雄性育性的保持方法及其應(yīng)用與流程

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本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及植物隱性核雄性不育基因的克隆，及其雄性不育系的繁殖方法和在雜交育種中的應(yīng)用，更具體地涉及一個(gè)小麥隱性核雄性不育基因及其啟動(dòng)子的克隆，及其在雜交育種中的應(yīng)用。

技術(shù)背景

雜種優(yōu)勢(shì)是生物界的普遍現(xiàn)象，雜交種育種是選育新品種的主要途徑，是近代育種工作最重要方法。與水稻、玉米、高粱等相比，小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用的研究相對(duì)滯后，近十年來(lái)其平均產(chǎn)量的增長(zhǎng)也趨于停滯、甚至出現(xiàn)連續(xù)多年下滑的局面。小麥?zhǔn)亲曰ㄊ诜圩魑铮←滊s種優(yōu)勢(shì)利用的核心問(wèn)題是高效生產(chǎn)小麥雜交種的技術(shù)體系，國(guó)內(nèi)外大量科學(xué)家為此已做出巨大的努力，并取得一系列重要成果。綜合近50年來(lái)的研究進(jìn)展，小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用研究主要集中于：核質(zhì)互作雄性不育的利用(“三系法”)、化學(xué)殺雄技術(shù)的利用(“化殺法”)和光溫敏核雄性不育的利用(“兩系法”)。三系法由于不育系難以繁殖、恢復(fù)源較窄、細(xì)胞質(zhì)副效應(yīng)等原因，未能在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用?；瘹⒎ū荛_(kāi)了恢復(fù)與保持間的相互關(guān)系，曾被認(rèn)為是一種很有希望的小麥雜交制種新技術(shù)，但由于其在制種過(guò)程中穩(wěn)定性差、制種成本高及環(huán)境污染等多方面原因，在實(shí)際生產(chǎn)上也難以推廣利用?；诠鉁孛舻膬上捣m然具有制種成本低、恢復(fù)源廣泛，較易獲得優(yōu)勢(shì)組合等優(yōu)點(diǎn)，但也面臨著兩大關(guān)鍵問(wèn)題——環(huán)境因素的不穩(wěn)定性對(duì)不育系育性的影響和利用光溫敏特性所選育的小麥不育系十分有限。

隱性核雄性不育突變體用于作物雜種優(yōu)勢(shì)利用，其不育性具有易被恢復(fù)而不易被保持的特性。與細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜交小麥體系相比，隱性核雄性不育突變體用于雜交小麥開(kāi)發(fā)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)不存在外源細(xì)胞質(zhì)的負(fù)面影響，雜種f1優(yōu)勢(shì)強(qiáng)；2)父本系對(duì)雜種f1的育性恢復(fù)度高；3)不育系、保持系、父本系的育種親本材料選擇不受特定恢/保關(guān)系的限制，選材范圍極廣、種質(zhì)資源利用率高，有利于選育高配合力的雜交種。但是，按照常規(guī)方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)純合核不育系種子的大量有效生產(chǎn)。因此，針對(duì)小麥雜種優(yōu)勢(shì)利用的現(xiàn)狀，建立高效小麥雄性不育繁育新體系，是雜交小麥獲得成功應(yīng)用的最關(guān)鍵因素之一。

小麥顯性核雄性不育系由于其自身的遺傳特點(diǎn)，既找不到完全的恢復(fù)系，也找不到完全的保持系，比如1972年在我國(guó)發(fā)現(xiàn)的太谷核不育系(即ms2)，因此只適用于常規(guī)育種輪回選擇和回交育種手段，不能用作雜交小麥育種的親本。而隱性核雄性不育材料與任何正常材料雜交，f1代均可育，任何育性正常的材料都是其恢復(fù)系，只要解決核不育性的標(biāo)識(shí)和有效保持的問(wèn)題，就能應(yīng)用于新一代小麥雜交育種技術(shù)。

小麥基因組巨大(17gb)，約是人類的5倍，水稻的40倍，擬南芥的100倍；組成極其復(fù)雜，由a、b、d三個(gè)具有部分同源關(guān)系的染色體組組成，每個(gè)染色體組由7對(duì)染色體構(gòu)成，共有21對(duì)染色體，是典型的異源六倍體(zhangzb,etal.,2002)，并且約75％是簡(jiǎn)單重復(fù)序列(rachelb,etal.,2012；iwgsc,2014)。近年來(lái)，雖然小麥及其近緣種的基因組測(cè)序工作取得了很大進(jìn)展，但截至目前，仍然沒(méi)有完整的參考基因組序列公布(vogeljp,etal.,2010；theinternationalbarleygenomesequencingconsortium,2012；rachelb,etal.,2012；linghq,etal.,2013；jiaj,etal.,2013；iwgsc,2014)。如此復(fù)雜的基因組使得小麥功能基因的研究工作異常困難，目前為止國(guó)際范圍內(nèi)小麥突變體成功克隆基因的例子只有寥寥幾個(gè)。

