm1-f11μlplm1-r1μl

突變體引物下游1μl變體引物上游1μl

5×fastpfubuffer4μl5×fastpfubuffer4μl

2.5mmdntp2μl2.5mmdntp2μl

fastpfudnapolymerase0.4μlfastpfudnapolymerase0.4μl

ddh2o10.6μlddh2o10.6μl

pcr反應(yīng)條件：

94℃5min

94℃30s

60℃30s

72℃1min

72℃10min

反應(yīng)30個循環(huán)，16℃保溫。

獲得上下游產(chǎn)物，切膠回收。然后，再進行pcr擴增，反應(yīng)體系及反應(yīng)過程如下。

pcr反應(yīng)體系：

上游pcr產(chǎn)物1μl

下游pcr產(chǎn)物1μl

5×fastpfubuffer4μl

2.5mmdntp2μl

fastpfudnapolymerase0.6μl

ddh2o8.6μl

pcr反應(yīng)條件：

94℃5min

94℃30s

47℃30s

72℃1.5min

反應(yīng)5個循環(huán)。

然后加上下游突變引物各1μl，加fastpfu0.2μl，進行pcr擴增。

pcr反應(yīng)條件：

94℃5min

94℃30s

58℃30s

72℃1.5min

72℃10min

反應(yīng)34個循環(huán)，于16℃，保溫。

步驟3.3獲得突變體產(chǎn)物，進行酶切連接。

同步驟2.4。

步驟3.4轉(zhuǎn)化和陽性克隆鑒定

同步驟2.6。

步驟3.5突變體蛋白表達、純化、電泳檢測和透析

同步驟2.7、2.8、2.9、2.10。

步驟4小麥甲羥戊酸激酶tamvk及其突變體的酶動力學(xué)參數(shù)測定

小麥甲羥戊酸激酶動力學(xué)參數(shù)的測定，采用丙酮酸激酶與乳酸脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng)的方法進行，具體如下。

在一次性德國brand塑料比色皿中依次加入下列試劑，使反應(yīng)終體積1ml。

0.1m磷酸鉀緩沖液（ph7.6），

0.16mmnadh，

5mmmgcl2，

4mmatp，

3mm甲羥戊酸，

0.5mm磷酸烯醇式丙酮酸，

10u丙酮酸激酶，

10u乳酸脫氫酶，

加入一定量的甲羥戊酸激酶啟動反應(yīng)，

用h2o補充至體積1ml，

測定340nm波長下nadh被氧化時光吸收變化，獲得反應(yīng)斜率。首先測定背景氧化2min，加入酶后立即測定50sec。如果酶活性較強，則340nm波長下光吸收值下降速度較快，反之，則酶活性較弱。以甲羥戊酸濃度為梯度改變，測定酶活性，獲得酶對底物甲羥戊酸的動力學(xué)參數(shù)；以atp濃度為梯度改變，測定酶活性，獲得酶對底物atp的動力學(xué)參數(shù)。

二、實驗結(jié)果

（一）小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因編碼區(qū)序列

以小麥品種濟麥22的cdna為模板擴增，獲得了長度為1167bp的小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因的編碼區(qū)序列，可編碼388個氨基酸殘基。

野生型小麥tamvk基因編碼區(qū)dna序列（seqidno.32）：

atggagatccgcgcccgcgcgcccggcaagatcatcctcgccggcgagcacgccgtcgtccacggctctgccgccgtcgccgccgccatcgacctctacacgcagtcctccctccacctgcccccctcaggtgagggcggcgccggcgaagtggaggttgacctgacggactcgggcctcgccttctcctggccatgctcgcgcctcctcgaggcgctgggggagacctcccgcaaggcggagctgcaggccccgaggccctgctccccggaggagctggccgccattgccaggctcgtggagctgcacgagatacccgaggccaagatctggctctccgccggcctctccgcgttcctctacctctacacctccatcctggggtgtaggcctgggaaggtcgtggtgagctctggcctgccgatgggcgccgggcttggctcgtcggctgcgttctccgtgtcgttgtcgggcgcgctgctgacagcggcaggtgtggtttctgctgagggcgccgttggcggaacggagtggcagttgttggggaaggatcatcttgagctggttaacacgtgggcgttccagggggaaaagattattcatggcaagccttctggcattgataacgctgtcagcacttttggaagcatgatcaaattcaagaagggagaattgacgaacctcaaatctggcaatccagtcaaaatgctcattactgatacaagggttggtaggaacaccaaggctctggttgctggtgtgtctgaaagagcatctaggcatcccgatgctatggcttccgtcttccatgcagtcaacactattagtgaagagctttccagcattgttgagttagctgctactgatgagatagccatgacctcaaaggaagaaaagctagcagaactcatggagatgaaccaaggtttgctccagtgcatgggagtcagtcatgcttctatagaaaccgtgctgcgctcgacattgaagtataacttggtctcgaagctcaccggagctggtggtggaggctgtgttttgacgttgataccaactctattgtccaagttagttttggagaaggtcaccacggagctagaatcgcatggtttccgctgcttcaaagtcgaggtcggtggacaaggtcttcagattcaccaaggataa