本發(fā)明通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)和高通量測(cè)序的方法，成功克隆了育性恢復(fù)基因frg1，該基因可以完全恢復(fù)蘭州核雄性不育突變體或其等位突變體的雄性育性，為構(gòu)建新型小麥雜交育種技術(shù)體系奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，為解決小麥現(xiàn)有的“三系”和兩系”雜交技術(shù)所存在不育系育性不穩(wěn)定、雜交品種資源受局限、制種技術(shù)復(fù)雜、制種成本高等技術(shù)瓶頸問(wèn)題，提供了更多的可能性。本發(fā)明所提供的基因及不育系的繁殖和保持方法，對(duì)小麥雜交育種工作具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本文提到的所有參考文獻(xiàn)都通過(guò)引用并入本文。

除非有相反指明，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技術(shù)是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。材料、方法和例子僅作闡述用，而非加以限制。

本發(fā)明提供了一個(gè)育性恢復(fù)基因frg1(fertilityrestorationgene1)，所述育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、

26、27或35所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno：4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補(bǔ)的dna序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，本發(fā)明所述的育性恢復(fù)基因還包括與frg1基因的核苷酸序列或蛋白序列高度同源，并且具有同樣的育性調(diào)控或恢復(fù)功能的同源基因序列。所述高度同源且具有育性調(diào)控功能的的同源基因包括在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與具有seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示序列的dna雜交的dna序列?；蚴瞧渚幋a的氨基酸序列與seqidno:4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的蛋白氨基酸序列具有85％以上相似性的核苷酸序列。本文中使用的“嚴(yán)謹(jǐn)條件”是公知的，包括諸如在含400mmnacl、40mmpipes(ph6.4)和1mmedta的雜交液中于53℃-60℃雜交12-16小時(shí)，然后在62℃-68℃下用含0.5×ssc、和0.1％sds的洗滌液洗滌15-60分鐘。

上述同源基因還包括與seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示序列的全長(zhǎng)有至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％序列相似性，且具有育性調(diào)控功能的dna序列，可以從任何植物中分離獲得。其中，序列相似性的百分比可以通過(guò)公知的生物信息學(xué)算法來(lái)獲得，包括myers和miller算法、needleman-wunsch全局比對(duì)法、smith-waterman局部比對(duì)法、pearson和lipman相似性搜索法、karlin和altschul的算法。這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒含有本發(fā)明所公開(kāi)的育性恢復(fù)基因的dna序列，所述育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno:4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補(bǔ)的dna序列。

具體地，上述表達(dá)盒中的育性恢復(fù)基因還可操作性的連有一個(gè)可驅(qū)動(dòng)其表達(dá)的啟動(dòng)子，所述啟動(dòng)子包括但不限于組成型表達(dá)啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、組織特異表達(dá)啟動(dòng)子、或時(shí)空特異表達(dá)啟動(dòng)子。更具體地，所述啟動(dòng)子是一個(gè)花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子。優(yōu)選地，所述花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的核苷酸序列如seqidno:1所示。

本發(fā)明上述表達(dá)盒，還進(jìn)一步的包含一個(gè)花粉失活基因，所述花粉失活基因可以干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成。所述花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:29所示。

本發(fā)明上述表達(dá)盒，還進(jìn)一步的包含一個(gè)篩選基因，所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株、植物組織細(xì)胞或載體篩選出來(lái)。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種植物育性調(diào)控的方法，所述方法通過(guò)將育性恢復(fù)基因轉(zhuǎn)入到frg1雄性不育突變體，使frg1雄性不育突變體的雄性育性恢復(fù)，其中所述的育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno:4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補(bǔ)的dna序列。

本發(fā)明還提供了一種調(diào)控植物育性的方法，通過(guò)影響育性基因frg1的表達(dá)來(lái)調(diào)控植物的育性。包括但不限于通過(guò)突變frg1基因的方法，獲得frg1雄性不育突變體材料；或是通過(guò)基因互補(bǔ)的方法，將frg1基因用于恢復(fù)由相應(yīng)的frg1基因突變所導(dǎo)致的雄性不育，使雄性不育突變體恢復(fù)成可育。在本發(fā)明中，所述的突變包括在育性調(diào)控基因的核苷酸序列上進(jìn)行取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸。獲得突變的方法包括但不限于物理誘變、化學(xué)誘變或rnai、talen、crispr-cas9等基因編輯方法。

本發(fā)明還包括一種獲得frg1雄性不育突變體的方法，所述方法通過(guò)突變植物內(nèi)源的育性調(diào)控基因frg1，或突變與其高度同源的基因的核苷酸序列，使該植物體喪失雄性育性的過(guò)程。所述育性調(diào)控基因frg1的氨基酸序列如seqidno：4、7、10、13、16、19、22、25或28所示。所述育性調(diào)控基因frg1的核苷酸序列如seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示。所述“突變”包括但不限于以下方法，如用物理或化學(xué)的方法所導(dǎo)致的基因突變，化學(xué)方法包括用ems等誘變劑處理所導(dǎo)致的誘變，所述突變還可以是點(diǎn)突變，也可以是dna缺失或插入突變，也可以是通過(guò)rnai等基因沉默手段或者通過(guò)基因定點(diǎn)突變的方法，所述基因定點(diǎn)突變的方法包括但不限于zfn定點(diǎn)突變方法、talen定點(diǎn)突變方法、和/或crispr/cas9等基因編輯方法。

本發(fā)明還提供了一種frg1突變體材料的應(yīng)用方法，其特征在于所述突變材料是由核苷酸序列的突變所造成，含有該突變后的核苷酸序列的植株具有雄性不育的表型，其中所述核苷酸序列為frg1基因的核苷酸序列，優(yōu)選如seqidno:2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示。所述突變體材料的應(yīng)用，包括但不限于在雜交育種中的應(yīng)用，更具體的是指將frg1突變體植株作為不育系母本，與恢復(fù)系雜交，生產(chǎn)雜交種子。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種雄性不育系的保持方法，所述方法以frg1雄性不育突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至該不育突變體受體植株中。所述3個(gè)目標(biāo)基因分別是育性恢復(fù)基因frg1、花粉失活基因和篩選標(biāo)記基因。其中，育性恢復(fù)基因frg1可使不育的轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有轉(zhuǎn)化的外源基因的花粉失活，即失去授精能力，篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子或組織和非轉(zhuǎn)基因種子或組織的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子用作不育系生產(chǎn)雜交種，轉(zhuǎn)基因種子用作保持系來(lái)源源不斷地、穩(wěn)定地生產(chǎn)不育系。

本發(fā)明中，在小麥植株中所述frg1雄性不育突變體是指蘭州核雄性不育突變體或其等位突變體。本發(fā)明中frg1雄性不育突變體也可以稱為frg1不育系或frg1雄性不育系，在小麥植株中，也可稱為蘭州核雄性不育系、蘭州核不育、或蘭州核雄性不育系的等位不育系等。

上述雄性不育系的保持方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:29所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于pg47啟動(dòng)子、zm13啟動(dòng)子等。所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株或載體篩選出來(lái)。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

更具體地，本發(fā)明還公開(kāi)了一種雄性不育系的繁殖方法，所述方法包括以下步驟：

(a)向frg1雄性不育系中轉(zhuǎn)入下述載體，以獲得含有下述載體的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)frg1雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時(shí)，會(huì)干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的具有活性的雄性配子都是不含所述載體的；和篩選基因，所述篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子或組織和非轉(zhuǎn)基因種子或組織的分揀。

(b)將轉(zhuǎn)入上述載體后形成的保持系植株自交，同時(shí)產(chǎn)生不含載體的frg1雄性不育系和含載體的保持系種子；或是將保持系植株的花粉趕到frg1雄性不育系植株上，使frg1雄性不育系授粉繁殖出frg1雄性不育系的種子。

上述雄性不育系的繁殖方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:29所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于pg47啟動(dòng)子、zm13啟動(dòng)子等。所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株或載體篩選出來(lái)。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種保持系的生產(chǎn)方法，所述方法包括以下步驟:

(a)向frg1雄性不育系中轉(zhuǎn)入下述載體，即獲得了frg1雄性不育系的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)frg1雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時(shí)，會(huì)干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的可育雄性配子都是不含所述載體的；和篩選基因，所述篩選基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀。

上述保持系的生產(chǎn)方法中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:29所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于pg47啟動(dòng)子、zm13啟動(dòng)子等。所述篩選基因可以用于將含有該表達(dá)盒的植株或載體篩選出來(lái)。所述篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、或是抗除草劑基因、或是熒光蛋白基因等。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種保持系的繁殖方法，所述方法包括以下步驟：

(b)將轉(zhuǎn)入上述載體后形成的保持系植株自交，即按1:1的比例繁殖獲得了不含載體的frg1雄性不育系種子和含載體的保持系種子。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種種子的生產(chǎn)方法，所述方法包括：

(a)向frg1雄性不育系中引入下述載體，獲得frg1雄性不育系的保持系，所述載體包含：育性恢復(fù)基因frg1，所述育性恢復(fù)基因frg1可以恢復(fù)frg1雄性不育系的雄性生育力；和花粉失活基因，所述花粉失活基因表達(dá)時(shí)，會(huì)干擾植株中含有該花粉失活基因的雄性配子的功能或形成，從而使得所述植株中產(chǎn)生的可育雄性配子都是不含所述載體的。

(b)將轉(zhuǎn)入上述載體后的保持系植株自交；和

(c)自交后即獲得含有所述載體的保持系種子和不含載體的frg1雄性不育系。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，其中步驟(a)也可以是向普通的植株中引入含有育性恢復(fù)基因frg1、花粉失活基因和篩選基因的載體，獲得含有所述載體的轉(zhuǎn)基因植株后，再與frg1雄性不育系雜交，經(jīng)過(guò)定向選育，獲得背景為frg1雄性不育系、并且含有所述載體的保持系植株。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖方法或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，其中所述的育性恢復(fù)基因的核苷酸序列選自下列組的序列之一：