野生型小麥tamvk的氨基酸序列（seqidno.33）：

meirarapgkiilagehavvhgsaavaaaidlytqsslhlppsgeggagevevdltdsglafswpcsrllealgetsrkaelqaprpcspeelaaiarlvelheipeakiwlsaglsaflylytsilgcrpgkvvvssglpmgaglgssaafsvslsgalltaagvvsaegavggtewqllgkdhlelvntwafqgekiihgkpsgidnavstfgsmikfkkgeltnlksgnpvkmlitdtrvgrntkalvagvserasrhpdamasvfhavntiseelssivelaatdeiamtskeeklaelmemnqgllqcmgvshasietvlrstlkynlvskltgaggggcvltliptllsklvlekvtteleshgfrcfkvevggqglqihqg

（二）小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體的創(chuàng)制及蛋白質(zhì)表達純化

根據(jù)設(shè)計的小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體引物，獲得了tamvk/a14s、tamvk/a24t、tamvk/q35n、tamvk/q35r、tamvk/v135e、tamvk/g139d、tamvk/m142l、tamvk/m142f、tamvk/f142y、tamvk/a144s、tamvk/s153c、tamvk/l165m和tamvk/n332s等13個基因突變體。蛋白質(zhì)表達、純化結(jié)果表明，所獲得的基因突變體蛋白是可溶的，而且純度較高（圖1、圖2）。

（三）小麥甲羥戊酸激酶野生型及突變體的酶動力學(xué)參數(shù)

實驗獲得了小麥品種“濟麥22”甲羥戊酸激酶野生型及13個基因突變體酶蛋白對底物甲羥戊酸（mva）和atp的酶動力學(xué)參數(shù)（表1）。結(jié)果表明，通過改變小麥甲羥戊酸激酶基因編碼氨基酸的密碼子，能夠顯著提高或降低小麥甲羥戊酸激酶的催化活性。對底物mva而言，突變體tamvk/a14s、tamvk/v135e和tamvk/g139d的最大反應(yīng)速率較高，分別比野生型提高了1.39、1.14和1.07倍，而tamvk/f142y的最大反應(yīng)速率最低，比野生型降低了0.57倍；tamvk/a14s的km值最大，比野生型提高了1.91倍，而tamvk/q35r的km值最小，比野生型降低了1.46倍。對底物atp而言，突變體tamvk/a14s的最大反應(yīng)速率也是最高的，比野生型提高了1.50倍，而tamvk/f142y的最大反應(yīng)速率也是最低的，比野生型降低了0.36倍；tamvk/f142y和tamvk/m142f的km值較大，分別比野生型提高了2.15和2.12倍，而tamvk/q35n的km值最小，比野生型降低了0.61倍。

表1小麥tamvk野生型及其突變體酶動力學(xué)參數(shù)

以上所述僅是本專利的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本專利技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和替換，這些改進和替換也應(yīng)視為本專利的保護范圍。

sequencelisting

<110>山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所

<120>小麥甲羥戊酸激酶tamvk基因突變體及其創(chuàng)制方法

<130>2017

<160>33

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gaggatcgcatcatcaccaccatcacgagatccgcgcccgcgcgcccggc50

<210>2

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

ctgcagaagcttttatccttggtgaatctgaagaccttg39

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgcgcggtaccaggaggaatttaaaatgagaggatcgcatcatcacc47

<210>4

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gaggatcgcatcatcaccaccatcacgagatccgcgcccgcgcgcccggc50

<210>5

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ctgcagaagcttttatccttggtgaatctgaagaccttg39

<210>6

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gcaagatcatcctctccggcgagcacgccgtcg33

<210>7

<211>33

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

cgacggcgtgctcgccggagaggatgatcttgc33

<210>8

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cgtccacggctctaccgccgtcgccgccgcc31

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

ggcggcggcgacggcggtagagccgtggacg31

<210>10

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

cgacctctacacgaactcctccctccacctg31

<210>11

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

caggtggagggaggagttcgtgtagaggtcg31

<210>12

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

cgacctctacacgcggtcctccctccacctg31

<210>13

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

caggtggagggaggaccgcgtgtagaggtcg31

<210>14

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ggcctgggaaggtcgaggtgagctctggcctg32

<210>15

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

caggccagagctcacctcgaccttcccaggcc32

<210>16

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

ggtgagctctggcctgccgatgggc25

<210>17

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

gcccatcggcaggccagagctcacc25

<210>18

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gctctggcctgccgctgggcgccgggcttggc32