(a)如seqidno：2、5、6、8、9、11、12、14、15、17、18、20、21、23、24、26、27或35所示的核苷酸序列；

(b)其編碼氨基酸序列如seqidno:4、7、10、13、16、19、22、25或28所示的核苷酸序列；

(c)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下能夠與(a)或(b)中所述序列的dna雜交的dna序列；或

(d)與(a)-(c)所述序列有至少80％(優(yōu)選為至少85％)序列相似性，且具有育性恢復(fù)功能的dna序列；或

(e)與(a)-(d)之任一所述序列互補(bǔ)的dna序列。

上述育性恢復(fù)基因frg1還可操作性的連有一個(gè)花粉特異表達(dá)的啟動(dòng)子，可以驅(qū)動(dòng)frg1基因在植物花粉中的表達(dá)。所述花粉特異表達(dá)的啟動(dòng)子選自由ms26、np1、msp1、pair1、pair2、zep1、mell、pss1、tdr、udt1、gamyb4、ptc1、api5、wda1、cyp704b2、ms26、ms22、dpw、mads3、osc6、rip1、csa、aid1、5126或ms45等育性調(diào)控基因的啟動(dòng)子構(gòu)成的組之一。更具體的，所述花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子的核苷酸序列如seqidno:1所示。上述育性恢復(fù)基因frg1還可操作性的連有一個(gè)終止子，所述終止子可以是已經(jīng)公開(kāi)的任一個(gè)基因的終止子，具體地，其中一個(gè)終止子的核苷酸序列如seqidno:3所示。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，所述的花粉失活基因包括但不限于barnase基因、淀粉酶基因、dam甲基化酶等。更具體的，所述花粉失活基因是玉米a淀粉酶基因zm-aa，優(yōu)選其核苷酸序列如seqidno:29所示。所述花粉失活基因與偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子相連。更具體地，所述偏好于雄性配子表達(dá)的啟動(dòng)子包括但不限于pg47啟動(dòng)子、zm13啟動(dòng)子等。

本發(fā)明上述的雄性不育系的繁殖或保持方法、保持系的生產(chǎn)方法或繁殖方法、種子的生產(chǎn)方法等中，其中所述的篩選基因包括但不限于抗生素抗性基因、除草劑抗性基因或熒光基因。具體地，所述篩選基因包括但不限于：氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、鏈霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺類抗性基因、草甘磷抗性基因、草丁膦抗性基因、bar基因、紅色熒光基因dsred、mcherry基因、青色熒光蛋白基因、黃色熒光蛋白基因、熒光素酶基因、綠色熒光蛋白基因等。

本發(fā)明還提供了一種花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子，其核苷酸序列如seqidno:1所示。將seqidno:1與報(bào)告基因gus相連，構(gòu)建載體轉(zhuǎn)化水稻和小麥，檢測(cè)分析轉(zhuǎn)基因植株中的gus表達(dá)活性和表達(dá)模式，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株的根、莖、葉和花進(jìn)行g(shù)us染色分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)gus基因在植物花粉中表達(dá)。說(shuō)明本發(fā)明所提供的seqidno:1是一個(gè)花粉特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。

本發(fā)明所提供的植物花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子，含有序列表中如seqidno:1所示的核苷酸序列，或包含與seqidno:1中所列核苷酸序列具有90％以上相似性的核苷酸序列，或包含來(lái)源于seqidno:1序列上的500個(gè)及500以上連續(xù)的核苷酸片段，并且可以驅(qū)動(dòng)與該啟動(dòng)子操作性連接的核苷酸序列在植物花粉中的表達(dá)。含有上述序列的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系以及宿主菌等均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。擴(kuò)增本發(fā)明所公開(kāi)的seqidno:1啟動(dòng)子的任一核苷酸片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明所述的“啟動(dòng)子”是指一種dna調(diào)控區(qū)域，其通常包含能指導(dǎo)rna聚合酶ii在特定編碼序列的合適轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)起始rna合成的tata盒。啟動(dòng)子還可包含其它識(shí)別序列，這些識(shí)別序列通常位于tata盒的上游或5’端，通常被稱為上游啟動(dòng)子元件，起調(diào)控轉(zhuǎn)錄效率的作用。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該知曉，雖然已經(jīng)鑒定了針對(duì)本發(fā)明公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)域的核苷酸序列，但是分離和鑒定處于本發(fā)明鑒定的特定啟動(dòng)子區(qū)域的tata盒上游區(qū)域的其它調(diào)控元件也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本文公開(kāi)的啟動(dòng)子區(qū)域通常被進(jìn)一步界定為包含上游調(diào)控元件，例如用于調(diào)控編碼序列的組織表達(dá)性和時(shí)間表達(dá)功能的那些元件、增強(qiáng)子等。以相同的方式，可以鑒定、分離出使得能在目標(biāo)組織(例如雄性組織)中進(jìn)行表達(dá)的啟動(dòng)子元件，將其與其它核心啟動(dòng)子一起使用，以驗(yàn)證雄性組織優(yōu)先的表達(dá)。核心啟動(dòng)子指起始轉(zhuǎn)錄所需的最小限度的序列，例如被稱為tata盒的序列，這是編碼蛋白質(zhì)的基因的啟動(dòng)子通常都具有的。因此，可選地，frg1基因的上游啟動(dòng)子可與其自身的或來(lái)自其它來(lái)源的核心啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)使用。

核心啟動(dòng)子可以是任何一種已知的核心啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35s或19s啟動(dòng)子(美國(guó)專利no.5,352,605)、泛素啟動(dòng)子(美國(guó)專利no.5,510,474)、in2核心啟動(dòng)子(美國(guó)專利no.5,364,780)或玄參花葉病毒啟動(dòng)子。

所述基因啟動(dòng)子的功能可以通過(guò)以下方法進(jìn)行分析：將啟動(dòng)子序列與報(bào)告基因可操作性連接，形成可轉(zhuǎn)化的載體，再將該載體轉(zhuǎn)入植株中，在獲得轉(zhuǎn)基因后代中，通過(guò)觀察報(bào)告基因在植物各個(gè)組織器官中的表達(dá)情況來(lái)確認(rèn)其表達(dá)特性；或者將上述載體亞克隆進(jìn)用于瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)的表達(dá)載體，通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)啟動(dòng)子或其調(diào)控區(qū)的功能。

用來(lái)測(cè)試啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)域功能的適當(dāng)表達(dá)載體的選擇將取決于宿主和將該表達(dá)載體引入宿主的方法，這類方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。對(duì)于真核生物，在載體中的區(qū)域包括控制轉(zhuǎn)錄起始和控制加工的區(qū)域。這些區(qū)域被可操作地連接到報(bào)告基因，所述報(bào)告基因包括yfp、uida、gus基因或熒光素酶。包含位于基因組片段中的推定調(diào)控區(qū)的表達(dá)載體可以被引入完整的組織，例如階段性花粉，或引入愈傷組織，以進(jìn)行功能驗(yàn)證。

此外，本發(fā)明的啟動(dòng)子還可與并非frg1基因的核苷酸序列相連，以表達(dá)其它異源核苷酸序列。本發(fā)明的啟動(dòng)子核苷酸序列及其片段和變體可與異源核苷酸序列一起組裝在一個(gè)表達(dá)盒中，用于在目的植株中表達(dá)，更具體地，在該植株的雄性器官中表達(dá)。所述表達(dá)盒有合適的限制性酶切位點(diǎn)，用于插入所述啟動(dòng)子和異源核苷酸序列。這些表達(dá)盒可用于對(duì)任何植株進(jìn)行遺傳操作，以獲得想要的相應(yīng)表型。

本發(fā)明所公開(kāi)的花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子，可用于驅(qū)動(dòng)下列異源核苷酸序列的表達(dá)，以使轉(zhuǎn)化的植株獲得雄性不育的表型，所述異源核苷酸序列可編碼促使碳水化合物降解的酶或修飾酶、淀粉酶、脫支酶和果膠酶，更具體的如barnase基因、玉米a淀粉酶基因、生長(zhǎng)素基因、rotb、細(xì)胞毒素基因、白喉毒素、dam甲基化酶，或是顯性的雄性不育基因。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明中所提到的可操作性地連接在本發(fā)明啟動(dòng)子下游的核苷酸序列，其中所述的“核苷酸序列”可以是操作性連接于本文所公開(kāi)的啟動(dòng)子之后的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因、結(jié)構(gòu)基因的反義基因、調(diào)節(jié)基因的反義基因或者能夠干擾內(nèi)源基因表達(dá)的小rna。

本發(fā)明還提供了一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子序列，所述轉(zhuǎn)錄終止子的核苷酸序列如seqidno:3所示，具有終止基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的功能。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)盒、載體或工程菌株，所述表達(dá)盒、載體或工程菌株中包含了本發(fā)明所提供的花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子seqidno:1。具體地，可以將本發(fā)明所提供的育性恢復(fù)基因frg1的核苷酸序列構(gòu)建到本發(fā)明所提供的啟動(dòng)子seqidno:1的下游，從而驅(qū)動(dòng)該育性基因在轉(zhuǎn)化受體植株中的表達(dá)。

本發(fā)明的所提供的花粉特異表達(dá)啟動(dòng)子可用于外源基因在花粉中的特異性表達(dá)，從而避免該外源基因在植物其他組織中持續(xù)表達(dá)所帶來(lái)的不利影響，還可以用于植物花粉生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的功能分析和鑒定；可用于雄性不育系和保持系的創(chuàng)建；并可應(yīng)用于花粉敗育實(shí)驗(yàn)中，從而避免由植物轉(zhuǎn)基因漂移或花粉逃逸所帶來(lái)的生物安全問(wèn)題，對(duì)植物雄性不育系和保持系的創(chuàng)造具有重要意義。