<210>19

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

gccaagcccggcgcccagcggcaggccagagc32

<210>20

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

gctctggcctgccgtttggcgccgggcttggc32

<210>21

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

gccaagcccggcgccaaacggcaggccagagc32

<210>22

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

gctctggcctgccgtatggcgccgggcttggc32

<210>23

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

gccaagcccggcgccatacggcaggccagagc32

<210>24

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

cctgccgatgggctccgggcttggctcgtcg31

<210>25

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

cgacgagccaagcccggagcccatcggcagg31

<210>26

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

cggctgcgttctccgcgtcgttg23

<210>27

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

caacgacgcggagaacgcagccg23

<210>28

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

cgttctccgtgtcgatgtcgggcgcgctgc30

<210>29

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

gcagcgcgcccgacatcgacacggagaacg30

<210>30

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

cgacattgaagtattccttggtctcgaagctc32

<210>31

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

gagcttcgagaccaaggaatacttcaatgtcg32

<210>32

<211>1167

<212>dna

<213>小麥（triticumaestivuml.）

<400>32

atggagatccgcgcccgcgcgcccggcaagatcatcctcgccggcgagcacgccgtcgtc60

cacggctctgccgccgtcgccgccgccatcgacctctacacgcagtcctccctccacctg120

cccccctcaggtgagggcggcgccggcgaagtggaggttgacctgacggactcgggcctc180

gccttctcctggccatgctcgcgcctcctcgaggcgctgggggagacctcccgcaaggcg240

gagctgcaggccccgaggccctgctccccggaggagctggccgccattgccaggctcgtg300

gagctgcacgagatacccgaggccaagatctggctctccgccggcctctccgcgttcctc360

tacctctacacctccatcctggggtgtaggcctgggaaggtcgtggtgagctctggcctg420

ccgatgggcgccgggcttggctcgtcggctgcgttctccgtgtcgttgtcgggcgcgctg480

ctgacagcggcaggtgtggtttctgctgagggcgccgttggcggaacggagtggcagttg540

ttggggaaggatcatcttgagctggttaacacgtgggcgttccagggggaaaagattatt600

catggcaagccttctggcattgataacgctgtcagcacttttggaagcatgatcaaattc660

aagaagggagaattgacgaacctcaaatctggcaatccagtcaaaatgctcattactgat720

acaagggttggtaggaacaccaaggctctggttgctggtgtgtctgaaagagcatctagg780

catcccgatgctatggcttccgtcttccatgcagtcaacactattagtgaagagctttcc840

agcattgttgagttagctgctactgatgagatagccatgacctcaaaggaagaaaagcta900

gcagaactcatggagatgaaccaaggtttgctccagtgcatgggagtcagtcatgcttct960

atagaaaccgtgctgcgctcgacattgaagtataacttggtctcgaagctcaccggagct1020

ggtggtggaggctgtgttttgacgttgataccaactctattgtccaagttagttttggag1080

aaggtcaccacggagctagaatcgcatggtttccgctgcttcaaagtcgaggtcggtgga1140

caaggtcttcagattcaccaaggataa1167

<210>33

<211>388

<212>prt

<213>小麥（triticumaestivuml.）

<400>33

metgluileargalaargalaproglylysileileleualaglyglu

151015

hisalavalvalhisglyseralaalavalalaalaalaileaspleu

202530

tyrthrglnserserleuhisleuproproserglygluglyglyala

354045

glygluvalgluvalaspleuthraspserglyleualaphesertrp

505560

procysserargleuleuglualaleuglygluthrserarglysala

65707580

gluleuglnalaproargprocysserproglugluleualaalaile

859095

alaargleuvalgluleuhisgluileproglualalysiletrpleu

100105110

seralaglyleuseralapheleutyrleutyrthrserileleugly

115120125

cysargproglylysvalvalvalserserglyleuprometglyala

130135140

glyleuglyserseralaalapheservalserleuserglyalaleu

145150155160

leuthralaalaglyvalvalseralagluglyalavalglyglythr

165170175

glutrpglnleuleuglylysasphisleugluleuvalasnthrtrp

180185190

alapheglnglyglulysileilehisglylysproserglyileasp

195200205

asnalavalserthrpheglysermetilelysphelyslysglyglu

210215220

leuthrasnleulysserglyasnprovallysmetleuilethrasp

225230235240

thrargvalglyargasnthrlysalaleuvalalaglyvalserglu

245250255

argalaserarghisproaspalametalaservalphehisalaval

260265270

asnthrileserglugluleuserserilevalgluleualaalathr

275280285

aspgluilealametthrserlysgluglulysleualagluleumet

290295300

glumetasnglnglyleuleuglncysmetglyvalserhisalaser

305310315320

ilegluthrvalleuargserthrleulystyrasnleuvalserlys

325330335

leuthrglyalaglyglyglyglycysvalleuthrleuileprothr

340345350

leuleuserlysleuvalleuglulysvalthrthrgluleugluser

355360365

hisglypheargcysphelysvalgluvalglyglyglnglyleugln

370375380

ilehisglngly

385