本發(fā)明所提供的frg1基因的核苷酸序列和啟動(dòng)子序列或表達(dá)盒可被插入載體、質(zhì)粒、酵母人工染色體、細(xì)菌人工染色體或其他適合轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞中的任何載體中。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞，尤其是用于克隆或儲(chǔ)存多核苷酸、或用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的細(xì)菌細(xì)胞，例如大腸桿菌、根瘤土壤桿菌和毛根土壤桿菌。當(dāng)宿主細(xì)胞是植物細(xì)胞時(shí)，表達(dá)盒或載體可插入至被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的基因組中。插入可以是定位的或隨機(jī)的插入。

本發(fā)明所述的將核苷酸序列、載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)入植株或引入植株或?qū)χ仓赀M(jìn)行轉(zhuǎn)化，均指通過(guò)常規(guī)的轉(zhuǎn)基因方法，將核苷酸序列、載體或表達(dá)盒轉(zhuǎn)入到受體細(xì)胞或受體植株中。植物生物技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何轉(zhuǎn)基因方法均可被用于將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化進(jìn)植物細(xì)胞中，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)化方法可包括直接和間接的轉(zhuǎn)化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導(dǎo)的dna攝入、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、使用基因槍導(dǎo)入、電穿孔、以及顯微注射。所述轉(zhuǎn)化方法也包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化方法等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明提供了一種育性恢復(fù)基因frg1及其啟動(dòng)子，及將該基因用于frg1雄性不育系的繁殖和保持的方法。本發(fā)明所提供的育性恢復(fù)基因、核雄性不育系的育性保持和不育系的繁殖方法，對(duì)作物的雜交育種生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，具有重大的生產(chǎn)推廣價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值，本發(fā)明提供的育性恢復(fù)基因還解決了小麥蘭州核雄性不育系或其等位不育系的繁殖和保持問(wèn)題，對(duì)于突破并改良現(xiàn)有的“三系”和“兩系”雜交技術(shù)具有重要意義。

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附圖說(shuō)明

圖1是eefrg1基因與小麥中同源基因的基因組dna序列比對(duì)。

圖2是eefrg1基因與小麥中同源基因的cds序列比對(duì)。

圖3是eefrg1基因與小麥中同源基因的蛋白序列比對(duì)。

圖4是eefrg1基因與近緣種中同源基因的基因組dna序列比對(duì)。

圖5是eefrg1基因與近緣種中同源基因的cds序列比對(duì)。

圖6是eefrg1基因與近緣種中同源基因的蛋白序列比對(duì)。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1、長(zhǎng)穗偃麥草frg1基因的克隆

小麥蘭州核雄性不育突變體是典型的單基因控制的隱性突變。4ags-ms雙端體異附加系是在蘭州核雄性不育突變體中附加了半條長(zhǎng)穗偃麥草的4ag染色體(4ags)(周寬基等，1996)，附加的4ags染色體能夠恢復(fù)突變體雄性不育的表型，表明長(zhǎng)穗偃麥草4ags染色體中含有育性恢復(fù)基因fertilityrestorationgene1(frg1)。

4ags-ms雙端體異附加系中4ags染色體的長(zhǎng)度比小麥所有染色體都顯著短，測(cè)量后估計(jì)其大小約為最長(zhǎng)小麥染色體的1/4，大概250mb左右。利用流式細(xì)胞儀分離長(zhǎng)穗偃麥草4ags染色體，采用二代和三代測(cè)序相結(jié)合的策略拼接4ags參考基因組。結(jié)合4ags-ms雙端體異附加系單核期花藥的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得了8個(gè)候選基因。

將8個(gè)候選基因的基因組dna序列構(gòu)建到pahc20載體上，利用基因槍法，轉(zhuǎn)化4ag-ms單體異附加系植株幼胚。對(duì)t0代轉(zhuǎn)基因植株中，不帶有4ag染色體的植株(即蘭州核不育純合突變背景)進(jìn)行花粉育性觀察，結(jié)果只有連有基因id為cuff.199的基因組dna序列的載體能夠恢復(fù)蘭州核不育突變體雄性不育的表型。因此，基因id為cuff.199所對(duì)應(yīng)的基因?yàn)殚L(zhǎng)穗偃麥草中的育性恢復(fù)基因(fertilityrestorationgene1，frg1)，其基因組dna序列如seqidno:2所示，cds序列如seqidno:35所示，蛋白序列如seqidno:4所示，啟動(dòng)子序列如seqidno:1所示，終止子序列如seqidno:3所示。

以4ags-ms雙端體異附加系dna為模板，擴(kuò)增frg1基因啟動(dòng)子2265bp，序列如seqidno:1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)in-fusion方法連入pahc20-gus載體，獲得pahc20-pfrg1-gus表達(dá)載體。

利用基因槍法將pahc20-pfrg1-gus質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小麥幼胚，獲得16株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的根、莖、葉和不同發(fā)育時(shí)期的花進(jìn)行g(shù)us染色分析，發(fā)現(xiàn)frg1基因啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)gus在小麥花粉中特異表達(dá)，說(shuō)明frg1基因啟動(dòng)子為花粉特異表達(dá)型啟動(dòng)子。

實(shí)施例2、eefrg1在小麥中的同源基因

利用eefrg1基因(seqidno:2)在iwgsc(internationalwheatgenomesequencingconsortium)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，找到兩個(gè)同源基因，命名為tafrg1-1和tafrg1-2，其基因組dna序列分別如seqidno:5和seqidno:8所示，根據(jù)eefrg1基因推定的cds序列分別如seqidno:6和seqidno:9所示，蛋白序列分別如seqidno:7和seqidno:10所示。

利用clustalomega，將tafrg1-1基因的基因組dna序列、cds序列和蛋白序列分別與eefrg1基因進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖1-3所示，tafrg1-1基因與eefrg1基因基因組dna序列一致性為88.5％，cds序列的一致性為95.0％，蛋白序列一致性為95.9％。

利用clustalomega，將tafrg1-2基因的基因組dna序列、cds序列和蛋白序列分別與eefrg1基因進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖1-3所示，tafrg1-2基因與eefrg1基因基因組dna序列一致性為88.9％，cds序列的一致性為95.2％，蛋白序列一致性為95.0％。

由于tafrg1-1基因和tafrg1-1基因與eefrg1基因蛋白序列同源性均達(dá)到95％以上，推測(cè)很可能具有與eefrg1基因類似的功能。為了證實(shí)這種推測(cè)，我們分別構(gòu)建了pahc20-peefrg1-gtafrg1-1-teefrg1和pahc20-peefrg1-gtafrg1-2-teefrg1載體，用eefrg1基因的啟動(dòng)子分別驅(qū)動(dòng)tafrg1-1基因和tafrg1-2基因表達(dá)。將pahc20-peefrg1-gtafrg1-1-teefrg1和pahc20-peefrg1-gtafrg1-2-teefrg1載體分別轉(zhuǎn)化4ag-ms單體異附加系植株幼胚，分別獲得22株和26株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，通過(guò)pcr鑒定分別發(fā)現(xiàn)11株和12株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株不帶有4ag染色體，但花粉均發(fā)育正常、表現(xiàn)為可育，表明tafrg1-1基因和tafrg1-2基因的核酸和蛋白序列的確具有與eefrg1基因類似的功能。

實(shí)施例3、eefrg1基因與烏拉爾圖小麥、粗山羊草、高粱、玉米、粟中的同源基因的序列比對(duì)

將eefrg1基因的蛋白序列在ncbi等數(shù)據(jù)庫(kù)中查找，獲得了烏拉爾圖小麥、粗山羊草、高粱、玉米、粟基因組中預(yù)測(cè)的同源蛋白，其中玉米中包含兩個(gè)eefrg1的同源基因，分別命名為zmfrg1-1和zmfrg1-2。其中，在烏拉爾圖小麥中該育性基因tufrg1的基因組dna序列如seqidno:11所示，cds序列如seqidno:12所示，蛋白序列如seqidno:13所示；在粗山羊草中該育性基因aetfrg1的基因組dna序列如seqidno:14所示，cds序列如seqidno:15所示，其蛋白序列如seqidno:16所示；在高粱中該育性基因sbfrg1的基因組dna序列如seqidno:17所示，cds序列如seqidno:18所示，其蛋白序列如seqidno:19所示；在玉米中存在兩個(gè)tafrg1基因的同源基因，分別命名為zmfrg1-1和zmfrg1-2，zmfrg1-1的基因組dna序列如seqidno:20所示，cds序列如seqidno:21所示，其蛋白序列如seqidno:22所示,zmfrg1-2的基因組dna序列如seqidno:23所示，cds序列如seqidno:24所示，其蛋白序列如seqidno:25所示；在粟中該育性基因sifrg1的基因組dna序列如seqidno:26所示，cds序列如seqidno:27所示，其蛋白序列如seqidno:28所示。

將eefrg1基因的蛋白序列分別與這些同源基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示來(lái)自不同植物的同源蛋白都具有非常相似的保守序列(圖4-圖6)。利用clustalomega進(jìn)行序列比對(duì)，eefrg1基因的蛋白序列與烏拉爾圖小麥、粗山羊草、高粱、粟基因組中預(yù)測(cè)的同源蛋白序列一致性分別為96.4％、95.5％、59.0％、60.9％、與玉米中兩個(gè)同源蛋白的序列一致性分別為58.1％和50.8％。上述結(jié)果表明該蛋白在植物花的雄性器官發(fā)育過(guò)程中生物學(xué)功能保守，起著非常重要的作用。

實(shí)施例4、eefrg1及其同源基因在新一代小麥雜交育種技術(shù)中的應(yīng)用

frg1及其同源基因可以用于新一代雜交育種技術(shù)，該技術(shù)的核心思想是：以frg1隱性核雄性不育突變體為轉(zhuǎn)化受體材料，通過(guò)將緊密連鎖的3個(gè)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化至不育突變體中，其中，育性恢復(fù)基因frg1可使轉(zhuǎn)化受體育性恢復(fù)，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，種子標(biāo)記基因可以用于轉(zhuǎn)基因種子和非轉(zhuǎn)基因種子的分揀，分揀出的非轉(zhuǎn)基因種子即為不育系，而轉(zhuǎn)基因種子用作保持系。通過(guò)保持系給不育系授粉雜交，可以在不育系上結(jié)實(shí)，由此繁殖不育系。而保持系通過(guò)自交可以源源不斷地得以繁殖。由于該技術(shù)利用生物技術(shù)生產(chǎn)非轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，解決了小麥等作物在雜交制種過(guò)程中面臨的瓶頸問(wèn)題，即三系法資源利用率低而兩系法中不育系育性不穩(wěn)定的問(wèn)題。

根據(jù)以上原理，發(fā)明人首先分別對(duì)表達(dá)載體內(nèi)的zmbt1-zmaa、frg1和mcherryw三個(gè)表達(dá)盒單獨(dú)進(jìn)行了小麥轉(zhuǎn)化，并進(jìn)一步對(duì)各個(gè)表達(dá)盒的功能進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明各個(gè)表達(dá)盒單獨(dú)轉(zhuǎn)化小麥時(shí)，都能夠工作良好，達(dá)到預(yù)期的設(shè)計(jì)效果。其中frg1表達(dá)盒中只要包含的是有功能的frg1基因即可，例如eefrg1,tafrg1-1,tafrg1-2,tufrg1,aetfrg1,sbfrg1,sifrg1,zmfrg1-1或zmfrg1-2等均可恢復(fù)frg1雄性不育突變體的育性。

進(jìn)一步,發(fā)明人通過(guò)裝配下述dna元件，構(gòu)建了pahc20-frg1-aa-mcherryw載體：

1)以pahc20載體為基礎(chǔ)；

2)frg1基因表達(dá)盒，有功能的frg1基因連接于eefrg1基因啟動(dòng)子(如seqidno:1)的下游、eefrg1基因終止子(如seqidno:3)的上游，frg1基因可以是eefrg1,tafrg1-1,tafrg1-2,tufrg1,aetfrg1,sbfrg1,sifrg1,zmfrg1-1或zmfrg1-2，序列如seqidno：2，seqidno：5，seqidno：8，seqidno：11，seqidno：14，seqidno：17，seqidno：20，seqidno：23，seqidno：26所示；

3)基因表達(dá)盒pg47：zmbt1-zmaa-in2-1，目標(biāo)基因?yàn)閦maa，轉(zhuǎn)運(yùn)肽為zmbt1，zmbt1-zmaa(其核苷酸序列如seqidno：29所示)的開(kāi)放讀碼框連接于啟動(dòng)子pg47(其核苷酸序列如seqidno：30所示)的下游、終止子in2-1(其核苷酸序列如seqidno：31所示)的上游。

4)基因表達(dá)盒camv35s增強(qiáng)子-ltp2：mcherryw-pinii，mcherryw基因(seqidno：32)的開(kāi)放讀碼框連接于camv35s增強(qiáng)子-ltp2啟動(dòng)子(seqidno：33)和pinii終止子(seqidno：34)之間，重組成mcherryw的基因表達(dá)盒(camv35s增強(qiáng)子-ltp2：mcherryw-pinii)；

利用基因槍法將質(zhì)粒pahc20-frg1-aa-mcherryw轉(zhuǎn)化4ag-ms單體異附加系植株幼胚，經(jīng)過(guò)篩選、分化、壯苗生根、pcr鑒定等過(guò)程，得到基因型為蘭州核不育位點(diǎn)純合突變、無(wú)長(zhǎng)穗偃麥草4ag染色體、且轉(zhuǎn)基因?yàn)閱慰截惖霓D(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株。

對(duì)上述植株進(jìn)行花粉活性檢測(cè)，在非轉(zhuǎn)基因植株中，不育花粉的比例小于2％，而轉(zhuǎn)基因植株中不育花粉的比例為50％左右，表明本發(fā)明所提供的載體能夠達(dá)到預(yù)期的花粉失活功能。

對(duì)植株所結(jié)t1代種子進(jìn)行熒光分離比例調(diào)查，結(jié)果表明這些種子均顯示1:1分離比，即攜帶外源基因的熒光種子和不攜帶外源基因的非熒光種子表現(xiàn)為1:1分離，表明本發(fā)明所提供的載體各元件作為整體表達(dá)良好，可以實(shí)現(xiàn)創(chuàng)制和繁殖不育系的目的。

sequencelisting

<110>未名興旺系統(tǒng)作物設(shè)計(jì)前沿實(shí)驗(yàn)室（北京）有限公司

北京大學(xué)

<120>雄性育性的保持方法及其應(yīng)用

<130>

<160>35

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2265

<212>dna

<213>長(zhǎng)穗偃麥草（elytrigiaelongata）

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<213>長(zhǎng)穗偃麥草（elytrigiaelongata）

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<213>長(zhǎng)穗偃麥草（elytrigiaelongata）

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<213>烏拉爾圖小麥（triticumurartu）

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